一种多糖包埋益生菌及其制备方法与药物

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种多糖包埋益生菌及其制备方法与药物。

背景技术

益生菌是一类能够改善宿主肠内微生物平衡，并对宿主产生正面效益的微生物。益生菌本身可以消化食物，产生有用的产物来破坏有害的微生物，弥补那些缺失的消化酶的功能，并且可以维持消化系统的pH。由于人体内的胃酸、胆汁及各种消化酶的不良影响，益生菌到达肠道时其存活率极大的降低。同时，益生菌只有在宿主肠道中稳定定殖，才可以进行菌群的繁殖，进而发挥自身的益生功效。因此，是否能保持较高的存活率且增强益生菌在肠道中定殖，是益生菌发挥益生作用的关键因素。

常用的保持益生菌活性的方法有微胶囊包埋法。微胶囊包埋法是将益生菌包埋在壁材溶液中，增强益生菌对外界不良环境的抵抗能力，控制益生菌的释放时间和释放位置，从而提高益生菌的存活率。但是微胶囊法也存在缺陷，比如在包埋过程和冷冻干燥过程中，菌粉或菌液容易附着到包埋层外壁，造成菌株原料的浪费和微生物污染。此外，目前对于提高益生菌在肠道中定殖的方法也极少报道。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种多糖包埋益生菌，该多糖包埋益生菌能够在肠道中具有良好的稳定性，在不损害益生菌固有生物学特性的情况下，可以有效地提升益生菌的贮藏稳定性，同时安全有效地增强益生菌在肠道中的存活率与增强其在肠道的定殖。

本发明的目的之二在于提供一种上述多糖包埋益生菌的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种含有上述多糖包埋益生菌的药物。

本申请可这样实现：

第一方面，本申请提供一种多糖包埋益生菌，该多糖包埋益生菌包括位于内层的益生菌、包覆于内层益生菌表面的金属-多酚网络结构层以及包覆于金属-多酚网络结构层表面的多糖层；

多糖包埋益生菌的制备包括：将益生菌的悬浮液与金属溶液混合，以将金属离子通过静电吸附作用在益生菌的表面“锚定”，得到益生菌-金属混合物；

将益生菌-金属混合物与多酚原料混合以在益生菌表面形成金属-多酚网络结构层，得到益生菌-金属-多酚复合物；

将益生菌-金属-多酚复合物与多糖原料混合以在益生菌-金属-多酚复合物的表面形成多糖层，得到多糖包埋益生菌；

益生菌的悬浮液中益生菌的活菌数为0.8×10

金属溶液的浓度为0.075-0.75 mg/mL；

益生菌的悬浮液与金属溶液的体积比为100-200:800-900。

在可选的实施方式中，胃肠道疾病包括结肠炎。

在可选的实施方式中，多糖层对应的多糖原料包括β-葡聚糖、岩藻多糖、银线莲多糖、低酯果胶、银耳多糖、茯苓多糖、壳聚糖、淀粉和纤维素中的至少一种。

在可选的实施方式中，益生菌包括大肠埃希菌 Nissle1917（以下简称“EcN”）、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌和唾液乳杆菌中的至少一种。

在可选的实施方式中，金属-多酚网络结构层对应的金属离子包括Fe

在可选的实施方式中，金属-多酚网络结构层对应的多酚原料包括黄酮类、单宁类以及酚酸类中的至少一种。

在可选的实施方式中，金属-多酚网络结构层对应的多酚原料为单宁酸。

第二方面，本申请提供如前述实施方式任一项的多糖包埋益生菌的制备方法，包括以下步骤：按预设位置于内层益生菌的表面依次包覆金属-多酚网络结构层以及多糖层。

在可选的实施方式中，混合采用涡旋方式进行。

在可选的实施方式中，涡旋时间为40-80 s。

在可选的实施方式中，多酚原料在益生菌-金属-多酚复合物中的浓度为0.25-0.4mg/mL。

在可选的实施方式中，益生菌-金属混合物与多酚原料的混合采用涡旋方式进行。

在可选的实施方式中，涡旋时间为40-80 s。

在可选的实施方式中，每毫升益生菌-金属-多酚复合物对应使用0.01-0.1 mg的多糖原料。

在可选的实施方式中，益生菌-金属-多酚复合物与多糖物质的混合采用涡旋方式进行。

在可选的实施方式中，涡旋时间为40-80 s。

在可选的实施方式中，得到多糖包埋益生菌后，还包括：除去多余的多糖-金属-多酚复合物。

在可选的实施方式中，除去多余的多糖-金属-多酚复合物通过离心方式实现。

在可选的实施方式中，离心速度为3000-7000 rpm，离心时间为5-10 min。

第三方面，本申请提供一种药物，其含有前述实施方式任一项的多糖包埋益生菌。

在可选的实施方式中，药物为治疗胃肠道疾病的药物。

在可选的实施方式中，药物为治疗结肠炎的药物。

本申请的有益效果包括：

本申请首先将金属阳离子与表面带负电的益生菌进行混合，将阳离子“锚定”在益生菌的表面，随后加入多酚，通过多酚与金属离子之间的螯合作用，在益生菌表面形成金属-多酚网络结构。该网络结构具有普遍的黏附作用，可以沉降或者黏附于多种物质的表面(如细胞或是细菌)。由于多酚具有较多的羟基且具有较高的粘附作用，可通过氢键作用将多糖吸附到其表面形成多糖-金属-多酚复合结构，并将益生菌进行包裹。由于位于最外层的多糖在上消化道不会被分解，而会在大肠内被肠道菌群分解。因此，通过设置上述结构的多糖包埋益生菌，可保护益生菌在胃部以及小肠保持完整并到达大肠，最外层多糖在大肠处被肠道菌群分解，暴露出金属-多酚网络结构，黏附于大肠内壁，使得益生菌能持续在大肠发挥作用。也即，该方法能够保护益生菌在上消化道不被破坏，一直到达指定的作用部位，并增强其在指定作用部位的定殖。此外，多糖既可以作为物理屏障保护益生菌免受消化道的伤害，同时多糖也是益生元，起到益生的作用，可以协同益生菌发挥生物活性，整体提升体系的治疗效果。

相应的多糖包埋益生菌在肠道中具有良好的稳定性，在不损害益生菌固有生物学特性的情况下，可以有效提升益生菌的贮藏稳定性，同时安全有效地增强益生菌在肠道中的存活率与增强其在肠道的定殖，具有抗胃酸和/或抗胆盐的效果，从而可用于制备治疗胃肠道疾病的药物，尤其是用于制备治疗结肠炎的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅展示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1和图2分别为试验例1中EcN与β-葡聚糖包埋EcN的扫描电镜图；

图3和图4分别为试验例1中EcN与β-葡聚糖包埋EcN的透射电镜图；

图5为试验例1中β-葡聚糖、EcN以及β-葡聚糖包埋EcN的激光共聚焦图；

图6为试验例2中EcN及银线莲多糖包埋EcN的倒置荧光显微镜图；

图7为试验例3中EcN、金属-酚醛结构层包埋EcN以及β-葡聚糖包埋EcN在模拟胃液中的保护效果结果图；

图8为试验例3中EcN、金属-酚醛结构层包埋EcN以及β-葡聚糖包埋EcN在模拟胆汁中的保护效果结果图；

图9为试验例4中EcN以及β-葡聚糖包埋EcN在肠道滞留荧光强度结果示意图；

图10为试验例5中EcN以及β-葡聚糖包埋EcN的贮藏稳定性结果图；

图11为试验例6中β-葡聚糖包埋EcN以及羧甲基改性β-葡聚糖包埋EcN在模拟胃液中的保护效果结果图；

图12为试验例6中唾液乳杆菌以及岩藻多糖包埋唾液乳杆菌在模拟胃液中的保护效果结果图；

图13为试验例6中植物乳杆菌以及银线莲多糖包埋植物乳杆菌在模拟胃液中的保护效果结果图；

图14为试验例7中不同浓度下的单宁酸对应形成的金属-多酚网络的粒径结果图；

图15为试验例8中结肠炎小鼠灌胃7天期间体重变化图；

图16为试验例8中结肠炎小鼠灌胃7天后的脾脏指数图；

图17为试验例8中结肠炎小鼠灌胃7天后的结肠长度图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本申请提供的多糖包埋益生菌及其制备方法与药物进行具体说明。

本申请提出一种多糖包埋益生菌，该多糖包埋益生菌包括位于内层的益生菌、包覆于内层益生菌表面的金属-多酚网络结构层以及包覆于金属-多酚网络结构层表面的多糖层。该多糖包埋益生菌用于制备治疗胃肠道疾病的药物。

作为参考地，上述多糖层对应的多糖原料例如可包括β-葡聚糖、岩藻多糖、银线莲多糖、低酯果胶、银耳多糖、茯苓多糖、壳聚糖、淀粉和纤维素中的至少一种。

在一些优选的实施方式中，β-葡聚糖为羧甲基化β-葡聚糖。

示例性地，羧甲基化β-葡聚糖的制备可参照：将β-葡聚糖溶解于50 mL异丙醇中，室温搅拌30 min；加入10 mL NaOH溶液，室温搅拌1 h；随后边搅拌边缓慢的加入一定量的氯乙酸，水浴锅反应4 h。反应结束，调节溶液pH值至7，透析，冻干得到羧甲基化的β-葡聚糖。

此外，羧甲基化β-葡聚糖的制备还可参照其它的现有技术，在此不对其进行过多限定。

需说明的是，羧甲基化β-葡聚糖较β-葡聚糖具有更高的水溶性与生物活性。

承上，本申请最外层以多糖为壁材，可以保证益生菌在上消化道不被降解，使得益生菌能以完整的形态进入作用部位。多糖为壁材赋予整个体系良好的抗胃酸与抗胆盐的能力。需强调的是，在没有多糖的情况下，仅仅由金属-酚醛网络结构保护益生菌是无法抵抗胃酸的伤害的。多糖既可以作为物理屏障保护益生菌免受消化道的伤害，同时多糖也是益生元，起到益生的作用，可以协同益生菌发挥生物活性，整体提升体系的治疗效果。值得说明的是，本申请多糖所具有的上述效果为其他类型壁材无法达到的。

作为参考地，上述益生菌例如可包括EcN、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌和唾液乳杆菌中的至少一种。

金属-多酚网络结构层对应的金属离子可包括Fe

需说明的是，不能以Fe

本申请中，金属-多酚网络结构层对应的多酚原料可包括黄酮类、单宁类以及酚酸类中的至少一种。优选地，金属-多酚网络结构层对应的多酚原料为单宁酸。

需说明的是，大部分益生菌在经口摄入后，受胃酸pH的影响（益生菌对胃酸比较敏感），在低pH条件下益生菌会失去活性，进而无法以一定数量级到达大肠或特定的作用部位。

本申请首先将金属阳离子与表面带负电的益生菌进行混合，将阳离子“锚定”在益生菌的表面，随后加入多酚，通过多酚与金属离子之间的螯合作用，在益生菌表面形成金属-多酚网络结构。该网络结构具有普遍的黏附作用，可以沉降或者黏附于多种物质的表面(如细胞或是细菌)。由于多酚具有较多羟基且具有较高的粘附作用，可通过氢键作用将多糖吸附到其表面形成多糖-金属-多酚复合结构，并将益生菌进行包裹。由于位于最外层的多糖在上消化道不会被分解，其需要在大肠内被肠道菌群分解。因此，通过设置上述结构的多糖包埋益生菌，可保护益生菌在胃部以及小肠保持完整并到达大肠，最外层多糖在大肠处被肠道菌群分解，暴露出金属-多酚网络结构，黏附于大肠内壁，使得益生菌能持续在大肠发挥作用。也即，该方法能够保护益生菌在上消化道不被破坏，一直到达指定的作用部位，并增强其在指定作用部位的定殖。也即，上述整个体系进入结肠部位后，多糖层被肠道菌群分解，随后暴露出金属-多酚网络层，由于多酚结构具有普遍的黏附作用，可以增加益生菌在肠道的滞留，提升益生菌在肠道的存留时间，使得益生菌可以持久的发挥作用与功效。

承上，本申请提供的多糖包埋益生菌在肠道中具有良好的稳定性，在不损害益生菌固有生物学特性的情况下，可以有效地提升益生菌的贮藏稳定性，同时安全有效地增强益生菌在肠道中的存活率与增强其在肠道的定殖。

相应的，本申请还提供了上述多糖包埋益生菌的制备方法，例如可包括以下步骤：按预设位置于内层的益生菌的表面依次包覆金属-多酚网络结构层以及多糖层。

也即可理解为，金属-多酚网络结构和多糖按由内至外的顺序在益生菌的表面层层自主装。

可参考地，制备方法可包括：

S1：将益生菌的悬浮液与金属溶液混合，以将金属离子通过静电吸附作用在所述益生菌的表面“锚定”，得到益生菌-金属混合物。

上述益生菌的悬浮液中益生菌的活菌数约为0.8×10

在一些实施方式中，金属溶液的浓度可以为0.075-0.75 mg/mL，如0.075 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3 mg/mL、0.35 mg/mL、0.4 mg/mL、0.45mg/mL、0.5 mg/mL、0.55 mg/mL、0.6 mg/mL、0.65 mg/mL、0.7 mg/mL或0.75 mg/mL等，也可以为0.075-0.75 mg/mL范围内的其它任意值，优选为0.075-0.2 mg/mL。

益生菌的悬浮液与金属溶液的体积比可以为100-200:800-900，如100:800、100:850、100:900、150:800、150:850、150:900、200:800、200:850或200:900等，也可以为100-200:800-900范围内的其它任意值。

需说明的是，若金属原料的用量过少，容易导致金属网络结构松散，无法起到良好的保护作用；若金属原料的用量过多，容易导致金属网络结构紧缩，挤压内部益生菌。

上述混合例如可采用涡旋方式进行，涡旋时间可以为40-80 s，如40 s、50 s、60s、70 s或80 s等，也可以为40-80 s范围内的其它任意值。

S2：将益生菌-金属混合物与多酚原料混合以在益生菌的表面形成金属-多酚网络结构层，得到益生菌-金属-多酚复合物。

作为参考地，多酚原料在益生菌-金属-多酚复合物中的浓度为0.25-0.4 mg/mL，如0.25 mg/mL、0.3 mg/mL、0.35 mg/mL或0.4 mg/mL等，也可以为0.25-0.4 mg/mL范围内的其它任意值。

若多酚原料在益生菌-金属-多酚复合物中的浓度低于0.25 mg/mL，容易导致金属-多酚网络结构松散，无法对益生菌进行完整的包埋；若多酚原料在益生菌-金属-多酚复合物中的浓度高于0.4 mg/mL，容易导致多酚原料的沉积。

示例性地，上述益生菌-金属混合物与多酚原料的混合可采用涡旋形式，涡旋时间可以为40-80 s（如40 s、50 s、60 s、70 s或80 s等）。

S3：将益生菌-金属-多酚复合物与多糖原料混合以在益生菌-金属-多酚复合物的表面形成多糖层，得到多糖包埋的益生菌。

可参考地，每毫升益生菌-金属-多酚复合物可对应使用0.01-0.1 mg（如0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.07 mg/mL、0.08 mg/mL、0.09 mg/mL或0.1 mg/mL等，也可以为0.01-0.1 mg/mL范围内的其它任意值）的多糖原料。

若多糖溶液的浓度低于0.01 mg/mL，容易导致对益生菌的包埋不完全；若多糖溶液的浓度高于0.1 mg/mL，容易导致过多的沉积在益生菌表面，限制益生菌生长且造成原料的浪费。

上述益生菌-金属-多酚复合物与多糖原料之间的混合可采用涡旋方式进行，涡旋时间可以为40-80 s。

进一步地，得到多糖包埋益生菌后，还包括：除去多余的多糖-金属-多酚复合物，如可通过离心的方式去除。

示例性地，离心速度可以为3000-7000 rpm，如3000 rpm、4000 rpm、5000 rpm、6000 rpm或7000 rpm等，也可以为3000-7000 rpm范围内的其它任意值。

离心时间可以为5-10 min，如5 min、6 min、7 min、8 min、9 min或10 min等，也可以为5-10 min范围内的其它任意值。

承上，上述制备方法操作简单，反应条件温和，易于工业化生产。该方法可有效提高益生菌抵抗不良环境影响的能力，并使其能以较高的活菌数到达并定殖于特定部位（如结肠）进而发挥益生作用。

此外，本申请还提供了一种药物，其制备原料中含有上述多糖包埋益生菌。

作为参考地，上述药物为治疗胃肠道疾病的药物。

在一些优选的实施方式中，上述药物为治疗结肠炎的药物。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种多糖包埋益生菌，其经以下方法制备得到：

步骤（1）：将0.1 mg FeCl

步骤（2）：取0.4 mg的单宁酸加入上述益生菌-金属混合物中，涡旋60 s，以在益生菌的表面形成金属-多酚网络结构层，得到益生菌-金属-多酚复合物；

步骤（3）：取0.08 mg β-葡聚糖加入上述益生菌-金属-多酚复合物中，涡旋60 s，以在益生菌-金属-多酚复合物的表面形成多糖层，得到多糖包埋益生菌；

步骤（4）：用PBS洗涤2次，离心，去除多余的多糖-金属-多酚复合物，离心速度为7000 rpm，离心时间为5 min，获得由β-葡聚糖包埋的EcN。

实施例2

本实施例提供了一种多糖包埋益生菌，其经以下方法制备得到：

步骤（1）：将0.3 mg FeCl

步骤（2）：取0.3 mg的单宁酸加入上述益生菌-金属混合物中，涡旋60 s，以在益生菌的表面形成金属-多酚网络结构，得到益生菌-金属-多酚复合物；

步骤（3）：取0.02 mg β-葡聚糖加入上述益生菌-金属-多酚复合物中，涡旋60 s，以在益生菌-金属-多酚复合物的表面形成多糖层，得到多糖包埋益生菌；

步骤（4）：用PBS洗涤2次，离心，去除多余的多糖-金属-多酚复合物，离心速度为3000 rpm，离心时间为10 min，获得由β-葡聚糖包埋的EcN。

实施例3

本实施例提供了一种多糖包埋益生菌，其经以下方法制备得到：

步骤（1）：将3 mg FeCl

步骤（2）：取0.25 mg的单宁酸加入上述益生菌-金属混合物中，涡旋60 s，以在益生菌的表面形成金属-多酚网络结构层，得到益生菌-金属-多酚复合物；

步骤（3）：取0.04 mg β-葡聚糖加入上述益生菌-金属-多酚复合物中，涡旋60 s，以在益生菌-金属-多酚复合物的表面形成多糖层，得到多糖包埋益生菌；

步骤（4）：用PBS洗涤2次，离心，去除多余的多糖-金属-多酚复合物，离心速度为4000 rpm，离心时间为7.5 min，获得由β-葡聚糖包埋的EcN。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：多糖为羧甲基化β-葡聚糖。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：多糖为岩藻多糖，益生菌为唾液乳杆菌。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于：多糖为银线莲多糖，益生菌为植物乳杆菌。

实施例7

本实施例与实施例1的区别在于：多糖为银线莲多糖，益生菌为EcN。

实施例8

本实施例与实施例1的区别在于：多糖为低酯果胶。

实施例9

本实施例与实施例1的区别在于：多糖为银耳多糖和茯苓多糖的混合物（质量比为1:1）。

实施例10

本实施例与实施例1的区别在于：多糖为壳聚糖、淀粉和纤维素的混合物（质量比约为1:1:1）。

实施例11

本实施例与实施例1的区别在于：益生菌为罗伊氏乳杆菌。

实施例12

本实施例与实施例1的区别在于：益生菌为鼠李糖乳杆菌。

实施例13

本实施例与实施例1的区别在于：益生菌为双歧杆菌与植物乳杆菌的混合物（质量比为1:1）。

实施例14

本实施例与实施例1的区别在于：金属离子为Ti

试验例1

以实施例1为例，对β-葡聚糖包埋EcN进行以下测试：

①、对其进行扫描电镜观测，其结果如图1和图2所示。

其中，图1为EcN的扫描电镜图，图2为β-葡聚糖包埋EcN的扫描电镜图。

②、对其进行透射电镜观测，其结果如图3和图4所示。

其中，图3为EcN的透射电镜图，图4为β-葡聚糖包埋EcN的透射电镜图。

③、对其进行共聚焦扫描，其结果如图5所示。

其中，(a) 为β-葡聚糖的激光共聚焦图，(b) 为EcN的激光共聚焦图，(c) 为β-葡聚糖包埋EcN的激光共聚焦图。

结合图1至图5可以看出：β-葡聚糖成功包埋住了EcN。

试验例2

对实施例7所得的银线莲多糖包埋EcN进行倒置荧光显微观测。荧光接枝过程如下：在加入益生菌（EcN）-金属-多酚复合物前，先对银线莲的酸性多糖按以下方式进行荧光接枝：将银线莲的酸性多糖溶解于MES缓冲溶液中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与荧光胺，三者于黑暗中搅拌反应12 h。透析，冻干，得到荧光接枝的银线莲多糖。其结果如图6所示。

其中，a为EcN倒置荧光显微镜图，b为银线莲多糖包埋EcN的倒置荧光显微镜图。

由图6可以看出：银线莲多糖成功包埋住了EcN。

试验例3

将实施例1制备的β-葡聚糖包埋EcN进行体外抗性研究，具体的研究方法如下：

步骤（1）：将实施例1制备的β-葡聚糖包埋EcN放在模拟胃液与模拟胆汁的环境中，于37℃分别孵育2 h，以未包埋的EcN以及仅有金属-酚醛结构层包埋的EcN（也即无最外层的β-葡聚糖）作为对照。

其中，模拟胃液的制备方法如下：5g胃蛋白酶，8.5g氯化钠溶解于1000ml的无菌水中，并调节pH至2.5，使用前过0.22μm除菌滤膜；模拟胆汁的方法如下：配置4%的胆盐溶液，过0.22μm除菌滤膜后使用。

步骤（2）：在不同时间点（0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h）取50 μL进行稀释涂布后计数。

其结果如图7和图8所示。其中，图7对应在模拟胃液中的保护效果，图8对应在模拟胆汁中的保护效果，图7和图8中的β-葡聚糖包埋EcN即为多糖包埋益生菌，下同。

由图7和图8可知：β-葡聚糖包埋过后的EcN有较强的抗胃酸与抗胆盐的能力。且，没有多糖只有金属-酚醛结构层包埋大肠杆菌，无法提升原大肠杆菌在模拟胃液和模拟胆汁中的存活率，只有在最外层包埋了多糖之后才赋予大肠杆菌良好的抵抗胃酸和抵抗胆汁的能力，也即只有由益生菌、金属-多酚网络结构层以及多糖层整体作为完整体系才能起到有效抵抗胃酸和胆汁，提高大肠杆菌在胃液和胆汁中的存活率的效果，从而才使其能够在肠道有效发挥治疗结肠炎的作用。

试验例4

将实施例1制备的β-葡聚糖包埋EcN进行肠道滞留能力的研究，具体方法如下：

步骤（1）：小鼠禁食24 h后随机分为2组，每组6只，分别灌胃荧光标记的未包埋的EcN与荧光标记的实施例1制备的β-葡聚糖包埋的EcN各200 μL；

步骤（2）：在不同时间点（4 h, 48 h）采用颈椎脱臼法处死小鼠，并取其结肠进行荧光成像分析。

其结果如图9所示，图9为β-葡聚糖包埋EcN在肠道滞留的荧光强度结果示意图。

由图9可知：β-葡聚糖包埋的EcN在48 h后在肠道滞留的荧光强度明显强于未包埋的EcN，说明β-葡聚糖包埋的EcN在48 h后在肠道滞留的时间明显长于未包埋的EcN。

试验例5

将实施例1制备的β-葡聚糖包埋EcN进行贮藏稳定性的研究，具体方法如下：

步骤（1）：将实施例1制备的β-葡聚糖包埋的EcN与未包埋的EcN在十分之一体积的保护液中进行冻干。冻干后取部分菌粉进行稀释与涂布，于24 h后计算菌落数。

步骤（2）：在不同温度（-20℃，4℃）环境下贮藏7天，7天后重悬细菌干粉，取适当的体积进行稀释，并涂布于培养基，24 h后进行计数。对比贮藏前与贮藏后的菌落数，比较β-葡聚糖对EcN的保护作用。

其结果如图10所示，图10为β-葡聚糖包埋EcN的贮藏稳定性结果图。

由图10可知：β-葡聚糖包埋的EcN在比未包埋的EcN具有更好的贮藏稳定性。

试验例6

以实施例4-6所得的多糖包埋益生菌进行体外抗性研究，具体方法参照试验例3。

其结果如图11至图13所示，图11至图13均对应在模拟胃液中的保护效果。

由图11可以知：采用羧甲基改性的β-葡聚糖包埋后的EcN较采用β-葡聚糖包埋后的EcN具有更优的抗胃酸能力。

由图12和图13可知：岩藻多糖包埋过后的唾液乳杆菌以及银线莲多糖包埋过后的植物乳杆菌均有较强的抗胃酸能力。

试验例7

以实施例1中β-葡聚糖包埋EcN的制备方法为例，研究不同浓度下的多酚（单宁酸，TA）对应形成的金属-多酚网络的粒径。

其结果如图14所示。

由图14可知：TA在益生菌-金属-多酚复合物中的浓度为0.25-0.4 mg/mL时能够获得较适的网络尺寸。

若TA在益生菌-金属-多酚复合物中的浓度低于0.25 mg/mL可能形成较大的金属网络结构，无法对益生菌进行较好的保护；高于0.4 mg/mL可能造成原料的浪费。

并且，金属-多酚网络尺寸越小越容易紧密的包埋在益生菌表面，且便于工业应用，金属-多酚网络尺寸越大越容易导致益生菌表面粗糙，无法对益生菌进行较好的保护与造成原料的浪费。

试验例8

以实施例1制备得到的β-葡聚糖包埋EcN为例进行以下试验：

实验动物分组与处理：C57BL/6J实验动物按体重平均分为正常组、模型组、大肠杆菌（EcN）组、多糖组、β-葡聚糖包埋大肠杆菌组（简称“多糖包埋EcN组”）以及β-葡聚糖与大肠杆菌物理混合组（简称“多糖+EcN组”），每组小鼠4只。小鼠首先经过7天的适应期。适应期过后，正常组在整个实验过程中自由饮水，而其他5组小鼠前7天连续的自由饮水，后7天饮用2.5% 的葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium Salt, DSS）构建结肠炎模型，造模期间每天称量小鼠体重。后7天正常组和模型组每天灌胃0.2 mL PBS，EcN组和多糖包埋EcN组则灌胃相应的菌悬液 (细菌剂量:1×10

结肠炎小鼠灌胃7天期间体重变化如图15所示，图15可以看出：灌胃β-葡聚糖包埋大肠杆菌可以有效降低结肠炎对小鼠造成的体重减轻的现象。

结肠炎小鼠灌胃7天后的脾脏指数如图16所示，图16可以看出：灌胃β-葡聚糖包埋大肠杆菌可以有效的缓解结肠炎对小鼠造成的脾脏肿大的现象。

结肠炎小鼠灌胃7天后的结肠长度如图17所示，图17可以看出：灌胃β-葡聚糖包埋EcN可以有效的缓解结肠炎造成的结肠长度缩短的现象。

上述结果证明本申请提供的β-葡聚糖包埋EcN可以有效地缓解结肠炎对小鼠造成的肠道炎症。

此外，通过图15至图17可以看出，通过采用包埋形式将β-葡聚糖与EcN结合，较β-葡聚糖与EcN直接简单的物理混合能够有效降低结肠炎对小鼠造成的体重减轻的现象、有效缓解结肠炎对小鼠造成的脾脏肿大的现象、有效缓解结肠炎造成的结肠长度缩短的现象。说明本申请所用包埋形式可使多糖协同益生菌发挥生物活性，整体提升体系的治疗效果。

综上，本申请提供的多糖包埋益生菌在肠道中具有良好的稳定性，在不损害益生菌固有生物学特性的情况下，可以有效地提升益生菌的贮藏稳定性，同时安全有效地增强益生菌在肠道中的存活率与增强其在肠道的定殖能力。其制备方法操作简单，反应条件温和，易于工业化，多糖包埋益生菌的方法可以有多元性的组合，益生菌以及最外层的多糖壁材等也可以有不同的选择，可以针对不同的疾病，选择不同的益生菌与多糖材料进行组合，扩大了用途。所制得的多糖包埋益生菌可用于治疗胃肠道疾病的药物，尤其是治疗结肠炎的药物。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。