肥胖人群多囊卵巢综合征诊断的细菌生物标志物

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肠道菌群标志物，及其在肥胖人群中多囊卵巢综合征诊断、患病风险预测或预后监测中的应用。

背景技术

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种常见的女性生殖内分泌代谢紊乱疾病，其临床表现为高雄激素血症、慢性无排卵和多囊卵巢，在育龄女性中的患病率可达6％到20％。PCOS是最常见的内分泌疾病之一，可引起育龄妇女不孕。诸多研究表明PCOS患者具有更高的代谢相关疾病风险，如胰岛素抵抗(IR)、2型糖尿病(T2DM)、血脂异常和心血管疾病。迄今为止，PCOS的病因尚不清楚，研究者推测多种因素如先天遗传、宫内环境、生活方式和肠道菌群的潜在改变，可能促进疾病的发生发展。

越来越多的证据表明，肠道细菌在肥胖、肥胖相关炎症和胰岛素抵抗中扮演重要角色。如上海交通大学赵立平教授发现短链脂肪酸(SCFA)产生菌可能会通过增加胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的产生来改善T2DM患者中的糖化血红蛋白(HbAlc)水平。共生菌Bacteroides thetaiotaomicron可以降低血浆谷氨酸浓度并减轻饮食诱导的小鼠体重增加和肥胖，且其丰度与减肥手术效率有关。近年来有关PCOS与肠道菌群的研究认为PCOS患者的细菌α多样性、Bacteroidaceae,Clostridiaceae,Erysipelotrichidae,Lachnospiraceae,Lactobacillaceae,Porphyromonadaceae,Prevotellaceae,Ruminococcaceae和Actinobacteria细菌的丰度降低。Qi等人发现PCOS患者肠道内Bacteroides vulgatus丰度显著增加而甘氨脱氧胆酸和牛磺熊脱氧胆酸量则降低。雄激素过多症与肠道微生物的失调相关，表明雄激素可能调节肠道菌群群落，暗示通过调控肠道菌群可能是治疗PCOS的潜在方法。例如，将PCOS女性患者的菌群移植给小鼠，可诱导小鼠出现类似PCOS的表型，而移植健康女性的肠道菌群则可以缓解小鼠的PCOS症状。

身体质量指数是国际上衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一个常用指标，BMI正常值在20至25之间，超过25为超重，30以上则属肥胖。PCOS患者存在IR及肠道菌群失调、慢性炎症状态,且肥胖患者会进一步加重。临床上，传统的PCOS诊断主要依靠月经情况、雄激素水平检测和卵巢B超检测。根据鹿特丹ESHRE/ASRM(2003)标准，须满足下述三项中的两项：月经稀发；临床或者生化雄激素过多症；双侧或单侧卵巢多囊样改变和/或体积增大。但上述方法诊断出的PCOS具有高度异质性，未能引入代谢异常的程度这一重要临床特征对PCOS患者进行亚群的分型。近期研究表明肠道菌群紊乱在PCOS疾病的发生发展中起着重要作用，但是有关PCOS与体重肥胖之间的研究仍相对较少，如高BMI的健康女性与高BMI的PCOS患者之间肠道菌群存在哪些差异特征，能否从肠道细菌层面对高BMI的健康女性进行PCOS风险评估仍有待进一步探讨。肠道细菌在体内的丰度变化有望为多囊卵巢综合征的表征或诊断提供新的路径。

因此,提供一组可用于检测多囊卵巢综合征的细菌标志物，可用于对肥胖人群多囊卵巢综合征患者的快速高效诊断。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提出了一种肥胖人群多囊卵巢综合征基因检测试剂盒及其制备方法和应用。

本发明一方面提供了一种的生物标志物,可用于肥胖人群中多囊卵巢综合征诊断、患病风险预测或预后监测。生物标志物为Erysipelotrichaceae UCG-003细菌。所述生物标志物还包含Collinsella，Barnesiella，Blautia，Ruminococcaceae_UCG.005、Escherichia.Shigella，Butyricicoccus，Agathobacter，Dorea，Lachnoclostridium，Lachnospira，Coprococcus_3，Faecalibacterium，Dialister，Anaerostipes，Paraprevotella，Ruminococcaceae_UCG.002，Sutterella，Romboutsia，Ruminococcus_1，Ruminococcus_torques_group，Christensenellaceae_R.7_group，Odoribacter，Subdoligranulum，Phascolarctobacterium，Eggerthella，Bilophila，Ruminococcus_gnavus_group和Parabacteroides细菌。

本发明另一方面提供了一种肥胖人群中多囊卵巢综合征诊断、患病风险预测或预后监测的试剂盒，该试剂盒包含检测所述生物标志物细菌含量的试剂。所述检测试剂选自PCR法、微阵列法、测序法或免疫法试剂。

本发明另一方面提供了检测生物标志物的试剂在制备肥胖人群中多囊卵巢综合征诊断、患病风险预测或预后监测试剂盒中的用途。

与现有技术相比，本发明专利具有以下有益的技术效果：对粪便进行研究从而揭示PCOS患者和健康人群的肠道细菌差异，可以准确的对PCOS进行患病风险评估及早期诊断。本发明基于对PCOS患者和健康人群肠道菌群的比较和分析，尤其比较高BMI的健康女性及高BMI的PCOS患者的菌群差异，结合高BMI的PCOS人群和高BMI的健康女性特征性细菌数据作为训练集，能够准确地对PCOS患者进行患病风险评估、早期诊断。该方法与目前常用的诊断方法相比，具有方便、快捷的特点。

本发明提出的PCOS相关的生物标记物对早期诊断是有价值的。第一，本发明的标记物具有较高的特异性和灵敏性，可以对高BMI的PCOS患者与高BMI的健康人具有较好的区分效果；第二，粪便的分析属于无创性，可增加患者的依从性。结合高通量测序手段筛选出的特征细菌类群，可以通过高通量测序手段或qPCR方法对特征细菌进行鉴定；第三，本发明的指示性细菌还可以用作对PCOS患者进行治疗监测的工具以检测对治疗的响应，以特征细菌的丰度情况指导治疗方案。

附图说明

从本发明的具体实施例的如下说明，上述内容和其他目的、特征和优点将变得清楚，如附图中所示。附图不一定是按比例的，而是强调示出本发明的各种实施例的原理。

图1为LC、OC、LP和OP四组间的菌群多样性比较。(A)α多样性；(B)β多样性。

图2为LC、OC、LP和OP四组间的菌群组成及结构比较。(A)细菌门水平；(B)细菌属水平。

图3为LC、OC、LP和OP四组间的LEfSe分析。

图4为基于随机森林算法对OC组和OP组构建的疾病模型(A)特征物种类群重要性排名；(B)基于特征值构建的ROC曲线。

图5为基于随机森林算法对LC组和LP组构建的疾病模型的特征物种类群重要性排名。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1.1样本收集

根据2003年鹿特丹标准，诊断患有PCOS的女性，应满足：(1)少排卵和/或无排卵；(2)具有雄激素过多症的临床和/或生化体征；(3)超声发现1个或2个卵巢中的多囊卵巢，≥12个直径2-9mm的卵泡，和/或卵巢体积≥10mL。所有招募的PCOS患者均为初诊患者，未接受PCOS相关治疗。共纳入41名健康女性，47名PCOS女性患者。根据BMI＝24为界将人群分为正常BMI(BMI<24)和高BMI(BMI≥24)组。因此正常BMI健康女性(LC)、高BMI健康女性(OC)、正常BMI的PCOS患者(LP)及高BMI的PCOS患者(OP)的人数分别为21、20、22和25人。

1.2DNA提取及16S rRNA基因测序

体检当天收集来自健康个体和PCOS患者的粪便样本并立即冷冻于-80℃。根据试剂盒说明，从大约200mg的粪便中提取DNA。对DNA模板进行16S rRNA基因扩增,正向扩增引物:5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3',反向扩增引物:5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′)。使用Qubit3.0对DNA文库进行质检并于Illumina仪器测序(Illumina，San Diego，CA，USA)。

1.3测序数据分析

使用Fastp软件(version 0.19.6)对原始测序数据的质量、长度进行修剪，去除Illumina接头。使用QIIME2(version 2019.4)处理和分析16S测序数据。使用cutadapt去除测序引物,使用Dada2进行降噪。使用Dada2软件获得代表序列及基于代表序列的物种丰度表格。使用q2-feature-classifier classify-sklearn对序列进行物种注释。

1.4统计分析

基于OTUs表格计算细菌α多样性shannon指数。对OTUs表格，基于Bray Curtis距离计算距离矩阵并绘制PCoA图。使用Kruskal-Wallis方法进行统计检验,使用Benjamini-Hochberg(B-H)FDR方法进行p值校正。线性判别分析效应大小(LEfSe)的LDA截止值为2，用于识别区分组间的差异细菌类群，从而找出具有统计学意义的生物标志物。使用randomForest R包中的Randomforest算法，以细菌分类或特征性OTU特征进行训练。整个数据集被分配成训练(80％)和测试(20％)数据集。在测试阶段，通过受试者工作特征曲线下面积(AUC)、敏感性和特异性等性能参数评估每个机器学习模型的预测性能。

实施例2

2.1细菌α和β多样性分析

如图1A所示，LC、OC、LP和OP四组中的细菌α多样性shannon指数在四组间无显著性差异(p>0.05)，尽管如此，OC组表现出较高的细菌多样性而OP组则表现出较低的细菌多样性。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析发现，四组的菌群结构比较相似，且PERMANNOVA分析表明差异并不显著(p>0.05)(图1B)。

2.2细菌菌群结构分析

如图2A所示，从细菌门水平来看，健康人及PCOS患者体内的Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria及Actinobacteria丰度占据主导。其中，OC组的Firmicutes平均丰度最低为约53％，而Bacteroidetes和Proteobacteria的平均丰度在四组中最高，而LP组这三个细菌门的丰度则与OC组恰好相反。从细菌属水平来看，健康人及PCOS患者体内的Bacteroides，Prevotella_9，Faecalibacterium及Roseburia的丰度占据主导(图2B)。

2.3细菌标志物分析

通过LEfSe对LC、OC、LP和OP四组间的特征性指示标志物进行分析发现，不同分组有其各自的指示性标志物。如Erysipelotrichaceae UCG-003为OP组的特征性标志物，LP组的特征性标志物有Agathobacter,Lactobacillaceae及Lactobacillus,LC组的特征性标志物有Blautia,Dorea,Eubacterium eligens group,Coprococcus_1,OC组的特征性细菌标志物有Ruminococcus_1,Parabacteroides merdae及Collinsella等22种类群。当以LDA值3.5为界时，仍可以看到Agathobacter,Blautia,Dorea及Ruminococcus_1等特征性细菌类群。以上结果表明，这些细菌类型可能可以作为疾病的重要指示微生物。

2.4细菌群落结构分析

为了筛选出能够区分OC和OP组的特征微生物类群，从而有助于疾病诊断，我们对OC和OP组的整个OTU类群通过随机森林算法进行特征重要性排名。基于平均降低Gini指数可以发现，Collinsella,Erysipelotrichaceae UCG_003,Bamesiella,Blautia,Ruminococcaceae UCG_005,Escherichia/Shigella和Butyricicoccus,Agathobacter和Dorea为模型中的最重要细菌类群(图4A)。以排名前30的重要特征构建的训练集模型，区分OC组和OP组的AUC为0.70(图4B)。同样地，我们也试图从细菌的角度去对LC和LP组通过随机森林构建模型以进行疾病诊断，基于平均降低Gini指数，我们筛选出Coprococcus_1,Lachnospiraceae UCG_010,Bifidobacterium,Alistipes及Streptococcus等重要的特征性细菌类群(图5)。因此，特征性细菌对OC和OP组具有很好的区分效果。

总之，基于随机森林和LEfSe分析发现，Collinsella,Erysipelotrichaceae UCG-003,Barnesiellaceae,Blautia,Ruminococcaceae UCG_005,Butyricicoccus细菌等的生物标志物组合可以作为高BMI女性是否患有PCOS或者预测对象是否患有PCOS的风险。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。