一种检测组织蛋白酶L的荧光传感器的制备方法及其产品和应用

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种检测组织蛋白酶L的荧光传感器的制备方法及其产品和应用。

背景技术

在SARS-CoV-2入侵过程中，其中一种途径是内吞途径，在这个过程中，与细胞外部ACE2受体结合的冠状病毒会被细胞膜小范围内的凹陷区吞没，随后夹断，形成一个内吞膜泡将外部物质带入细胞，而后内吞膜泡与细胞内膜壁小泡融合，成为核内体。核内体中存在蛋白酶，包括组织蛋白酶L(CTSL)，可裂解S蛋白，并暴露S蛋白的融合肽区，融合肽会介导病毒膜与核内体膜融合，从而诱导病毒基因组随后入侵细胞。最近的研究表明，CTSL在冠状病毒S蛋白存在两个CTSL的切割位点CS-1和CS-2，CS-1位点附着S蛋白，很可能在病毒感染中起辅助作用；CS-2位点的裂解分离S1和S2结构域，以暴露准备进行膜融合的S2，然后完成感染过程，并且在SARS-CoV-2感染后CTSL循环水平升高，与病程和严重程度呈正相关，因此，CTSL是SARS-CoV-2感染入侵人体的主要靶点。CTSL表达水平和活性的改变还与肿瘤的发生、各种心血管疾病以及肾病等重大疾病密切相关，目前在临床中经常设计CTSL的抑制剂，来抑制CTSL的活性，从而达到治愈疾病的目的。

综上所述，聚焦SARS-CoV-2入侵过程的关键靶标CTSL，快速辨识抑制SARS-CoV-2入侵过程关键靶标效应物质，对于开发预防和治疗SARS-CoV-2的药物至关重要。

发明内容

针对现有技术存在的繁琐耗时、灵敏度低、设备庞大、成本高等缺点，本发明的目的在于提供一种检测组织蛋白酶L的荧光传感器的制备方法及其产品和应用。本发明所述的传感器制备方法简单，反应条件温和，灵敏度高且成本低廉，易于批量制备。将所构建的荧光传感器加入到组织蛋白酶L中孵育70分钟可得到响应结果；加入抗CTSL物质后，产生不同的荧光信号，可反映抗CTSL活性的强弱。本发明为CTSL的检测和中药抗CTSL活性物质的筛选提供一种新工具和新方法。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测组织蛋白酶L的荧光传感器的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)AIE颗粒的制备：将聚合诱导发光探针3-FCNA、组织蛋白酶L底物与戊二醛通过交联反应得到AIE颗粒；

(2)传感器的构建：将所述AIE颗粒、缓冲液与组织蛋白酶L混合孵育，得到3-FCNA-TWR传感器。

优选地，步骤(1)中，所述交联反应的步骤包括：

将聚合诱导发光探针3-FCNA溶液和组织蛋白酶L底物溶液混合，得到混合液一，将戊二醛加入混合液一中，避光磁力搅拌；静置，得到AIE颗粒。

优选地，所述聚合诱导发光探针3-FCNA在混合液一中的终浓度为180-220μM，例如可以是180μM、190μM、200μM、210μM或220μM等。

优选地，所述组织蛋白酶L底物在混合液一中的终浓度为8-12μM，例如可以是8μM、9μM、10μM、11μM或12μM等。

优选地，所述戊二醛在交联反应体系中的体积分数为0.2-0.25％，例如可以是0.2％、0.23％或0.25％等。

优选地，所述组织蛋白酶L底物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1：TWRVYSTGSN。

优选地，所述磁力搅拌的时间为0.8-1.2h，例如可以是0.8h、0.9h、1h、1.1h或1.2h等。

优选地，所述磁力搅拌的转速为150-200rpm，例如可以是150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm或200rpm等。

优选地，所述聚合诱导发光探针3-FCNA溶液采用包括如下步骤的方法制备得到：将聚合诱导发光探针3-FCNA先溶于四氢呋喃，再加入水混匀。

优选地，所述聚合诱导发光探针3-FCNA与四氢呋喃的质量体积比例为(1.8-2.2mg):(350-380μL)，例如可以是1.8mg:350μL、1.8mg:380μL、2.2mg:350μL或2.2mg:380μL等。

优选地，所述四氢呋喃与水的体积比1:(3-5)，例如可以是1:3、1:4或1:5等。

优选地，步骤(2)中，所述缓冲液按浓度计包括350-450mM乙酸钠(例如可以是350mM、370mM、400mM、430mM或450mM等)、3-5mM EDTA(例如可以是3mM、4mM或5mM等)、6-10mMDTT(例如可以是6mM、7mM、8mM、9mM或10mM等)，pH 5-5.5(例如可以是5、5.2或5.5等)。

优选地，步骤(2)中，所述组织蛋白酶L的平均分子量为30KD。

优选地，步骤(2)中，所述3-FCNA-TWR传感器中组织蛋白酶L的浓度为0.01-60nM(例如可以是0.01nM、1nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM或60nM等)，优选为10-30nM。

优选地，步骤(2)中，所述3-FCNA-TWR传感器中AIE颗粒的浓度为135-145μM，例如可以是135μM、138μM、140μM、142μM或145μM等。

作为本发明的优选技术方案，所述检测组织蛋白酶L的荧光传感器的制备方法包括如下步骤：

(1)制备AIE颗粒3-FCNA-TWR：

将聚合诱导发光探针3-FCNA先溶于四氢呋喃，再加入水混匀，得到聚合诱导发光探针3-FCNA溶液；所述聚合诱导发光探针3-FCNA与四氢呋喃的质量体积比例为(1.8-2.2mg):(350-380μL)；所述四氢呋喃与水的体积比1:(3-5)；分别取聚合诱导发光探针3-FCNA溶液和TWRVYSTGSN溶液，将二者混合得到混合液一。所述聚合诱导发光探针3-FCNA在混合液一中的终浓度为180-220μM；所述组织蛋白酶L底物在混合液一中的终浓度为8-12μM。将戊二醛加入混合液一中，所述戊二醛在交联反应体系中的体积分数为0.2-0.25％。在室温下磁力搅拌器上避光搅拌0.8-1.2h；将搅拌后的溶液静置，除去未反应的四氢呋喃和戊二醛，得到AIE颗粒(3-FCNA-TWR)。

(2)传感器的构建：

将AIE颗粒(3-FCNA-TWR)与缓冲液、CTSL孵育0.8-1.2h后充分混合即得3-FCNA-TWR传感器，即为3-FCNA-TWR荧光传感器；所述缓冲液按浓度计包括350-450mM乙酸钠、3-5mM EDTA、6-10mM DTT，pH 5-5.5；所述3-FCNA-TWR传感器中组织蛋白酶L的浓度为0.01-60nM，所述3-FCNA-TWR传感器中AIE颗粒的浓度为135-145μM。

第二方面，本发明提供一种检测组织蛋白酶L的荧光传感器，所述荧光传感器由第一方面所述的检测组织蛋白酶L的荧光传感器的制备方法制备得到。

第三方面，本发明提供一种检测组织蛋白酶L的方法，采用第二方面所述的检测组织蛋白酶L的荧光传感器对含有组织蛋白酶L的样品进行检测，根据荧光响应检测样品中组织蛋白酶L的含量。

第四方面，本发明提供第一方面所述的检测组织蛋白酶L的荧光传感器的制备方法和/或第二方面所述的检测组织蛋白酶L的荧光传感器在制备检测组织蛋白酶L的产品或在制备检测组织蛋白酶L抑制剂的产品中的应用。

第五方面，本发明提供一种检测组织蛋白酶L抑制剂的荧光传感器，所述荧光传感器的制备方法包括如下步骤：

将组织蛋白酶L、组织蛋白酶L抑制剂与第一方面所述的AIE颗粒混合孵育，得到检测组织蛋白酶L抑制剂的荧光传感器。

本发明中，所述组织蛋白酶L抑制剂包括抗CTSL活性物质。

第六方面，本发明提供一种检测组织蛋白酶L抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤：

采用第五方面所述的检测组织蛋白酶L抑制剂的荧光传感器对含有组织蛋白酶L抑制剂的样品进行检测，根据荧光响应检测样品中组织蛋白酶L抑制剂的含量。

第七方面，本发明提供第五方面所述的检测组织蛋白酶L抑制剂的荧光传感器在制备筛选抗CTSL活性物质的产品中的应用。

优选地，所述应用包括在制备筛选血必净抗CTSL活性物质的产品中的应用。

本发明中所述检测组织蛋白酶L的荧光传感器可以作为双功能荧光传感器同时检测组织蛋白酶L和组织蛋白酶L抑制物。

本发明中采用3-FCNA-TWR荧光传感器的制备方法所制备的双功能荧光传感器在制备监测CTSL和筛选中药-血必净注射液抗CTSL活性物质中的应用方法包括：

将CTSL与3-FCNA-TWR孵育一定时间后，CTSL和3-FCNA-TWR反应，从而对3-FCNA-TWR产生不同程度的解体，根据传感器的荧光响应，快速检测CTSL；

将抗CTSL活性物质与3-FCNA-TWR荧光传感器孵育一定时间后，抗CTSL活性物质可使CTSL活性降低或失活，从而对3-FCNA-TWR产生不同程度的解体，根据传感器的荧光响应，快速检测血必净中的抗CTSL活性物质。

本发明的原理阐述如下：

3-FCNA-TWR的制备是由CTSL底物(TWRVYSTGSN)和聚集诱导发光探针(3-FCNA)在戊二醛交联剂下交联形成3-FCNA-TWR，3-FCNA在颗粒中会发生聚集从而导致分子内运动受限(RIM)导致3-FCNA发出强烈荧光；加入CTSL后由于3-FCNA-TWR与CTSL之间发生特异性反应，3-FCNA从3-FCNA-TWR中释放出来，RIM现象消失，AIE荧光消失；抗CTSL物质加入后，CTSL的活力受到影响，从而影响3-FCNA-TWR和CTSL之间的反应，发生RIM现象，荧光增强(图1)，将已知XBJ注射液所含化合物并且易得的中药标准品和3-FCNA-TWR应用于组分的抗CTSL的筛选(图1)。

本发明中荧光数值是采用荧光酶标仪读取。具体的，本发明提供了一种荧光传感器用于同时监测CTSL和筛选XBJ注射液中的CTSL抑制剂，所述传感器制备简单、灵敏度高、反应条件温和，且成本低廉，易于批量制备。将所构建的传感器加入到中药注射液中可快速得到响应结果：根据抗CTSL活性的强弱，产生不同的荧光信号，可反映环境中是否存在抗CTSL活性成分以及抗CTSL活性的强弱，为中药活性成分筛选提供一种新方法。

本发明应用范围极为广泛，不仅可用于检测CTSL，也可根据3-FCNA-TWR和CTSL的相互作用，筛选出具有抗CTSL活性成分的活性物质。

本发明构建的3-FCNA-TWR荧光传感器为一种CTSL监测传感器，其作用机制是基于CTSL活力的强弱与传感器荧光强度的变化情况构成的对应关系，通过检测荧光强度的变化从而判断CTSL活力的大小或通过荧光强度的变化从而判断抑制CTSL活性的抑制能力。

在检测组织蛋白酶L的荧光传感器中，当存在CTSL时，CTSL与CTSL底物反应，3-FCNA释放到溶液中，原本AIE颗粒的强烈荧光减弱；CTSL活力弱或者CTSL浓度低时，反应后的荧光相对于原始AIE颗粒的荧光强度较低；CTSL活力强或者CTSL浓度高时，反应后的荧光相对于原始AIE颗粒的荧光强度更低；综上，当CTSL活力强或者CTSL浓度高时会比CTSL活力弱或者CTSL浓度低时具有更低的荧光强度。因此，可根据荧光降低的程度判断CTSL活力强度。

在检测组织蛋白酶L抑制剂的荧光传感器中，抑制CTSL活性的能力强弱可根据本发明所构建的相应传感器的荧光信号的差异来反映。当存在CTSL时，CTSL与CTSL底物反应，3-FCNA释放到溶液中，原本AIE颗粒的强烈荧光减弱；但是，在加入抑制CTSL活性的化合物后，化合物充当抑制剂抑制了CTSL的活性，因此当与CTSL底物反应时，反应体系的荧光相对于不加抑制CTSL活性的化合物体系的荧光强度强。因此，加入抑制剂的反应体系荧光相对于AIE颗粒的荧光强度回调越大，则证明抑制CTSL活性能力越强。

本发明中的荧光传感器具有快速响应的特点，快速响应是将传感器加入到96孔板中孵育70min后扫荧光就可得到结果，从而实现快速检测和筛选。就CTSL而言，所构建的传感器是一种CTSL活力监测传感器；就XBJ而言，可判断XBJ对CTSL是否存在抑制作用，进而所述传感器可筛选XBJ的抗CTSL活性物质。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了AIE荧光传感器及其制备方法。本发明传感器的制备方法简单、灵敏度高、反应条件温和，且成本低廉、易于批量制备。将本发明制备的传感器加入到水溶液中可瞬时得到荧光信号，该方法与传统的中药活性物质的筛选和现有的CTSL的检测相比，可同时实现快速检测和筛选，即加入传感器后即可快速检测荧光，简便快速准确。更重要的是，本发明应用范围极为广泛，不仅可用于监测CTSL活力的大小，也可用于中药活性成分的筛选研究。此外，本发明所构建的传感器制备过程简单，为探针在中药现代化的应用上提供了一种新工具和新方法。

(2)本发明通过交联法制备得到3-FCNA-TWR，形成3-FCNA-TWR荧光传感器，当CTSL存在时会与底物之间发生特异性的水解反应。传感器与抗CTSL物质发生抑制作用，产生荧光信号。当存在抗CTSL活性物质时，3-FCNA-TWR荧光传感器会产生不同的荧光信号以反映抗CTSL活性的强弱。本发明所制备的传感器在CTSL活力监测和中药活性成分的筛选等方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明检测原理示意图；

图2为实施例1制备得到的AIE探针的聚集诱导发光性能检测结果；

图3为3-FCNA探针的合成步骤；

图4为实施例2得到的有机溶剂四氢呋喃浓度对荧光传感器体系的影响；

图5为实施例3得到的合成方法对3-FCNA-TWR合成的影响；

图6为实施例4得到的CTSL底物浓度与AIE探针浓度配比对3-FCNA-TWR合成的影响；

图7为实施例5得到的反应时间对3-FCNA-TWR合成的影响；

图8为实施例6所得的转速对反应的影响；

图9为实施例7所得的有机溶剂戊二醛对3-FCNA-TWR对荧光传感器体系的影响；

图10为实施例8所得的透射电子图；

图11为实施例8所得的传感器的Zeta电位结果；

图12为实施例8所得的传感器的水合粒径图；

图13为实施例9所得的3-FCNA-TWR用于CTSL检测的线性图；

图14为实施例10所得的3-FCNA-TWR用于XBJ抗CTSL活性物质的验证的荧光光谱图；

图15为实施例10所得的3-FCNA-TWR用于XBJ抗CTSL活性物质抑制率的验证结果图；

图16为实施例11所得的XBJ注射液已知标准品抗CTSL活性验证结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

以下实施例中，荧光数值读取所用的荧光酶标仪型号为L-117型多功能酶标仪购于美国Thermo Scientific公司；紫外可见光分光光度计购于日本SHIMADZU；Zeta电位的测定采用Malvern Panalytical instrument测得；透射电子显微镜对3-FCNA-TWR的测定是采用美国FEI Talos 200S仪器在加速电压为200kV测得；CTSL购自德国Sigma公司；CTSL底物购自南京肽业生物科技有限公司；戊二醛购自德国Sigma公司；四氢呋喃购自北京百灵威科技有限公司；血必净注射液购于天津红日药业股份有限公司。

本发明中所述AIE探针为3-FCNA探针，所述3-FCNA探针的结构见图2中的A图，3-FCNA探针购自西安瑞禧生物科技有限公司，3-FCNA探针的合成步骤如图3所示，3-FCNA探针的

实施例1

AIE探针的聚集诱导发光性能检测：

(1)配制3-FCNA探针母液(5mM)：精密称取5mg 3-FCNA探针，溶于THF(四氢呋喃)中，其浓度为5mM，避光密封，常温保存。

(2)向96孔板依次加96μL不同比例的THF/H

(3)将96孔板用恒温混合小精灵摇匀，用酶标仪测定3-FCNA探针在THF/H

图2给出了3-FCNA在不同比例的四氢呋喃和水溶液中的荧光强度，说明3-FCNA的聚集诱导效应良好。

实施例2

有机溶剂四氢呋喃浓度对荧光传感器体系的影响：

四氢呋喃作为有机溶剂会很大程度地影响传感器的成功与否，从而干扰荧光传感器体系的响应，探究不同的四氢呋喃浓度对传感器的影响。

(1)精密称取3mg的CTSL底物TWRVYSTGSN，用Milli-Q水，配制成10mM母液。

(2)取含有3-FCNA探针(5mM)的THF溶液加入到THF中，迅速加入Milli-Q水，混匀后向水溶液中加入CTSL底物(10mM)，然后加入5μL戊二醛。按照下列比例进行传感器的合成(体积为μL)。

表1

(4)在室温下以180rpm，搅拌1h。

(5)反应结束后，避光静置48h使THF挥发。除去THF后得到3-FCNA-TWR。

图4给出了3-FCNA在不同比例的四氢呋喃和水溶液中的荧光强度，说明在20％THF/H

实施例3

合成方法对3-FCNA-TWR合成的影响：

(1)S1：将探针溶于20％ THF/H

(2)S2：将探针溶于20％ THF/H

(3)S3：将探针溶于THF，后加入水(使THF/H

从图5可知合成方式的不同会对3-FCNA-TWR的荧光强度产生很大影响，当用合成方法3时合成效果最佳。

实施例4

CTSL底物浓度与AIE探针浓度配比对3-FCNA-TWR合成的影响：

固定3-FCNA浓度用量为200μM(合成3-FCNA-TWR时，当探针3-FCNA母液为5mM时，3-FCNA-TWR体积2000μL，取64μL时，3-FCNA终浓度为160μM，最终静置挥发掉体系中的四氢呋喃400μL，得到最终3-FCNA-TWR体积为1600μL，故3-FCNA终浓度为200μM)，探究不同浓度CTSL底物(0μM、5μM、10μM、20μM、50μM或100μM)对3-FCNA-TWR合成的影响：

(1)取64μL含有3-FCNA探针(5mM)的THF溶液加入到336μL THF中，迅速加入1592μLMilli-Q水，混匀后向水溶液中加入8μL CTSL底物，然后加入5μL戊二醛。

(2)在室温下以180rpm，搅拌1h。

(3)反应结束后，避光静置48h使THF挥发。除去THF后得到3-FCNA-TWR。

由图6可知底物浓度过大或者过小都会对3-FCNA-TWR的荧光强度产生很大影响。当固定3-FCNA浓度为200μM，衡量底物用量对整个体系的影响，得出底物浓度为10μM时，3-FCNA-TWR的合成效果最佳的结论。

实施例5

反应时间对3-FCNA-TWR合成的影响：

反应时间是否充分也会影响颗粒的合成成功，探究不同的反应时间(0.5h、1h、1.5h、2h或2.5h)对3-FCNA-TWR合成的影响。

(1)取64μL含有3-FCNA探针(5mM)的THF溶液加入到336μL THF中，迅速加入1592μLMilli-Q水，混匀后向水溶液中加入8μL CTSL底物母液，然后加入5μL戊二醛。

(2)在室温下以180rpm常温搅拌0.5h、1h、1.5h、2h或2.5h。

反应结束后，避光静置48h以挥发THF，除去THF后3-FCNA-TWR，终溶液避光密封，常温保存。

由图7可知当搅拌时间为1h时，3-FCNA-TWR的合成效果最佳。

实施例6

转速对反应的影响：

转速的快慢，颗粒合成的形状也会发生变化，探究搅拌转速(130rpm(r/min)、180rpm、280rpm、380rpm或480rpm)对AIE颗粒合成的影响。

(1)取64μL含有3-FCNA探针(5mM)的THF溶液加入到336μL THF中，迅速加入1592μLMilli-Q水，混匀后向水溶液中加入8μL CTSL底物母液，然后加入5μL戊二醛。

(2)在室温下以130rpm、180rpm、280rpm、380rpm或480rpm常温搅拌1h。

(3)反应结束后，避光静置48h使THF挥发。除去THF后得到3-FCNA-TWR，避光密封，常温储存以供后续实验使用。

如图8所示，当转速为180rpm时，3-FCNA-TWR的荧光强度最佳。

实施例7

有机溶剂戊二醛对3-FCNA-TWR对荧光传感器体系的影响：

戊二醛作为有机溶剂会很大程度地影响酶活力，从而干扰荧光传感器体系的响应，探究不同的戊二醛浓度对酶活力的影响。

(1)取64μL含有3-FCNA探针(5mM)的THF溶液加入到336μL THF中，迅速加入1592μLMilli-Q水，混匀后向水溶液中加入8μL CTSL底物母液，然后分别加入2.5μL、5μL、7.5μL、10μL或12.5μL戊二醛，在交联反应体系中戊二醛的体积浓度分别为0.125％、0.25％、0.375％、0.5％或0.625％。

(2)在室温下以180rpm的转速常温搅拌1h。

(3)反应结束后，避光静置48h使THF挥发。除去THF后得到3-FCNA-TWR，避光密封，常温储存以供后续实验使用。

如图9所示，当戊二醛体积为5μL(体积浓度0.25％)时，3-FCNA-TWR的荧光强度最佳。

实施例8

(1)使用透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察3-FCNA-TWR的形态。

(2)吸取200μL新制备的3-FCNA-TWR溶液，使用Malvern Zeta sizer-Nano Zinstrument激光粒度仪检测粒子的水合粒径。

(3)吸取200μL新制备的3-FCNA-TWR溶液，加入折叠毛细管电位样品池中，使用Malvern Panalytical激光粒度仪检测Zeta电位。

如图10所示，3-FCNA-TWR呈粘合的棒状，粒径在1μm左右，表明了3-FCNA-TWR的成功制备。如图11所示，3-FCNA-TWR的电位显示为-6.009mV左右，证明3-FCNA-TWR在水溶液中可以稳定存在。如图12所示，3-FCNA-TWR的平均水合粒径显示为845nm左右。

实施例9

CTSL检测：

将20μL乙酸钠缓冲液和10μL CTSL(200nM)，70μL 3-FCNA-TWR溶液，加入96孔板中37℃孵育70min，立即取出。反应结束后，用酶标仪测定荧光强度(Ex/Em＝538/694nm)。

如图13所示，随着CTSL浓度的增加，传感器的荧光强度越来越低，且在0.01-60nM时，在694nm处的荧光强度会随着CTSL的增加而降低。

实施例10

XBJ抗CTSL活性物质的验证：

(1)取20μL乙酸钠缓冲溶液溶液添加到96孔板中；然后，取10μL CTSL溶液添加到96孔板，将10μL血必净注射液(以血必净注射液成品浓度为1，通过用水稀释不同倍数得到的一系列浓度的血必净注射液，血必净原液稀释0倍、5倍、25倍、250倍或500倍)，添加到96孔板，37℃孵育10min，取出96孔板，避光加入60uL 3-FCNA-TWR溶液，混合均匀，放入37℃培养箱中，孵育70min。

(3)反应结束后，在37℃使用酶标仪测量荧光强度。(Ex/Em＝538/694nm)

检测结果如图14所示，此处作为CTSL抑制剂的血必净注射液，随着血必净溶液浓度的降低，血必净注射液浓度为0.2-0.002时，溶液荧光强度随之下降。因此荧光强度下降可理解为对CTSL抑制能力的减弱，反之，荧光强度上升则可理解为血必净注射液具有更强的抑制CTSL活性能力，抑制率如图15所示。

实施例11

XBJ注射液已知标准品抗CTSL活性的验证：

称量适量的E64d、绿原酸、异槲皮苷、咖啡酸、氧化芍药苷、阿魏酸、原儿茶醛、羟基红花黄色素A、丹参素和没食子酸，用DMSO溶解，配制成2.5mM的母液，放置4℃冰箱备用。

(1)空白组的荧光测定

将20μL乙酸钠缓冲溶液溶液添加到96孔板中，96孔板10μL的CTSL溶剂和10μL10％ DMSO/H

(2)CTSL对照组的荧光测定

将20μL乙酸钠缓冲溶液溶液添加到96孔板中；然后，取10μL CTSL溶液添加到96孔板，加入10μL 10％ DMSO/H

(3)待测样品的荧光测定

将20μL乙酸钠缓冲溶液添加到96孔板中；然后，取10μL CTSL溶液添加到96孔板，将10μL待测样品(DMSO:H

抑制率计算方法：

抑制率(％)＝(A2-A1)/(A0-A1)×100％

其中，A0为空白组的荧光强度，A1为CTSL对照组的荧光强度，A2待测样品的荧光强度。

实验结果通过使用OriginPro 2019b软件绘制荧光强度-反应曲线。所有实验至少重复三遍。

如图16所示，将抑制率在1-10％定为“低活性成分”，抑制率在10-50％定为“中活性成分”，抑制率在大于50％定为“高活性成分”。共有9个对照品有活性，低活性馏分有3个，中活性馏分有3个，高活性馏分有3个馏分。

综上，本发明提供了一种荧光传感器的及其制备方法及和应用，本发明制备的传感器制备简单，反应条件温和，灵敏度高且成本低廉，易于批量制备，将所构建的传感器加入到组织蛋白酶L中孵育70分钟可得到响应结果。加入抗CTSL物质后，产生不同的荧光信号，可反映抗CTSL活性的强弱，为CTSL的检测和中药抗CTSL活性物质的筛选提供一种新工具和新方法。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。