METTL14/miR-17-5p/MFN2轴的新用途

技术领域

本发明属于结肠癌技术领域，具体涉及一种METTL14/miR-17-5p/MFN2轴的新用途的新用途，尤其是METTL14、miR-17-5p和MFN2在制备结肠癌5-FU 耐药效果的检测试剂或试剂盒中的应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)严重威胁全人类生存和健康，其发病率居全球恶性肿瘤第3位，而死亡率高居第2位。虽然手术治疗是结直肠癌治疗的最佳手段，化疗仍然是晚期患者最重要的治疗手段。但是，肿瘤化疗耐药是制约结直肠癌患者治疗效果和生存预后的关键，也是治疗失败的最主要原因。目前肿瘤的化疗耐药机制尚未完全阐明，临床上仍缺乏有效的干预手段，如何有效逆转化疗耐药仍是一个急需解决的难题。以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为基础的化疗方案是晚期结直肠癌患者治疗的基石，研究结直肠癌5-FU化疗抵抗及其分子机制，是提高结直肠癌疗效的命门与关键。

近期研究表明，表观遗传改变是癌症的重要分子特征，可作为肿瘤的生物标记，用于诊断和预测治疗反应。其中m6A甲基化修饰调控结直肠癌化疗抵抗的具体过程和分子机制尚不明确。另外，近年来，国内外研究逐渐认识到线粒体稳态是细胞内一种重要的防御机制，通过线粒体生物合成、线粒体动力学(融合/分裂)、线粒体自噬等生物学过程，广泛参与肿瘤代谢重编程、耐药与复发等过程。但目前，m6A甲基化与线粒体稳态之间的“交互作用”仍无报道，因此极有必要研究m6A甲基化通过表观遗传修饰效应调控线粒体稳态的作用及机制，这或将成为结直肠癌化疗耐药研究的一个突破口。

发明内容

本发明的目的在于提供METTL14/miR-17-5p/MFN2轴在制备结肠癌5-FU耐药效果的检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

METTL14/miR-17-5p/MFN2轴在制备结肠癌5-FU耐药效果的检测试剂中的应用。

进一步的，METTL14/miR-17-5p/MFN2轴在制备结肠癌5-FU耐药效果的检测试剂盒中的应用。

优选的，所述METTL14/miR-17-5p/MFN2轴包括METTL14、miR-17-5p和 MFN2。

优选的，过表达METTL14降低miR-17-5p的表达，低表达miR-17-5p促进 MFN2过表达，形成METTL14/miR-17-5p/MFN2轴，进而使结直肠癌患者对5-FU 化疗更敏感。

本申请拟明确miR-17-5p对结直肠癌5-FU化疗抵抗的作用，进一步阐明 METTL14通过m6A甲基化修饰上调miR-17-5p表达的机制，探索miR-17-5p 通过促进MFN2表达调控线粒体稳态的分子网络，以miR-17-5p为“桥梁”连接 m6A甲基化与线粒体稳态失衡，旨在为结直肠癌化疗治疗提供新的研究思路，为确立METTL14/miR-17-5p/MFN2轴作为结直肠癌患者化疗耐药的治疗靶点提供新的科学依据。

本申请通过试验发现：在CRC中，METTL14下调并降低了m6A修饰水平，进而降低YTHDC2对pri-miR-17的识别和结合，增加了pri-miR-17mRNA的稳定性，促进了miR-17-5p的表达。过表达的miR-17-5p抑制MFN2，导致线粒体融合减少，线粒体裂变和线粒体自噬增强，最终诱导CRC中5-FU化疗药物抵抗。

因此，得出以下结论：

与只转染空载对照质粒相比，METTL14过表达时，结直肠癌患者对5-FU 敏感性更好。

与只转染对照抑制物相比，miR-17-5p低表达时，结直肠癌患者对5-FU敏感性更好。

与只转染空载对照质粒相比，MFN2过表达时，结直肠癌患者对5-FU敏感性更好。

与只转染空载对照质粒相比，过表达METTL14降低miR-17-5p的表达，低表达miR-17-5p促进MFN2过表达，形成METTL14/miR-17-5p/MFN2轴，进而使结直肠癌患者对5-FU化疗更敏感。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：在CRC中，METTL14下调并降低了m6A修饰水平，进而降低YTHDC2对pri-miR-17的识别和结合，增加了 pri-miR-17mRNA的稳定性，促进了miR-17-5p的表达。过表达的miR-17-5p抑制MFN2，导致线粒体融合减少，线粒体裂变和线粒体自噬增强，最终诱导CRC 中5-FU化疗药物抵抗，因此，可以通过检测结直肠癌患者与对照中的METTL14、 miR-17-5p或MFN2是相对过表达或者低表达，来判断患者对于5-FU化疗的耐药性、化疗抵抗力或者敏感性。

附图说明

图1是实施例1中miR-17-5p减少5-FU诱导的细胞凋亡，其中(A)miR-17-5p 过表达后HCT116细胞中的上调和下调基因；(B)miR-17-5p过表达的HCT116细胞的前20条KEGG通路富集和KEGG二级分类；(C)miR-17-5p在正常肠上皮细胞和CRC细胞系中的相对表达；(D)来自临床队列的43对CRC组织中miR-17-5p 的相对表达；(E)HCT116细胞中miR-17-5p的过表达和敲低效率；(F)5-FU处理后具有不同miR-17-5p表达水平的HCT116细胞的凋亡测定；(G)不同miR-17-5p 表达水平的HCT116细胞的5-FUIC50；(H)5-FU处理后具有不同miR-17-5p表达水平的HCT116细胞的EdU增殖测定；(I)异种移植裸鼠模型的5-FU干预流程； (J)稳定转染的miR-17-5pCRC细胞的过表达效率和6次5-FU处理后异种移植物的肿瘤大小；(K)5-FU治疗过程中肿瘤体积的变化；(L)不同组异种移植物的肿瘤重量；(M)两组Caspase7的H&E和免疫组化分析；(N)用5-FU处理的不同HCT116 细胞组中Caspase7、cleaved-Caspase7、BCL2和BAX蛋白表达水平的蛋白质印迹分析；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。误差线，SD；比例尺，(H) 中为400μm，(L)中为100μm；

图2是实施例1中miR-17-5p通过线粒体动力学和线粒体自噬减少5-FU诱导的细胞凋亡；(A)通过TargetScan、miRDB、miRWalk和StarBase等在线数据库以及RNA-seq预测miR-17-5p的靶基因；(B)GSE81005的基因集富集分析 (GSEA)表明“含有线粒体蛋白的复合物”、“线粒体包膜”在对5-FU具有不同敏感性的CRC细胞中起作用；HCT8/WT：HCT-8人CRC野生型细胞；HCT8/5-FU：其5-FU诱导的抗性细胞系；(C)MFN2在TCGACRC队列中的表达；(D)从GEPIA数据库分析MFN2的总体生存率；(E)对照细胞和miR-17-5p过表达细胞中线粒体的透射电子显微镜(TEM)图像；*，线粒体；#，溶酶体；&，自噬溶酶体；(F) 在共聚焦显微镜下使用或不使用Mdivi-1的对照HCT116细胞和miR-17-5p过表达细胞的线粒体形态；(G)具有不同miR-17-5p表达水平的HCT116细胞的mtDNA 拷贝数；(H)JC-1染色显示线粒体膜电位。红色荧光：JC-1聚集体；绿色荧光： JC-1单体；(I)溶酶体(LysoTrackerRed)和线粒体(MitoTrackerGreen)的共定位(黄色斑点)；黄色斑点表示含有线粒体的自溶酶体；(J)使用或不使用Mdivi-1的对照和miR-17-5p过表达HCT116细胞的细胞凋亡测定；(K)不同miR-17-5p表达水平HCT116细胞中LC3B、p62、FIS1和MFN2蛋白表达水平的蛋白质印迹分析； (L)基于TargetScan预测MFN2的3'UTR区域中的miR-17-5p结合位点；(M)将 miR-17-5p和编码野生型或突变型MFN23'-UTR区的荧光素酶载体共转染到 HCT116细胞中，测量相对荧光素酶活性；(N)Caspase7、cleaved-Caspase7、LC3B、 p62、BCL2、BAX、MFN2和DRP1的蛋白质印迹分析；*，P＜0.05；**，P＜0.01； ***，P＜0.001。误差线，SD；比例尺，(E)中500nm，(F)中10μm，(H)和(I)中400μm；

图3是实施例1中MFN2共表达促进CRC细胞的凋亡；(A,B)MFN2和 miR-17-5p的挽救实验：HCT116细胞中5-FU的IC50和AnnexinV-PE/7AAD凋亡；(C)拯救实验的MFN2、PARP、切割的PARP、BAX、Caspase7和 cleaved-Caspase7的蛋白质印迹分析；

图4是实施例1中METTL14在CRC组织中低表达；(A)METTL14在 TCGACRC队列以及GSE41657腺瘤和腺癌队列中的表达；(B)METTL14在来自临床队列的43对CRC组织中的相对表达；(C)GEPIA数据库中METTL14的总生存期和无病生存期分析。

图5是实施例1中METTL14促进5-FU诱导的细胞凋亡；(A)METTL14在 HCT116细胞中的过表达和敲低效率；(B)不同组HCT116细胞的5-FUIC50；(C)5-FU处理后不同METTL14表达水平的HCT116细胞的EdU增殖试验； (D)5-FU处理后具有不同METTL14表达水平的HCT116细胞的细胞凋亡测定； (E)用5-FU处理的不同METTL14表达水平的HCT116细胞中PARP、cleaved-PARP、Caspase7、cleaved-Caspase7、BCL2和BAX蛋白表达水平的蛋白质印迹分析；(F)稳定转染的METTL14CRC细胞的敲低效率；(G)裸鼠皮下植入肿瘤细胞；(H)6次5-FU治疗后异种移植物的肿瘤大小和重量；(I)5-FU治疗过程中肿瘤体积的变化；(J)两组Caspase7水平的H&E和免疫组化分析；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；误差线，SD；比例尺，(C)中400μm，(J)中100μm；

图6是实施例1中METTL14通过m6A修饰调节miR-17-5p的表达； (A)METTL14敲低或过表达后HCT116细胞中m6A水平的定量；(B)METTL14 敲低或过表达后pri-miR-17、pre-miR-17和miR-17-5p的相对表达；(C)SRAMP 数据库预测的pri-miR-17上可能的m6A修饰位点；(D)MeRIP和MeRIP-qPCR 分析证明pri-miR-17上的m6A修饰；(E)ActD处理后不同HCT116细胞组中 pri-miR-17水平的qPCR分析；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；误差线，SD；

图7是实施例1中METTL14敲低通过m6A-YTHDC2依赖性途径增强 pri-miR-17mRNA稳定性；(A)METTL14敲低后HCT116细胞中m6Awriter的 RT-PCR分析；(B)在转染YTHDC2和共转染si-METTL14/YTHDC2的HCT116 细胞中对YTHDC2进行蛋白质印迹分析；(C)转染YTHDC2和共转染 si-METTL14/YTHDC2的HCT116细胞中pri-miR-17和miR-17-5p的相对表达； (D)ActD处理后不同HCT116细胞组中pri-miR-17水平的RT-PCR分析；(E)构建了编码野生型或m6A序列突变的pri-miR-17的荧光素酶载体；(F)YTHDC2诱导 HCT116细胞中pri-miR-17的转录后抑制；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；误差线，SD；

图8是实施例1中METTL14敲低通过miR-17-5p/MFN2轴显著增强 CRC5-FU抗性；(A)CRC组织中METTL14和miR-17-5p表达水平与相关性(n＝30)； (B)正常肠上皮细胞和CRC细胞系中METTL14、miR-17-5p和MFN2表达水平的RT-PCR分析；(C,D)METTL14和miR-17-5p的挽救实验：HCT116细胞中5-FU 的IC50和AnnexinV-PE/7AAD凋亡；(E)挽救实验的LC3B、p62、BAX、BCL2、 Caspase7、cleaved-Caspase7、MFN2、FIS1、METTL14的蛋白质印迹分析； (F)miR-17-5p和对照载体(NC/miR-17-5p)或METTL14(METTL14/miR-17-5p)稳定共表达的细胞系的转染效率；(G)裸鼠皮下注射肿瘤细胞；(H,I)6次5-FU治疗后三组异种移植物的肿瘤大小和重量；(J)5-FU治疗过程中肿瘤体积的变化； (K)H&E，三组Caspase7和MFN2的免疫组织化学分析。*，P＜0.05；**，P＜0.01； ***，P＜0.001。误差线，SD。比例尺，100μmin(K)；

图9是实施例1中METTL14/miR-17-5p/MFN2轴在结直肠癌中诱导5-FU化学抗性的模型。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，以下采用的原料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

一、实施过程概述如下：

1.蛋白质印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)分析

使用抗AP METTL14、抗MFN2、抗FIS1、抗DRP1、抗BAX、抗BCL2 和抗Caspase7/cleaved-Caspase7(26158-1-AP、12186-1-AP、10956-1-AP、 12957-1-、50599-2-Ig、12789-1-AP、27155-1-AP；1:1000；Proteintech，美国)；抗LC3A/B和抗p62(306019、380612；1:1000；ZenBio，中国)；anti-PARP和 anti-cleaved-PARP(9542,5625；1:1000；CST,USA)；和抗YTHDC2(ab220160, 1:1000,Abcam,UK)抗体。上样对照是小鼠抗GAPDH单克隆抗体(60004-1-Ig； 1:10000；Proteintech)。

对于IHC分析，制备了厚度为4μm的连续肿瘤切片。然后，按照制造商的说明进行脱蜡和抗原修复。将切片与抗Caspase7/p20抗体(T40049S,1:200； PA6277S,1:100；Abmart)一起孵育。用DAB显色剂(ZSGB-BIO)显色并在显微镜下观察。

2.RNAm6A 定量

使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA。根据制造商的说明，使用m6A RNA 甲基化检测试剂盒(ab185912；Abcam，UK)进行总RNA m6A 定量。

3.RNA 免疫沉淀(RIP)和甲基化RNA 免疫沉淀(MeRIP)

根据制造商的方案，使用RNA 免疫沉淀(RIP)试剂盒和甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)试剂盒(BersinBio，中国)进行RIP及MeRIP测定。

4.瞬时转染及慢病毒稳定感染

特定的miR-17-5p模拟物、miR-17-5p抑制剂和METTL14特异性siRNA 由GenePharma(中国)合成。对于质粒构建，METTL14购自Vigenebio(China)。按照制造商的说明，使用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen，USA)转染细胞。以上显示在补充表S1中。

为了构建稳定过表达miR-17-5p的细胞系，将全长hsa-miR-17-5p (GeneChem，China)和空对照克隆到慢病毒载体系统(puro-miR-17-5p和 puro-NC)。根据制造商的说明将慢病毒转染到SW480细胞中。用嘌呤霉素(2 μg/ml；BioSharp，China)筛选Puro-miR-17-5p和puro-NC细胞。构建稳定过表达或敲低METTL14的细胞系，将METTL14(Obio，China)和shMETTL14 (Obio)克隆到慢病毒载体系统(neo-METTL14，neo-NC；neo-shMETTL14， neo-shNC)中。shMETTL14的序列与表1中所示的siMETTL14相同。转染慢病毒后，用G418(800μg/ml；BioSharp，中国)筛选这些细胞。为了获得 miR-17-5p/METTL14共表达细胞，将METTL14慢病毒感染过表达miR-17-5p 的CRC细胞系中，并用G418(800μg/mL；BioSharp)进行筛选。

5.细胞凋亡测定

将细胞以每孔2×10

6.IC50测定

将细胞以每孔5000个的浓度接种在96孔板中过夜，并用不同浓度的 5-FU处理48小时。用含有10μL CCK8(Meilunbio,China)和90μl培养基的混合物替换每个孔中的培养基。两小时后，使用酶标仪(Molecular Devices，USA) 在450nm的OD值下测量吸光度。使用GraphPad Prism 8(GraphPad Software, USA)计算半数最大抑制浓度(IC50)。

7.EdU增殖试验

将细胞以每孔8000个的浓度接种在96孔板中，孵育过夜并用5-FU(25 μM)处理48小时。根据EdU试剂盒制造商的说明(Ribobio，中国)进行EdU 染色。

8.RNA稳定性

将细胞以每孔2×10

9.线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的测定

使用DNA提取试剂盒(Accurate Biotechnology，China)提取总基因组DNA。然后将100ng DNA和线粒体编码的细胞色素c氧化酶-2(MT-CO2)的正向和反向引物(每个引物10μM)与TB Green Premix Ex Taq II(Takara)一起添加到反应中。通过使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达水平。使用GAPDH作为内源性对照基因计算每个样品的ΔCt值。引物显示在表2中。

表1 miRNA模拟物、抑制物和siRNA的序列

表2 RT-PCR的引物

二、实验结论

(1)miR-17-5p在结直肠癌中高表达，减少结直肠癌细胞凋亡，增加化疗抵抗

之前的研究报道了miR-17-5p在促进CRC增殖和转移中发挥致癌作用，但其如何影响化疗反应仍不清楚。本实施例对miR-17-5p(NCBI Gene ID:406952) 过表达的HCT116细胞进行了RNA测序(RNA-seq)，结果发现有385个基因上调， 169个基因下调(图1中A图)。在RNA-seq结果显示的前20条富集通路中，细胞生长和死亡以及抗肿瘤耐药是显著富集的通路，提示miR-17-5p在化疗耐药中起着至关重要的作用(图1中B图)。常用的结直肠癌细胞系的miR-17-5p表达量显著高于正常肠上皮细胞系(图1中C图)。

而来自临床样本的RT-PCR分析证实，与相邻正常黏膜组织相比miR-17-5p 在43个人CRC组织中过表达(图1中D图)。为了评估miR-17-5p在CRC细胞系中的生物学功能，本实施例使用miR-17-5p模拟物(miR-17-5p)和抑制剂对 HCT116细胞进行体外分析，过表达和敲低效率如图1中E图所示。

为了进一步确定miR-17-5p是否影响CRC细胞凋亡，采用流式细胞术研究了细胞凋亡。结果显示，在5-FU诱导下，miR-17-5p过表达降低了HCT116细胞的凋亡率，而敲低miR-17-5p则可增加HCT116的凋亡(图1中F图)。

用CCK-8法测定5-FU对亲本细胞系HCT-116和转染了模拟物或抑制剂的细胞系的IC50值。miR-17-5p过表达显著上调5-FU的IC50值，由21.22μM上调至26.37μM；而miR-17-5p敲低后IC50值降至9.24μM(图1中G图)。

对5-FU处理后的HCT116细胞进行EdU增殖实验表明，miR-17-5p过表达促进肿瘤增殖，而敲低则抑制其增殖(图1中H图)。

将稳定过表达miR-17-5p的结直肠癌细胞系SW480及其对照细胞以 5×10

这些结果表明，miR-17-5p在体内和体外均增强了CRC肿瘤生长，表明 miR-17-5p降低了CRC凋亡，促进了对5-FU抗性。相反，miR-17-5p低表达时，结直肠癌细胞对5-FU更敏感。因此，在在细胞水平证明了miR-17-5p低表达时，结直肠癌细胞对5-FU更敏感。因此，可以进一步通过制备试剂或者试剂盒来检测结直肠癌患者中的miR-17-5p是相对过表达或者低表达，来判断患者对于5-FU 化疗的耐药性、化疗抵抗力或者敏感性。

(2)miR-17-5p通过靶向MFN2调节线粒体动力学

为了深入了解miR-17-5p调控CRC 5-FU化疗耐药的机制，使用TargetScan、miRDB、miRWalk和StarBase在线数据库寻找miR-17-5p的潜在靶点，并将靶点与RNA-seq结果取交集。在所有已鉴定的基因中，44个被预测为miR-17-5p的靶基因(图2中A图)。结合基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA) 对已鉴定的靶基因进行生物学相关性评价。提示“线粒体蛋白内含复合物”和“线粒体包膜”对5-FU抗性的生物学功能有重要影响(图2中B图)。有趣的是，线粒体融合基因2(MFN2，NCIBGene ID:9927)被确定为44个靶基因之一(图2 中A图)，并已被报道在线粒体动力学中发挥关键作用。

本实施例使用TCGA数据库来评估MFN2 mRNA水平，发现MFN2在CRC 组织中的表达明显低于正常上皮组织(图2中C图)。GEPIA分析显示，较低的 MFN2水平与较低的生存率相关(图2中D图)。

为了进一步确定miR-17-5p与MFN2之间的关系，本实施例进行了以下实验。透射电镜观察线粒体和自噬小体显示，与对照组相比，miR-17-5p过表达组线粒体形态明显碎片化，这表明miR-17-5p增加了分裂，减少了线粒体融合(图2中 E图)。

同样，MitoTracker染色显示，miR-17-5p过表达组线粒体形状呈碎片状，粒状，提示miR-17-5p诱导线粒体分裂，抑制线粒体融合(图2中F图)。

mtDNA拷贝数的检测结果表明，miR-17-5p增加了线粒体裂变，而 i-miR-17-5p产生了相反的效果(图2中G图)。

本实施例用JC-1染色显示线粒体膜电位，单体JC-1发出绿色荧光，而聚合物发出红色荧光；绿色荧光的增加表明线粒体膜电位下降，这是细胞早期凋亡的标志。当本实施例使用5-FU刺激HCT116细胞时，miR-17-5p过表达可抑制JC-1 单体的形成。然而，动力学相关蛋白1(Dynamin-Related Protein 1,DRP1)抑制剂 Mdivi-1减弱了这种抑制作用(图2中H图)。

这些结果表明，miR-17-5p以线粒体分裂依赖性的方式减少了5-FU诱导的 CRC细胞凋亡。接下来，本实施例用分别用红色(MitoTracker Red)和绿色荧光探针(LysoTrackerGreen)显示线粒体和溶酶体，共聚焦显微镜下观察到含线粒体的自溶酶体(黄色)增加，但Mdivi-1削弱了线粒体自噬增强的作用(图2中I图)。用流式细胞术检测细胞凋亡时发现，miR-17-5p显著抑制HCT116细胞凋亡，而 Mdivi-1逆转其抗凋亡作用(图2中J图)。

WB结果显示，miR-17-5p过表达引起MFN2下调，而敲低则相反。此外，在miR-17-5p组中，线粒体蛋白LC3B的水平显著升高，而p62的水平显著降低，表明线粒体自噬体的形成加速(线粒体自噬过程中的一个事件)。此外，线粒体裂变蛋白(FIS1)在miR-17-5p组中也升高(图2中K图)。

根据TargetScan识别的MFN2中miR-17-5p结合位点，本实施例建立了 MFN2-WT和MFN2-MUT荧光素酶报告质粒(图2中L图)。双荧光素酶报告实验显示，在miR-17-5p存在下，MFN2-WT的荧光素酶活性降低，而MFN2-MUT 的荧光素酶活性没有改变(图2中M图)。

此外，与对照组相比，miR-17-5p显著下调促凋亡蛋白BAX、cleaved caspase7 的表达，上调抗凋亡蛋白BCL-2和自噬生物标志物LC3B的表达。

Mdivi-1联合miR-17-5p可降低DRP1的表达，增强MFN2的表达(图2中 N图)。

miR-17-5p和MFN2共表达的回复实验(图3中A图、B图和C图)显示， MFN2可以逆转miR-17-5p引起的细胞凋亡减少，和细胞凋亡相关蛋白PARP、 cleaved-PARP、BAX、Caspase7、cleaved-Caspase7表达的降低。

这些结果表明，mir-17-5p依赖性CRC5-Fu化疗抵抗部分是通过控制线粒体稳态介导的。MFN2过表达时，结直肠癌对5-FU敏感性更好。因此，可以进一步通过试剂或试剂盒检测结直肠癌患者中的MFN2是相对过表达或者低表达，来判断患者对于5-FU化疗的耐药性、化疗抵抗力或者敏感性。

(3)敲低METTL14可增强结直肠癌的化疗抵抗

m6A修饰在许多癌症研究中都有报道，而甲基转移酶14(METTL14， NCBIGene ID:57721)是其中最重要的调控蛋白之一。根据TCGA数据库和 GSE41657，METTL4在腺瘤中低水平表达，在结直肠癌中进一步降低，与结直肠癌进展同步(图4中A图)。同样，RT-PCR分析证实，与相邻正常黏膜组织相比，METTL14在43例人类CRC组织中表达水平较低(图4中B图)。此外，GEPIA显示，较低的METTL14表达与较短的总生存期和无病生存期相关(图4 中C图)。

为了研究METTL14表达水平对CRC细胞的影响，本实施例使用特异性 si-RNA成功敲除HCT116细胞中METTL14的表达，或使用携带METTL14的质粒过表达METTL14(图5中A图)。结果显示，过表达METTL4可显著降低 HCT116细胞5-FU的IC50值(28.18μM vs.21.83μM)，而敲除METTL4可提高 5-FU的IC50值(24.31μM vs.35.81μM)(图5中B图)。

接下来，本实施例通过EdU染色验证了METTL14过表达或敲低对HCT116 细胞增殖的影响。EdU结果显示过表达METTL14显著降低HCT116细胞的增殖 (图5中C图)。

此外，在5-FU诱导下，METTL14可提高HCT116细胞的凋亡率，而敲低 METTL14可显著抑制细胞凋亡率(图5中D图)。

WB结果显示，敲低METTL14可抑制凋亡相关蛋白BAX、cleaved-Caspase7 的表达，而增加抗凋亡相关蛋白BCL2的表达(图5中E图)。

接下来，本实施例用慢病毒构建了METTL14敲低的稳定转染细胞系(图5 中F图)，并进行了裸鼠皮下成瘤及5-FU敏感性的实验。结果表明，METTL14 敲低的SW480细胞与对照组相比，其肿瘤重量和生长曲线显示更大或更快(图 5中G图、H图、I图)。

此外，免疫组化结果显示，METTL14基因敲低导致异种移植瘤中Caspase7 染色明显减少(图5中J图)。

综上所述，这些结果表明METTL14在促进CRC5-FU化疗抵抗中的关键作用；METTL14过表达时，结直肠癌对5-FU敏感性更好。因此，可以进一步通过试剂或试剂盒检测结直肠癌患者中的METTL14是相对过表达或者低表达，来判断患者对于5-FU化疗的耐药性、化疗抵抗力或者敏感性。

(4)METTL14通过m6A修饰抑制miR-17-5p的表达

越来越多的证据表明，m6A在miRNA的发生和成熟中起着至关重要的作用。敲除METTL14的HCT116细胞m6A水平降低，而过表达METTL14的HCT116 细胞m6A水平更高(图6中A图)。为了研究METTL14在miR-17成熟中的作用，本实施例建立了METTL14敲低和过表达的细胞(图5中A图)。结果显示，METTL14抑制miR-17-5p、pre-miR-17和pri-miR-17的表达，而敲除METTL14 逆转了这些作用(图6中B图)。

接下来，本实施例在pri-miR-17中寻找m6Amotif，生物信息学分析结果支持pri-miR-17上存在高评分的m6A修饰位点，序列为GGACC(图6中C图)。 MeRIP结果同样也直接显示pri-miR-17的mRNA上存在m6A修饰(图6中D 图)。

为了探寻METTL14影响miR-17含量的机制，本实施例用放线菌素D (actinomycinD，ActD)抑制基因转录，验证其对pri-miR-17稳定性的影响。发现METTL14过表达降低了pri-miR-17的表达，显示出更差的mRNA稳定性；而敲低则相反(图6中E图)。

总之，这些数据表明，METTL14介导的pri-miR-17mRNA上的m6A修饰，有可能调控CRC细胞中pri-miR-17的表达，进一步揭示了METTL14过表达使得结直肠癌5-FU敏感性提高的内在机制。

(5)敲低METTL14可通过m6A-YTHDC2依赖的途径增强pri-mir–17 mRNA的稳定性

m6A修饰是pri-miRNA成熟、衰变、稳定和向细胞质转移的主要机制。表达分析显示，与阴性对照相比，METTL14敲低后，HCT116细胞中只有YTHDC2 和YTHDF3表达下调(图7中A图)。

WB实验显示METTL14在蛋白水平同样可以调控YTHDC2的表达(图7 中B图)。与单独转染YTHDC2相比，si-METTL14和YTHDC2共转染后， YTHDC2蛋白水平降低(图7中B图)，而pri-miR-17和miR-17-5p的表达水平升高(图7中C图)。

接下来，本实施例探讨了YTHDC2是否影响pri-miR-17的稳定性。在ActD 诱导下，si-METTL14和YTHDC2共转染HCT116细胞后，pri-miR-17mRNA水平显著升高，这种影响是依赖于时间的(图7中D图)。

此外，本实施例构建了pri-miR-17中m6A结合位点的突变序列用于后续的荧光素酶报告基因检测，该突变序列不能结合m6A修饰(图7中E图)。结果显示，YTHDC2质粒显著降低了转染野生型pri-miR-17序列的HCT116细胞的荧光素酶活性，而转染pri-miR-17突变型的HCT116细胞的荧光素酶活性没有明显改变(图7中F图)。这些结果表明，YTHDC2可以与pri-miR-17转录本相互作用，降低m6A修饰的pri-miR-17mRNA稳定性。

总之，这些结果表明，m6A“writer”METTL14增加了pri-miR-17的m6A修饰水平，然后被m6A“reader”YTHDC2识别，从而影响pri-miR-17的稳定性。但是否有其他分子参与这一过程还有待进一步研究。

(6)通过miR-17-5p/MFN2轴，METTL14缺失显著增强5-FU耐药性

为了验证METTL14在体内对miR-17-5p表达的影响，本实施例使用RT-PCR 检测了METTL14和miR-17-5p在30个CRC组织中的表达。

Spearman相关分析显示，METTL14和miR-17-5p水平呈负相关(图8中A 图)。

常用结直肠癌细胞系及正常肠上皮细胞系的RT-PCR分析结果同样显示了 miR-17-5p的高表达和METTL14和MFN2的低表达(图8中B图)。

与敲低METTL14增强IC50值和抑制凋亡率相比，miR-17-5p敲低显著挽救了5-FU刺激下HCT116细胞的IC50值和凋亡率(图8中C图)。

相应地，过表达METTL4会增加凋亡水平，而过表达miR-17-5p会抑制这种增加(图8中D图)。

此外，WB结果显示过表达或敲低METTL14导致线粒体动力蛋白质MFN2 和FIS1表达变化，以及凋亡相关蛋白Caspase7、cleavedCaspase7、BAX、BCL2 和自噬相关蛋白LC3B和p62的变化，而共转染miR-17-5p/i-miR-17-5p后可抵消METTL14的影响(图8中E图)。

在裸鼠皮下成瘤体内实验中，本实施例构建了miR-17-5p/METTL14共转染的稳转细胞株(图8中F图)。结果显示，在应用5-FU的过程中，miR-17-5p组肿瘤体积较大，而转染METTL14的则相反，对肿瘤质量和重量有抑制作用(图 8中G图、H图、I图)。约2周后，METTL14/miR-17-5p组的肿瘤生长较 NC/miR-17-5p组明显慢(图8中J图)。

此外，免疫组化分析异种移植物中Caspase7和MFN2的表达水平发现， miR-17-5p组的Caspase7和MFN2水平低于阴性对照组；然而，过表达METTL14 可以消除这些影响(图8中K图)。综上所述，这些结果揭示了metl14 /miR-17-5p/MFN2轴可能在CRC的5-FU耐药中发挥致癌作用。

因此，在CRC中，METTL14下调并降低了m6A修饰水平，进而降低YTHDC2 对pri-miR-17的识别和结合，增加了pri-miR-17mRNA的稳定性，促进了 miR-17-5p的表达。过表达的miR-17-5p抑制MFN2，导致线粒体融合减少，线粒体裂变和线粒体自噬增强，最终诱导CRC中5-FU化疗药物抵抗(图9)。

综上所述，过表达METTL14降低miR-17-5p的表达，低表达miR-17-5p促进 MFN2过表达，形成METTL14/miR-17-5p/MFN2轴，进而使结直肠癌对5-FU化疗更敏感。

本发明的上述实施例并不是对本发明保护范围的限定，本发明的实施方式不限于此，凡此种种根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，对本发明的方法做出的其它多种形式的修改、替换或变更，均应落在本发明的保护范围之内。