一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于电化学技术领域，涉及一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器及其制备方法和应用。

技术背景

由严重急性呼吸综合征引起的2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)正在全球范围内广泛传播，其具有传播速度快，潜伏期长等特点。因此，为了迅速发现病例及其接触者，迫切需要能够在短时间内对大量样本进行检测的快速、易于使用的诊断工具。现有的SARS-CoV-2检测方法主要是逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和血清中特异性抗体的检测。RT-PCR耗时、昂贵，而且需要训练有素的操作人员，因此无法进行快速筛查。对于血清中特异性抗体的检测，由于接种疫苗的个体中会产生特异性抗体而呈阳性，因此没有太大的临床意义。由于SARS-CoV-2的刺突蛋白(SP)能够与人血管紧张素转换酶受体结合进入靶细胞，因此，SP已成为抗原检测的重要标志物。

分子印迹电化学生物传感器将分子印迹技术与电化学传感技术相结合，采用分子印迹聚合物(MIP)对待测物进行特异性识别，可以增强电化学生物传感器的选择性。分子印迹电化学生物传感器具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，已被广泛应用于血清中多种标志物的检测，由于蛋白质具有复杂的构型构象，需要寻找一种合适的方法用于蛋白质的分子印迹。表面印迹法可以有效的减少包埋、且容易实现印迹分子的洗脱，是用于蛋白质印迹的有效方法。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器及其制备方法和应用。本发明采用PMB作为内置电化学氧化还原探针，利用SP和P[Bvim]Br之间的静电作用和印迹效应，当SP结合到分子印迹空腔或从空腔洗脱后，印迹空腔数量相应减少或增加，导致PMB的电流信号产生相应的变化。根据PMB电流信号降低率与SP浓度的对数线性相关，实现了对SP的特异性检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器，包括在AN电极表面依次修饰金纳米粒子(即AuNPs)，还原氧化石墨烯(即rGO)，掺杂聚1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐离子液体的聚亚甲基蓝(即PMB/P[Bvim]Br)，具有刺突蛋白(即SP)印迹空腔的聚离子液体印迹聚合物后，得到的MIP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN。

所述的一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，所述AN电极包括针灸针作为AN电极。

第二方面，本发明提供了所述的一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)取AN电极，打磨去除表面氧化层，分别用乙醇和超纯水超声清洗，依次置于氯金酸溶液中进行恒电位法沉积得到AuNPs/AN，置于氧化石墨烯溶液(即GO)中进行恒电位电化学还原得到rGO/AuNPs/AN，置于亚甲基蓝(即MB)与1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐离子液体混合的磷酸盐缓冲溶液(即[Bvim]Br)中，超声分散均匀，采用循环伏安法扫描，得到PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN，其中P[Bvim]Br代表聚1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐，PMB代表聚亚甲基蓝；

(2)将PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN置于含有刺突蛋白的溶液中孵育，在1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐离子液体缓冲溶液中采用循环伏安法扫描，形成的P[Bvim]Br作为印迹聚合物包埋刺突蛋白，得到P[Bvim]Br/SP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN，用含有甲醇的磷酸盐缓冲溶液洗脱刺突蛋白，得到MIP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN，其中MIP代表分子印迹聚合物。

所述的一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，所述步骤(1)中恒电位法沉积得到AuNPs/AN时的条件为：电位范围-0.4V～-0.8V，优选电位为-0.8V；沉积时间75～125s，优选沉积时间为100s；恒电位电化学还原得到rGO/AuNPs/AN时的条件为：电位范围-1.2V～-1.6V，优选电位为-1.5V；沉积时间480～720s，优选沉积时间为600s；所述循环伏安法扫描的条件为：电位–0.8～1.2V，扫描速率25～100mV s

所述的一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，所述步骤(1)中氯金酸溶液的浓度为1～5mM，优选氯金酸溶液的浓度为2.5mM；氧化石墨烯溶液的浓度为1～5mg mL

所述的一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，所述步骤(2)中在1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐离子液体缓冲溶液中采用循环伏安法扫描的条件为：电位–0.5～1.2V，扫描速率25～100mV s

所述的一种可用于检测新冠病毒刺突蛋白的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，所述步骤(2)中含有刺突蛋白的溶液的浓度为20～100μg mL

第三方面，本发明提供了所述的分子印迹微型电化学生物传感器在检测新冠病毒刺突蛋白中的应用。

第四方面，本发明提供了所述的分子印迹微型电化学生物传感器的检测方法，将分子印迹微型电化学生物传感器置于含有或不含有刺突蛋白的溶液中孵育时间10～60min，在–0.5～0V的电位范围内记录该传感器的方波伏安图，实现对SP的检测。

所述的检测方法，其特征在于，所述孵育时间为30min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用表面分子印迹法提高了识别效率；本发明采用1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐离子液体作为电化学聚合离子液体，使其具有较高稳定性、生物相容性和导电性，且制备过程厚度可控；本发明采用AuNPs、rGO纳米材料修饰电极，显著提高了电化学生物传感器的灵敏度。

本发明利用聚亚甲基蓝作为内置电化学信号探针，由于刺突蛋白和离子液体之间的静电作用和印迹效应，当刺突蛋白结合到分子印迹空腔或从空腔洗脱后，印迹空腔数量相应减少或增加，导致聚亚甲基蓝的电流信号产生相应的变化。根据聚亚甲基蓝电流信号降低率与新冠病毒刺突蛋白浓度的对数线性相关，实现了对新冠病毒刺突蛋白特异性检测。

附图说明

图1为实施例1中AN、AuNPs/AN、rGO/AuNPs/AN在含有5mM铁氰化钾/亚铁氰化钾的0.1M氯化钾溶液中的循环伏安图；

图2为实施例1中制备的PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN、P[Bvim]Br/SP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN、MIP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN以及MIP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN重新结合SP之后的方波伏安图；

图3为实施例1中P[Bvim]Br/SP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN的扫描电镜图；

图4为实施例1中MIP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN的扫描电镜图；

图5为实施例1中制备的分子印迹微型电化学生物传感器对含有不同浓度的SP溶液进行检测的方波伏安图，内插图为局部放大图；

图6为实施例1中制备的分子印迹微型电化学生物传感器用于对SP检测时，PMB峰电流的降低率(ΔI/I

图7为实施例1中制备的分子印迹微型电化学生物传感器的特异性结果；

图8为对比例1中制备的非分子印迹微型电化学生物传感器洗脱前、洗脱后和重新结合SP后的方波伏安图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：

一种可用于检测新冠病毒SP的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将AN打磨去除表面氧化层后，分别用乙醇和超纯水进行超声清洗，在2.5mM氯金酸溶液中采用–0.8V恒电位法沉积100s得到AuNPs/AN，在1mg mL

如图1所示，在AN上没有出现铁氰化钾/亚铁氰化钾的氧化还原峰，而AuNPs/AN出现一对明显的氧化还原峰，归因于AuNPs良好的导电性和较大的比表面积，与AuNPs/AN相比，铁氰化钾/亚铁氰化钾在rGO/AuNPs/AN上的氧化还原峰电流降低，归因于rGO的导电性与AuNPs相比变差。

(2)称取0.0186gMB和0.0053g[Bvim]Br溶于25mL 0.1M pH＝8.2磷酸盐缓冲溶液中，超声分散均匀，用循环伏安法在–0.8～1.2V的电位范围内以50mV s

如图2所示，PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN在–0.27V处出现了PMB的氧化峰，说明PMB是一种理想的电化学探针，本发明利用PMB电流信号的变化指示SP的浓度。

(3)将PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN在含有50μg mL

如图2所示，P[Bvim]Br/SP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN没有出现明显的氧化还原峰，归因于SP和P[Bvim]Br印迹聚合物的存在阻碍了PMB的电子传递过程。将模板分子SP洗脱后，形成的MIP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN在-0.27V处重新出现了PMB的氧化峰，表明SP从电极表面被洗脱后，形成了可用于电子传递的分子印迹空腔，MIP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN重新结合SP后，PMB的信号降低，归因于分子印迹空腔被重新占据。如图3和4所示，P[Bvim]Br/SP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN表面较为光滑，但当模板分子SP从电极表面洗脱后，电极表面明显变粗糙。

实施例2：

一种可用于检测新冠病毒SP的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)以不锈钢针灸针(AN)作为基底电极，将针灸针打磨、分别用乙醇和超纯水进行超声清洗，在1mM氯金酸溶液中采用–0.8V恒电位法沉积75s得到AuNPs/AN，在2mg mL

(2)称取0.0186gMB和0.0053g[Bvim]Br溶于25mL 0.1M pH＝8.2磷酸盐缓冲溶液中，超声分散均匀，用循环伏安法在–0.8～1.2V的电位范围内以20mV s

(3)将PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN在含有20μg mL

–0.5～1.2V的电位范围内以25mV s

实施例3：

一种可用于检测新冠病毒SP的分子印迹微型电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)以不锈钢针灸针(AN)作为基底电极，将针灸针打磨、分别用乙醇和超纯水进行超声清洗，在5mM氯金酸溶液中采用–0.8V恒电位法沉积125s得到AuNPs/AN，在5mg mL

(2)称取0.0186gMB和0.0053g[Bvim]Br溶于25mL 0.1M pH＝8.2磷酸盐缓冲溶液中，超声分散均匀，用循环伏安法在–0.8～1.2V的电位范围内以100mV s

(3)将PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN在含100μg mL

实施例4：

取实施例1制备好的分子印迹微型电化学生物传感器，在含有SP(0ng mL

制备好的分子印迹微型电化学生物传感器对SP检测时，峰电流降低率与浓度的对数呈线性关系。如图6所示，线性方程为ΔI/I

通过检测1μg mL

对比例1：

为进一步证明分子印迹微型电化学生物传感器的成功制备，我们另外制备了非分子印迹微型电化学生物传感器NIP/PMB/P[Bvim]Br/rGO/AuNPs/AN，其操作步骤与实施例一步骤(1)～(3)相同，只是步骤(3)中未加入模板分子SP。如图8所示，在洗脱前后以及重结合后，该电极均没有出现PMB的氧化峰，归因于没有形成有利于电子传递的印迹空腔，通过分子印迹微型电化学生物传感器与非分子印迹微型电化学生物传感器的对比，进一步证明分子印迹微型电化学生物传感器可用于准确检测SP。