一种用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶的制备方法及其应用。

背景技术

糖尿病是一种严重威胁人类健康的全球性慢性疾病，以高血糖水平为主要特征和诊断标准。长期患有糖尿病的患者，其体内的各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经等都会受到慢性损害并产生功能障碍。目前，全球已有超过5.37亿人被诊断患有一型或二型糖尿病，并且这个数字还在不断上升。体内的高葡萄糖水平是糖尿病患者最重要的生化指标，因此血糖监测对糖尿病患者的诊断以及日常健康管理均具有重要的意义。目前，以指端采血检测的血糖检测仪的应用最为常见。但是频繁的采血检测需要消耗大量试纸从而增大患者的经济负担，更进一步的，这种侵入性强的检测方式会给患者带来痛苦，从而会极大降低患者的依存性且有被感染的风险。因此，对比现在的昂贵且痛苦的检测方式，开发出一种低成本的、操作简单并且无创微痛的葡萄糖监测方式具有很大的临床实用意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶的制备方法及其应用。本发明的双网络光子晶体水凝胶能够可视化的、可逆的、可重复使用的检测体液中的葡萄糖水平。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶的制备方法，包括如下步骤：将无葡萄糖响应性的水凝胶溶液注入光子晶体的缝隙中并固化，再利用化学刻蚀除去光子晶体的微球模板，得到具有反蛋白石结构和结构色的水凝胶，将其作为骨架，并在其空位中填充具有葡萄糖响应性功能的水凝胶溶液并固化，得到具有结构色以及葡萄糖响应性的双网络光子晶体水凝胶，即所述的用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶。所述的光子晶体优选为二氧化硅光子晶体，优选利用氢氟酸将二氧化硅刻蚀。

在一些实施方案中，所述的无葡萄糖响应性的水凝胶溶液为P(AA-Am)水凝胶溶液，使用热引发剂进行引发固化，其优选包含如下含量的组分：10％-25％(v/v)丙烯酸单体，10％-25％(w/v)丙烯酰胺单体，1‰-5‰(w/v)过二硫酸钾，1‰-5‰(w/v)N-N’亚甲基双丙烯酰胺，溶剂为水。更为优选地，其包含如下含量的组分：20％(v/v)丙烯酸单体，10％(w/v)丙烯酰胺单体，5‰(w/v)过二硫酸钾，3‰(w/v)N-N’亚甲基双丙烯酰胺，溶剂为水。

在一些实施方案中，所述的具有葡萄糖响应性功能的水凝胶溶液为含有葡萄糖响应性分子的水凝胶溶液，所述的葡萄糖响应性分子优选为4-(2-丙烯酰胺乙基氨基甲酰基)-3-氟苯基硼酸(AFPBA)。进一步地，所述的具有葡萄糖响应性功能的水凝胶溶液为含有AFPBA的P(AA-Am)水凝胶溶液，使用光引发剂进行引发固化，其优选包含如下含量的组分：10％-25％(v/v)丙烯酸单体，10％-25％(w/v)丙烯酰胺单体，5％-20％(w/v)AFPBA，1％-5％(w/v)2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，1‰-5‰(w/v)N-N’亚甲基双丙烯酰胺，溶剂为水。更为优选地，其包含如下含量的组分：20％(v/v)丙烯酸单体，10％(w/v)丙烯酰胺单体，10％(w/v)AFPBA，1％(w/v)2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，3‰(w/v)N-N’亚甲基双丙烯酰胺，溶剂为水。

进一步地，所述的用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将使用二氧化硅微球的水分散液制备得到的光子晶体固定在两片玻片之间。

(2)将无葡萄糖响应性的水凝胶溶液注入二氧化硅光子晶体的缝隙中，加热固化后取下水凝胶和光子晶体。

(3)将取下的水凝胶和光子晶体一起浸泡在氢氟酸溶液中使二氧化硅微球被刻蚀，得到具有反蛋白石结构和结构色的水凝胶。

(4)将具有反蛋白石结构和结构色的水凝胶浸泡在具有葡萄糖响应性功能的水凝胶溶液中，经紫外光(优选331nm)固化，得到所述的用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶。

步骤(1)中，所述的光子晶体优选使用自组装的水平沉积法制备，具体包括如下步骤：用PDMS单体与交联剂制备PDMS围栏，将其用O

步骤(2)中，所述的加热的温度为50-70摄氏度，优选60摄氏度。

步骤(3)中，所述的氢氟酸溶液的浓度为10％-49％(wt.)，优选为49％(wt.)。

所述的用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶的制备方法中，可以通过调控二氧化硅微球的粒径来调控双网络光子晶体水凝胶的结构色。

一种用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶，通过上述制备方法得到。

本发明的双网络光子晶体水凝胶的结构示意图见图1，作为骨架的水凝胶体系是丙烯酰胺共丙烯酸水凝胶，使用热引发剂进行引发固化，具有良好的生物相容性和可逆性；作为填充的葡萄糖响应性水凝胶体系是加入葡萄糖响应性分子AFPBA的丙烯酰胺共丙烯酸水凝胶体系，使用光引发剂进行引发固化，得到的水凝胶具有良好的生物相容性、葡萄糖响应性和良好的可逆性。

本发明的双网络光子晶体水凝胶实现可视化的功能是通过光子晶体的结构色特性实现的。光子晶体内部的周期性结构会使得特定波长的光线不能传播从而被反射。光子晶体的颜色会随着周期结构的变化发生变化。由于光子晶体会呈现结构色的特点，当光子晶体水凝胶发生溶胀时，其颜色会发生肉眼可见的变化。

本发明的双网络光子晶体水凝胶中的葡萄糖响应性分子AFPBA作为苯硼酸的衍生物之一，具有良好的葡萄糖响应性。当双网络光子晶体水凝胶溶解在葡萄糖溶液中时，AFPBA苯环上的硼酸集团部分电离从而带负电，从而与葡萄糖分子结构中的二羟基结构结合，因此葡萄糖浓度升高时，使电离平衡朝着电离的方向进行，更多的疏水不带电的PBA电离成亲水的带负电的PBA，从而使整个水凝胶网络发生溶胀，样品的颜色随之发生红移，体现出对葡萄糖良好的响应性。反之，当葡萄糖溶液的浓度下降时，AFPBA的电离平衡向逆向方向进行，水凝胶样品体积收缩，样品的颜色发生蓝移，从而达到葡萄糖水平可视化读出的目的。

所述的用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶在血糖检测或制备血糖检测产品中的应用。

一种血糖检测产品，包含所述的用于可视化血糖检测的双网络光子晶体水凝胶。

所述的血糖检测为血糖水平的可视化检测。

本发明的优点和有益效果：本发明利用葡萄糖响应性分子的电离平衡实现可视化的葡萄糖水平检测，得到的双网络光子晶体水凝胶样品具有鲜艳的结构色和良好的可逆性。并且可以通过对光子晶体粒子粒径的调控实现对双网络光子晶体水凝胶结构色的调控。相对于单网络光子晶体水凝胶，本发明中的双网络光子晶体水凝胶中响应性水凝胶的体积占比比单网络光子晶体水凝胶中响应性水凝胶的占比更大，其对葡萄糖的响应速度更快，可以将反应时间缩短一半。

附图说明

图1是本发明的双网络光子晶体水凝胶的二维示意图。

图2是使用不同粒径的SiO

图3是色相值示意图。

图4是本发明的双网络光子晶体水凝胶与单网络光子晶体水凝胶的示意图，(a)单网络光子晶体水凝胶；(b)双网络光子晶体水凝胶。

图5是蓝色双网络光子晶体水凝胶在葡萄糖溶液中的可逆响应性变化，(a)蓝色双网络光子晶体水凝胶的颜色，(b)蓝色双网络光子晶体水凝胶的色相值。

图6是绿色双网络光子晶体水凝胶在葡萄糖溶液中的可逆响应性变化，(a)绿色双网络光子晶体水凝胶的颜色，(b)绿色双网络光子晶体水凝胶的色相值。

图7是蓝色双网络光子晶体水凝胶在葡萄糖溶液中循环浸泡的色相值变化。

图8是双网络光子晶体水凝胶和单网络光子晶体水凝胶在葡萄糖溶液中的响应性对比。

图9是绿色双网络光子晶体水凝胶的体内葡萄糖响应性测试，(a)小鼠伤口模型，(b)不同血糖的小鼠伤口对应的水凝胶的颜色变化，(c)不同血糖的小鼠伤口对应的水凝胶的色相值变化。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1光子晶体水凝胶的制备与性能测试

1、光子晶体的制备

使用氨水、去离子水、乙醇、正硅酸四乙酯制备得到SiO

将PDMS预聚物和固化剂以质量比10:1混合，交联制备得到不同形状的PDMS围栏，其深度为2mm。将PDMS围栏用O

将上述PDMS亲水性围栏和洁净的玻璃片贴合在一起，置于35-40摄氏度(优选37摄氏度)的水平加热台上，并加入SiO

通过调控反应物的浓度得到不同粒径的SiO

2、单网络光子晶体水凝胶的制备

分别称量20％(v/v)丙烯酸单体、10％(w/v)丙烯酰胺单体、5‰(w/v)过二硫酸钾、3‰(w/v)N-N’亚甲基双丙烯酰胺、10％(w/v)AFPBA加到水中，充分振荡溶解，得到水凝胶溶液。

将光子晶体固定在两块玻片中间。将水凝胶溶液注入到两片玻片间的光子晶体的间隙中，60摄氏度恒温加热一小时。固化后将水凝胶和光子晶体样品一起取下，浸泡在49％(wt.)氢氟酸溶液中24小时，将二氧化硅微球刻蚀后取出并用纯水清洗，最终获得具有鲜明结构色的单网络光子晶体水凝胶样品，其二维结构示意图如图4a所示。

3、双网络光子晶体水凝胶的制备

(1)骨架丙烯酰胺共丙烯酸水凝胶的制备

分别称量参数为20％(v/v)丙烯酸单体、10％(w/v)丙烯酰胺单体、5‰(w/v)过二硫酸钾、3‰(w/v)N-N’亚甲基双丙烯酰胺加到水中，充分振荡溶解，得到水凝胶溶液。

将光子晶体固定在两块玻片中间。将水凝胶溶液注入固定在两片玻片间的光子晶体的缝隙中，60摄氏度热固化一小时后，将水凝胶和光子晶体样品一起取下，浸泡在49％(wt.)氢氟酸溶液中24小时后取出并用纯水进行清洗。

(2)双网络光子晶体水凝胶的制备

将上述丙烯酰胺共丙烯酸水凝胶浸泡在含AFPBA的水凝胶溶液中浸泡，五分钟后取出，用365nm紫外光(光强密度68.24mW/cm

4、双网络光子晶体水凝胶的体外葡萄糖响应及可逆响应性测试

将双网络光子晶体水凝胶逐一浸泡在浓度分别为0mM、6.6mM、13.2mM、19.8mM、26.4mM的葡萄糖溶液中，浸泡十五分钟后将水凝胶取出，观察并记录其颜色变化。为验证光子晶体水凝胶对葡萄糖响应的可逆性，将水凝胶再逐一浸泡在从高到低浓度的葡萄糖溶液中，浸泡十五分钟后将水凝胶取出，观察并记录光子晶体水凝胶的颜色变化。

(1)使用粒径240nm的二氧化硅微球制备了蓝色结构色的光子晶体和双网络光子晶体水凝胶，并使用蓝色结构色的双网络光子晶体水凝胶进行测试，水凝胶样品对不同浓度的葡萄糖溶液的可逆响应性结果如图5所示。

由图5可以看到，蓝色的水凝胶浸泡在由低到高浓度的葡萄糖溶液中足够的时间后，表现出颜色的红移现象(图5a)。这是因为AFPBA与葡萄糖相互作用，使得整个水凝胶体积溶胀，导致光子晶体的内部周期结构改变，根据布拉格衍射的公式得到，反射峰的位置红移。使用软件对得到的图片结果进行像素点的采集并分析其色相变化，得到的结果如图5b所示。蓝色的光子晶体水凝胶表面的宏观结构色的色相值从0mM葡萄糖溶液时对应的173°逐渐变化为26.4mM葡萄糖溶液时对应的62°，结合色相值示意图(图3)，这说明颜色发生了红移，色相值变化幅度为111°，从而证明了光子晶体水凝胶的葡萄糖可视化检测能力。

将以上光子晶体水凝胶从高浓度的葡萄糖溶液浸泡回低浓度的葡萄糖溶液直至浸泡在纯水中，光子晶体水凝胶的宏观颜色从绿色转变回蓝色(图5a)，颜色发生蓝移，其色相值、数据与由低到高浓度葡萄糖溶液浸泡时得到的数据可逆吻合(图5b)，这验证了该水凝胶对葡萄糖具有良好的可逆响应性。

(2)类似的，使用粒径270nm的二氧化硅微球制备了绿色结构色的光子晶体和双网络光子晶体水凝胶，并采用绿色结构色的双网络光子晶体水凝胶进行实验，水凝胶样品对不同浓度的葡萄糖溶液的可逆响应性结果如图6所示。

由图6可以看到，绿色结构色的光子晶体水凝胶浸泡在由低到高浓度的葡萄糖溶液中足够的时间后，也出现了颜色红移现象(图6a)。其反应原理与上述蓝色光子晶体水凝胶类似。进一步的，对得到的图片结果进行色相值分析，结果如图6b所示。绿色的光子晶体水凝胶表面的宏观结构色的色相值从0mM葡萄糖溶液时对应的160°逐渐变化为26.4mM葡萄糖溶液时对应的-70°(图6b)，颜色发生了红移，色相值变化幅度为230°，进一步证明了光子晶体水凝胶的葡萄糖可视化检测能力。

进一步的，将以上光子晶体水凝胶从高浓度的葡萄糖溶液浸泡回低浓度的葡萄糖溶液直至浸泡在纯水中，光子晶体水凝胶的宏观颜色从红色转变回绿色(图6a)，颜色发生蓝移，其色相值的数据与由低到高浓度葡萄糖浸泡时得到的数据可逆吻合(图6b)，进一步验证了该水凝胶对葡萄糖具有良好的可逆响应性。

上述实验中，在从低到高浓度的葡萄糖溶液中反应时，绿色光子晶体水凝胶的色相值变化范围230度比蓝色光子晶体水凝胶的色相值变化范围111度更大，更有利于可视化读出与测试。

5、双网络光子晶体水凝胶的可逆响应的重复性测试

以蓝色结构色的光子晶体水凝胶为例，将其在浓度分别为0mM、6.6mM、13.2mM、19.8mM、26.4mM的葡萄糖溶液中反复浸泡，以验证其葡萄糖响应性的重复性和稳定性，在过程中对光子晶体水凝胶的色相值进行记录，结果如图7所示。在每次循环浸泡过程中，该光子晶体水凝胶表面的宏观结构色从173°逐渐降低至62°，然后升至173°；并且在8次循环反应后，色相值变化基本稳定。以上结果表明该水凝胶的可逆响应具有稳定性，该水凝胶可以重复使用，以实时监测葡萄糖的浓度变化。

6、双网络光子晶体水凝胶和单网络光子晶体水凝胶的响应性对比

为了对比单网络和双网络光子晶体水凝胶的响应时间，分别制备了不同光子晶体水凝胶，并测试其响应时间，具体包括：

利用粒径240nm的二氧化硅微球制备了蓝色结构色的光子晶体和单网络光子晶体水凝胶，并将单网络光子晶体水凝胶浸泡在26.4mM的葡萄糖溶液中，观察其颜色随时间的变化。

利用粒径240nm的二氧化硅微球制备了蓝色结构色的光子晶体和双网络光子晶体水凝胶，并将双网络光子晶体水凝胶浸泡在26.4mM的葡萄糖溶液中，观察其颜色随时间的变化。

如图8所示，双网络光子晶体水凝胶在浸泡十五分钟后完成反应，随后其色相值稳定、不再发生改变，而单网络光子晶体水凝胶则需要30分钟才能完成反应，30分钟之后其色相值不在发生改变。其原因在于，双网络光子晶体水凝胶中，由于葡萄糖响应性水凝胶所占的体积比更大(图4)，因此比单网络光子晶体水凝胶的响应性更快。

实施例2双网络光子晶体水凝胶的体内葡萄糖响应性测试

采用C57小黑鼠，利用链脲佐菌素构建糖尿病小鼠的模型，诱导出不同体内血糖水平(体内血糖水平分别为8.3mM、16.4mM、25.7mM)的小鼠。对小鼠后背进行脱毛处理，用打孔器在小鼠背部打孔，获得直径为五毫米的伤口。使用粒径270nm的二氧化硅微球制备绿色结构色的光子晶体和双网络光子晶体水凝胶，将制备的绿色结构色的双网络光子晶体水凝胶具有结构色的一面覆盖在伤口表面上，并用透明敷贴固定。十五分钟后取下，观察并记录光子晶体水凝胶的颜色变化。

小鼠的伤口模型试验如图9a所示。使用绿色光子晶体水凝胶进行试验得到的结果如图9b所示。可以观察到绿色光子晶体的颜色发生了明显的红移，这验证了光子晶体水凝胶在生物体上的响应性效果。在血糖值为8.3mM的小鼠伤口上，光子晶体水凝胶的色相值为147°，当小鼠体内血糖升高至25.7mM时，光子晶体水凝胶的色相值逐渐降低为107°(图9c)，色相值变化幅度为40°，验证了光子晶体水凝胶在生物体上的响应性效果。

需要指出的是，小动物皮肤表面的渗出液较少，因此参与反应的液体不如葡萄糖水溶液中那么充分，因此，体内实验中血糖检测的效果没有在葡萄糖溶液中的检测效果明显。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。