一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法

技术领域

本发明属于模式生物技术领域，具体涉及一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法。

背景技术

在人口日益老龄化的背景下，肥胖和衰老两种重要的疾病已经在世界范围内影响着人类健康。这两种疾病的趋同导致了一种称为肌少性肥胖的独特病理。目前，肌少性肥胖虽然缺乏共识定义，但可以归纳为以下三个标准：(1)低肌肉量；(2)高体脂水平；(3)低身体机能。其主要表现在衰老的过程中，肌肉质量和功能的整体下降，导致虚弱、体力活动下降、丧失独立性等非特异性症状。同时，机体中脂肪细胞的大小和数量增加，从而放大机体的炎症和氧化应激反应。

目前，对于肌少性肥胖的研究存在挑战：(1)体重指数(BMI)是肥胖最广泛的测量参数，但局限性在于它测量的是包括肌肉质量在内的总体重，不能提供肌肉力量和和身体表现的评估，且易产生“肥胖悖论”；(2)由于细胞群异质性的未知意义及其内外因素对特定细胞的作用，导致体外细胞实验难以反应真实的疾病状态；(3)动物模型实验周期长，具有伦理约束，操作也较为繁琐且成本较高，对肥胖和衰老关系的估计也存在偏差。

秀丽隐杆线虫是一种以细菌为食的小型模式生物，其体型简单、便于观察、寿命较短、试验周期适中、易于繁殖、遗传背景清楚，且线虫实验与哺乳动物实验结果存在良好的正相关性。在秀丽隐杆线虫中，已知约有25个基因可以改变线虫肌肉的正常晶格结构，其中一些基因已被证明编码特异性收缩蛋白，如编码副肌球蛋白的unc-15、编码肌钙蛋白的unc-27以及表达于线虫肌肉M波段的unc-89等，这些特定肌肉基因的突变或表达受阻可能导致线虫身体机能丧失。其次，细胞内脂肪主要的存储部位是脂滴，脂滴是一种普遍存在的细胞器，在酵母、线虫、果蝇以及哺乳动物中保守，衰老过程中线虫脂肪的异常堆积导致脂质毒性，降低其相关组织功能。因此秀丽隐杆线虫可以用来构建肌少性肥胖疾病模型，用于剖析该疾病在不能再生的组织中，与衰老有关的各种压力的关系，从而建立一个有效的抗肥胖和抗衰老化合物或菌株的筛选平台及抗感染的研究工具。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型的建立方法，该方法操作简单，只需替换细菌饮食产生线虫病理特征，不更改培养基条件和常规喂食方式，具有特征明显且方便快速的特点，适用于筛选、研究以及产品开发。

本发明的另一目的在于提供一种上述方法建立的秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型；该秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型的特征表现为：线虫取食偏好的改变、寿命缩短、产卵能力和运动能力下降，并出现脂肪含量增加、脂褐质和ROS水平上升的现象。基于转录组测序分析，该模型在生物学过程中与肌肉收缩功能下降和脂肪酸代谢异常显著相关，与表型相关性较好，表明该模型具有经济、有效、可行的特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型的建立方法，包括以下操作步骤：利用阴沟肠杆菌HJ感染经同步化的L4期野生型N2秀丽隐杆线虫，诱导肌少性肥胖的表型，并经转录组测序完成基因关联分析，即为秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型。

所述经同步化的L4期野生型N2秀丽隐杆线虫的获得按照以下步骤：用M9缓冲液收集妊娠期线虫，经裂解、离心、沉淀、清洗后，置于20℃下培养12h获得L1期线虫；将L1期虫转移至含有大肠杆菌OP50的NGM平板上培养52-60h，获得L4期线虫。

所述裂解使用的裂解液是体积比1：1的1M NaOH和NaClO溶液原液的混合液。

所述阴沟肠杆菌HJ感染是利用阴沟肠杆菌HJ代替线虫实验室标准喂食菌株大肠杆菌OP50，将经同步化的L4期野生型N2秀丽隐杆线虫转移至感染板，使其自由觅食。

所述阴沟肠杆菌HJ是从菌种保藏甘油管中挑取适当菌液进行平板划线，挑取单菌落接种于LB液体培养基，以180r/min，37℃活化培养14-16h，去除培养液，收集活化后的菌体，用无菌M9缓冲液清洗并重悬，调整阴沟肠杆菌HJ浓度为10

所述感染板是根据上述步骤获得浓度为10

所述肌少性肥胖的表征包括以下步骤：检测线虫对阴沟肠杆菌HJ的取食偏好，以及在浓度为10

一种由上述的建立方法构建的秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)造模方法简便：一些造模操作需要改变培养条件，会破坏线虫的正常生长环境，增加格外的干扰因素，影响实验准确性。本发明提供的一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法只需改变线虫的细菌饮食可完成建模步骤，操作更为简便，避免化学药物或物理刺激带来的不必要的影响。

(2)结果可信：秀丽隐杆线虫本身具有食菌性，依靠细菌营养进行生长和发育，其次不同细菌饮食会影响线虫的取食趋向，采用趋向率较高的细菌饮食，能确保细菌成功被线虫摄入，避免饥饿效应。

(3)模型适用性较好：本发明提供的秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型不仅仅可以对在线虫体内脂肪含量进行检测，还可以对肥胖发展过程中的关键影响因素进行探究，并且结合真核转录组测序阐明模型建立机制，提供了一个遗传上统一，可用于研究肥胖、老龄化以及死亡率之间的多重交集的模型。

附图说明

图1为线虫对不同细菌饮食的取食偏好。

图2为线虫在不同浓度阴沟肠杆菌中的寿命曲线图。

图3为线虫在感染板中的产卵量。

图4为线虫在感染板中的脂肪含量。

图5为线虫在感染板中的运动能力。

图6为线虫在感染板中的脂褐素含量。

图7为线虫在感染板中活性氧水平。

图8为差异表达基因GO功能注释。

图9为代表性差异基因表达情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明。但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

秀丽隐杆线虫为野生型N2。

线虫培养基(NGM)：NaCl 3g/L，蛋白胨2.5g/L，琼脂20g/L，1MKH

大肠杆菌(Escherichia coli)OP50：购于线虫中心CGC(CaenorhabditisGenetics Center)。

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)HJ：保藏编号45302，中国医学细菌保藏中心。

实施例1线虫同期化与菌株活化

收集处于妊娠期的线虫，用无菌M9缓冲液清洗2-3次后，裂解液和虫液以体积比1：1混合。其中裂解液为1M NaOH和NaClO溶液原液(大茂，AR)以体积比1：1混合。上下摇晃2-3分钟，直至大量虫体裂解，然后在4700r/min转速下离心30s，去上清液，加入无菌M9缓冲液重悬后，4700r/min离心30s，与前述同样转速和离心时间的条件下清洗4-5次；放置在20℃培养箱内，待12h后，将孵化出的L1期幼虫转移至OP50喂食板继续培养52-60h后获得L4期线虫。

从菌种保藏甘油管中挑取适当菌液进行平板划线，挑取单菌落接种于LB液体培养基，以180r/min，37℃活化培养14-16h，去除培养液，收集活化后的菌体，用无菌M9缓冲液清洗并重悬，调整阴沟肠杆菌HJ浓度为10

实施例2线虫肌少性肥胖模型的构建和表征

1.线虫趋化性测定

按照实施例1获得生长至L4期线虫，用无菌M9缓冲液清洗线虫2-3次，将其放置在60mm的NGM平板中心；大肠杆菌OP50和阴沟肠杆菌HJ菌体等距涂布在平板两侧，以大肠杆菌OP50和金黄色葡萄球菌趋化性作为对照。将平板放入20℃培养箱内培养，线虫自由爬行觅食，分别在2、4、6h后查计算各区域的停留的线虫数目。

实验结果：

由嗅觉感知诱导的趋化作用是秀丽隐杆线虫最有力的觅食工具之一。研究表明，秀丽隐杆线虫对大肠杆菌OP50的偏好大于对金黄色葡萄球菌的偏好，因此将金黄色葡萄球菌作为对照，探究线虫对本发明试用菌(阴沟肠杆菌HJ)的趋向性。如图1中的A-B所示，线虫在6h内有大于50％的线虫停留在阴沟肠杆菌HJ菌苔上(图1中C中黑色箭头指向的白色细小线条为正在菌苔中爬行的线虫)，没有表现出明显的排斥行为。表明本发明试用细菌饮食能成功被线虫摄入并具有一定的取食偏好性。

2.寿命实验

吸取不同应用浓度(10

实验结果：

寿命反映机体在衰老过程中组织完整性和功能的维持，而肌少性肥胖的一个重要病理特征是“早衰”。如图2所示，喂食低浓度阴沟肠杆菌HJ(10

3.线虫产卵量测定

按照实施例1获得生长至L4期线虫，将其转移至10

实验结果：

肌少性肥胖表现出广泛的退行性变化，其中生殖衰老也是被关注的点。秀丽隐杆线虫是一种无性系种群，主要由雌雄同体和少量雄虫组成，线虫可自体受精，其一生中大约可产200-300个虫卵。如图3所示，相较对照组而言，模型组线虫产卵总数下降21％(p＜0.05)，其繁殖能力显著降低。

4.线虫脂肪染色

按照实施例1获得生长至L4期线虫，将其转移至10

实验结果：

脂肪储存在特定细胞器内的脂肪组织中，被定义为脂滴。脂滴是普遍存在的细胞内结构，从酵母到哺乳动物的进化都是保守的。线虫将脂质存储在皮下和肠道细胞中，很容易通过染色检测。如图4中的A-B所示，较对照组而言，模型组线虫脂肪含量出现异常脂肪积累，其光密度分别在第1和第3天增加了26.09％和39.56％(p＜0.001)，致肥效果较为明显，且能较好维持高脂水平。

4.线虫运动能力测定

按照实施例1获得生长至L4期线虫，将其转移至10

实验结果：

线虫的体壁肌肉在角质层上施加压力以产生运动，线虫肌肉收缩能力的下降和肌肉蛋白的缺失会导致运动能力下降，表现早期运动缓慢。在脂肪积累和衰老过程中对线虫运动能力的影响研究表明(如图5中的A所示)，模型组线虫在第一天的运动能力与对照组比较无显著差异(p＞0.05)，第三天与对照组相比出现显著性差异，模型组线虫运动力显著下降(p＜0.05)。此外，用体视镜观察发现第七天时模型组线虫在NGM平板上的状态，发现大部分线虫运动迟缓，呈现半瘫痪状态，而喂食大肠杆菌OP50的大部分线虫身体形态正常，呈正弦曲线运动(图5中的B所示)。

4.线虫脂褐质测定

按照实施例1获得生长至L4期线虫，放置于10

实验结果：

“年龄色素”脂褐质在生物体随着衰老的进行，它在有丝分裂后的细胞中聚集，导致各组细胞系统的年龄依赖性退化。脂褐质是不可降解的，由氧化的、交联的蛋白质、脂质和糖类组成，脂褐质的积累会促进衰老。如图6中的A所示，在第7天测定其脂褐质荧光，模型组线虫较对照组而言，其脂褐质荧光平均增加了61％(p＜0.05)，在荧光显微镜下观察模型体内脂褐素的分布情况，脂褐质集中在肠道和咽喉部位，模型组中肠道内的荧光强度更明显(如图6中的B所示)。

5.线虫体内细胞活性氧水平测定

按照实施例1获得生长至L4期线虫，将其放置于10

实验结果：

采用荧光探针的氧化还原传感器，通过测定荧光强度以呈现其体内ROS含量和分布。如图7所示，模型组线虫较对照组而言，体内ROS水平显著提高(p＜0.05)。研究表明过量的ROS产生可以增加脂肪的积累和改变脂肪的组成，本发明基于病原体感染诱发ROS过表达，从而干扰线虫体内脂肪代谢能力。

实施例3线虫模型的基因关联分析

1.测序样品制备

按照实施例1获得生长至L4期线虫，将其放置于10

2.数据质控

测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)，文件为fastq格式，其中主要包含测序片段的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads。为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对原始数据进行过滤。主要包括去除带接头(adapter)的reads、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、去除低质量reads(Qphred≤20)的碱基数占整个read长度的50％以上的reads。同时，对clean data进行Q20，Q30和GC含量计算。后续所有分析均是基于clean data进行的高质量分析。

3.序列比对到参考基因组

直接从基因组网站下载参考基因组和基因模型注释文件。使用HISAT2v2.0.5构建参考基因组的索引，并使用HISAT2 v2.0.5将配对末端clean reads与参照基因组比对。我们选择HISAT2作为比对工具，因为HISAT2可以基于基因模型注释文件生成拼接连接的数据库，因此比其他非拼接比对工具有更好的比对效果。

本发明转录组学研究使用Wekemo Bioincloud平台(深圳微科盟科技集团有限公司)共检测6个样本，每个样本平均产生6G数据。用Qualimap RNA-seq软件流程评估比对情况，CK组和IN组样本比对参考基因组的平均比对率为97.5％和97.6％。

4.挑选差异表达基因

使用DESeq2软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析。DESeq2提供了统计程序，用于使用基于负二项式分布的模型来确定数字基因表达数据中的差异表达。取|log2foldchange|以及显著性检验p值＜0.05作为本次显著差异表达的阈值。

本次共检测到19390个基因，用DEseq2(1.16.1)计算基因的差异表达情况，以变化倍数≥1.2和显著性检验p值＜0.05作为差异表达基因，共筛选到1641个差异表达基因(DEGs)。IN组相对CK组，其DEGs显著上调600个，显著下调1041个。结果表明通过更改细菌饮食的方式会引起线虫体内基因的大量变化。

3.差异基因富集分析

为进一步阐明基因功能，我们基于DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)对筛选出的DEGs进行GO功能分析。所有的DEGs在生物学过程被注释到70个类别(如图8所示)，其中显著性排名前五的生物学过程包括肌肉收缩、肌节组织、跨膜运输、核膜组织以及脂肪酸代谢过程。

4.代表性差异基因表达情况

为了深入了解表型的变化，基于线虫数据库(https://wormbase.org)将线虫脂肪酸代谢、肌肉收缩以及肌节组织中具有代表性的差异表达基因进行功能注释，并关注这些基因在模型组内的表达情况。

如图9中的A所示，在线虫脂肪酸代谢过程中，fat-5、fat-6、fat-3、fat-2、K07B1.4以及elo-3它们主要参与脂肪合成，在模型中被显著上调。然而，fil-1、fil-2和sur-5脂肪酶基因主要作用于分解脂肪的存储，维持全身的能量内稳态，在模型中被显著下调。其次，参与巨型脂滴形成的基因，如acox-3酰基-CoA氧化酶表达激活脂肪酸结合活性，参与过氧化物酶体β-氧化途径，导致相邻脂滴快速融合形成巨型脂滴，在模型中被显著上调；Sams-1在模型组中被显著下调，该基因参与脂质存储的负调节，用于研究脂质代谢絮乱，该基因与人类MAT1A同源，与高蛋氨酸血症有关。Sams-1缺失导致线虫脂滴大小显著增加，脂滴表现为甘油三脂水平升高。

在秀丽隐杆线虫中，已知约有25个基因可以改变线虫肌肉的正常晶格结构，其中一些基因已被证明编码特异性收缩蛋白，包括肌球蛋白、副肌球蛋白和肌动蛋白，其中unc-89(横纹肌收缩调节)、unc-54和unc-15(骨骼肌肌球蛋白粗丝组件)、unc-22(肌节组织正向调节)、unc-27(体壁肌肉组织)、unc-52(维持肌肉细胞内稳态)是线虫肌节结构和肌肉收缩功能的重要参与者，然而，这些基因在模型中均被显著下调。其次，位于肌肉组织中与长寿和促酶活性相关的基因，如acdh-2和vha-6在模型中也被显著下调。另一方面，参与细胞坏死相关途径的基因asp-4和人类COL6A3同源物(在肌营养不良和肌张力障碍发挥作用)R193.2在模型中被显著上调(如图9中的B所示)。

综上所述，本发明提供的一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法，首次通过改变细菌饮食构建线虫肌少性肥胖模型。实验方法通过检测线虫的饮食趋化行为、存活率、产卵总量、脂肪、运动力、脂褐质、细胞内活性氧水平来对线虫肌少性肥胖进行表征。结果表明，线虫偏好阴沟肠杆菌HJ饮食，并在10

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。