NBG3BP1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及NBG3BP1基因在调控植物抗双生病毒中的应用、转基因植物培育方法。

背景技术

双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链环状DNA病毒，主要在热带、亚热带地区侵染粮食作物、经济作物和观赏植物。基于基因组结构、寄主范围和传播介体，国际病毒分类委员会将双生病毒科分为14个属，其中菜豆金色花叶病毒属是双生病毒科中最大的属，包含了400多种，严重危害番茄、烟草、大豆、棉花和木薯等重要的经济作物。使用抗病品种是控制双生病毒最经济、有效的手段。目前已从醋栗番茄等野生番茄资源中鉴定到抗番茄黄化曲叶病毒的基因/位点，包括Ty-1/3、Ty-2、Ty-4、Ty-5和Ty-6，但是鉴于双生病毒种类多，且自然界中病毒的复合侵染频繁发生，有些抗性基因无法赋予植物对多种双生病毒的抗性。例如，Ty-3介导的对番茄黄化曲叶病毒的抗性能够被双生病毒伴随的beta卫星所克服。因此，亟需挖掘能够对多种双生病毒具有抗性的寄主因子并加以改造利用。

截至2021年底，我国已发现的菜豆金色花叶病毒双生病毒的种类有86种，其中番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是我国发生分布最广、造成的危害最大的双生病毒。TYLCV是单组分双生病毒，基因组为单链环状DNA，能够系统侵染番茄、烟草等作物，引起叶片卷曲、植株矮化和产量下降。我国发生的约40％的单组分双生病毒，如TYLCCNV(tomato yellow leaf curl China virus)，还伴随有一类卫星分子，称为beta卫星，beta卫星是这类单组分双生病毒诱导产生典型的病害症状所必需的。TLCYnV(tomato leaf curl Yunnan virus)是由TYLCCNV和其它未知病毒重组产生的单组分双生病毒，与TYLCCNV不同的是，TLCYnV单独侵染植物就能够诱导产生典型的叶片上卷等症状。因此，挖掘抗双生病毒侵染的寄主因子并评估其对我国发生的三种不同类型的双生病毒的抗性对于加快抗双生病毒的分子育种工程，有效控制双生病毒的侵染具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供NbG3BP1基因在调控植物抗病毒中的应用。

本发明的第二目的是提供一种NbG3BP1基因高表达本氏烟植物的培育方法。

本发明发现了本氏烟NbG3BP1对TYLCV侵染具有抗性，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将NbG3BP1基因导入目的植物中，获得的NbG3BP1高表达植株具有稳定的抗病毒特性，可以有效控制TYLCV的危害，同时也能显著抑制TYLCCNV和TLCYnV的侵染，有利于后续科学研究和田间应用。

具体的，本发明采用的技术方案具体如下：

NbG3BP1基因在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述病毒为TYLCV、TYLCCNV和TLCYnV；所述NbG3BP1基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。

具体的，是通过农杆菌介导的遗传转化方法，将带有绿色荧光蛋白的NbG3BP1-GFP载体导入目的植物中，获得的NbG3BP1高表达植物能够显著减轻TYLCV、TYLCCNV和TLCYnV的侵染。

一种抗多种双生病毒的NbG3BP1转基因植物的培育方法：通过农杆菌转化的方法，将NbG3BP1基因导入目的植物中，获得本氏烟NbG3BP1基因高表达植物。

具体包括以下步骤：

(1)利用Trizol法从本氏烟植株叶片中抽提RNA，通过反转录获得cDNA；

(2)使用引物对NbG3BP1-F与NbG3BP1-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA为模板进行PCR扩增，克隆得到NbG3BP1，所使用的引物序列为：

NbG3BP1-F：CCTTAATTAACATGGCGAGCTCTTACTCTGCT

NbG3BP1-R：TTGGCGCGCCCTATACCACGAAAGCCGTTGC

(3)将NbG3BP1构建到带有绿色荧光标签的载体上，获得NbG3BP1-GFP重组质粒；

(4)将1μL重组质粒与100μL农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置电击转化，向电击后的感受态细胞中加入无抗培养基，恢复培养两小时后涂布到相应抗性的培养基上筛选获得带有NbG3BP1-GFP重组质粒的农杆菌；

(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(6)继续培养的小苗生长稳定后，利用CTAB法抽提植物叶片中的DNA；使用引物对35S-F与NbG3BP1-R，如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，确定重组质粒NbG3BP1-GFP是否成功转化；所使用的引物序列为：

35S-F：CCTTCGCAAGACCCTTCCTC

NbG3BP1-R：TTGGCGCGCCCTATACCACGAAAGCCGTTGC；

对以上植物样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，使用GFP抗体进行Westernblot确定植物表达了带绿色荧光标签的NbG3BP1-GFP重组质粒；对以上阳性烟草植株留种。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

本发明克隆了本氏烟中NbG3BP1基因，通过生物信息学分析和分子生物学实验确定G3BP1对番茄黄化曲叶病毒侵染具有抗性，通过农杆菌介导的遗传转化，将NbG3BP1基因导入目的植物中，获得NbG3BP1高表达转基因植物。获得的NbG3BP1转基因植物能够显著抑制TYLCV的侵染，同时也能显著抑制TYLCCNV和TLCYnV的侵染，有利于后续科学研究和田间应用。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的NbG3BP1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。

附图说明

图1为NbG3BP1-GFP载体构建及表达鉴定。其中(A)NbG3BP1-GFP载体构建示意图，CaMV 35S promoter为花椰菜花叶病毒35S启动子，能够启动下游融合基因NbG3BP1(克隆的目的基因)-GFP(绿色荧光蛋白)的表达，NOS为转录终止位点；(B)NbG3BP1-GFP农杆菌浸润RFP-H2B(细胞核发出红光，用于作为细胞核定位的标记基因)转基因本氏烟48小时，通过激光共聚焦观察NbG3BP1-GFP荧光，Merge栏为GFP、RFP与明场的叠加；(C)NbG3BP1-GFP农杆菌浸润本氏烟，48小时后提取总蛋白，Western blot分析本氏烟叶片中的NbG3BP1-GFP表达量，Mock为野生型本氏烟，Ponceau S用于表示上样量的水平。

图2为NbG3BP1-GFP转基因植物的鉴定。其中，(A)T1代NbG3BP1-GFP转基因植物与野生型本氏烟植物表型对比，WT为野生型本氏烟，NbG3BP1-OE-1与NbG3BP1-OE-4为NbG3BP1-GFP转基因本氏烟的两个不同株系；(B)Western blot分析来自于WT野生型本氏烟、NbG3BP1-GFP转基因不同株系植物叶片中的蛋白表达量，Ponceau S用于表示上样量的水平。

图3为NbG3BP1-GFP转基因植物对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性分析。其中，(A)TYLCV接种野生型本氏烟及NbG3BP1-GFP转基因不同株系10天的症状图；(B)qPCR分析TYLCV接种野生型本氏烟及NbG3BP1-GFP转基因不同株系10天系统叶片病毒DNA积累量，结果显示NbG3BP1-GFP转基因植物能显著降低TYLCV病毒积累量；(C)Western blot检测TYLCV接种野生型本氏烟及NbG3BP1-GFP转基因不同株系10天系统叶病毒外壳蛋白(CP)的积累量，Ponceau S用于表示上样量的水平。结果显示NbG3BP1-GFP转基因植物能够明显降低TYLCV的外壳蛋白积累量。

图4为NbG3BP1-GFP转基因植物对TYLCCNV和TLCYnV的抗性分析。其中，(A)和(C)为TYLCCNV(A)和TLCYnV(C)接种野生型本氏烟及NbG3BP1-GFP转基因不同株系7天(A)和12天(C)的症状图；(B)和(D)为qPCR分析TYLCCNV(B)和TLCYnV(D)接种野生型本氏烟及NbG3BP1-GFP转基因不同株系7天(B)和12天(D)系统叶片病毒DNA积累量，结果显示NbG3BP1-GFP转基因植物能显著降低TYLCCNV和TLCYnV病毒积累量。

具体实施方式

如无特殊说明，本发明所提供的实施例均按照常规实验条件进行。

一种抗多种双生病毒的NbG3BP1转基因植物的培育方法，具体为：

(1)获得本氏烟植株，利用Trizol法从本氏烟植株叶片中抽提RNA，通过反转录获得cDNA。

(2)使用引物对NbG3BP1-F与NbG3BP1-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经纯化后得到NbG3BP1，所使用的引物序列为：

NbG3BP1-F：CCTTAATTAACATGGCGAGCTCTTACTCTGCT

NbG3BP1-R：TTGGCGCGCCCTATACCACGAAAGCCGTTGC

(3)将纯化的NbG3BP1片段构建到带有绿色荧光标签的载体上，获得NbG3BP1-GFP重组质粒。图1A为载体构建的示意图，该载体包含CaMV 35S promoter：花椰菜花叶病毒35S启动子，能够启动下游融合基因NbG3BP1-GFP表达，NOS为转录终止位点。

(4)将1μL重组质粒与100μL农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2400V电击转化，向电击后的感受态细胞中加入无抗LB培养基，恢复培养两小时后涂布到含有卡那霉素和利福平抗性的LB培养基上，筛选获得带有NbG3BP1-GFP重组质粒的农杆菌。

(5)挑取阳性单菌落转入卡那霉素和利福平抗性的液体培养基中，28℃震荡培养过夜，菌液经离心后收集菌体，用浸润缓冲液(含10mM MgCl

(6)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养。

(7)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，利用CTAB法抽提DNA；利用引物对35S-F与NbG3BP1-R，如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，确定转基因植物中转入了外源NbG3BP1-GFP的转录本。

35S-F：CCTTCGCAAGACCCTTCCTC

NbG3BP1-R：TTGGCGCGCCCTATACCACGAAAGCCGTTGC

(8)对以上样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Westernblot确定植物表达了带绿色荧光标签的NbG3BP1-GFP重组质粒，如图2B所示，NbG3BP1-OE-1与NbG3BP1-OE-4均能检测到NbG3BP1-GFP蛋白，对以上阳性烟草植株留种。

(9)播种本氏烟野生型及NbG3BP1-GFP转基因植物2个不同株系NbG3BP1-OE-1与NbG3BP1-OE-4。待植物长到4-5叶期，如图2A所示，分别接种TYLCV。接种10天后观察病毒症状，如图3A所示，与对照相比，NbG3BP1-GFP转基因植物两个株系表现出的病毒症状更轻。提取系统侵染叶的总DNA，通过qPCR检测病毒积累量，转基因两个株系的病毒积累量显著低于野生型本氏烟，如图3B所示。提取系统侵染叶的总蛋白，通过Western blot检测TYLCV接种病毒外壳蛋白的积累量，如图3C所示。结果显示，NbG3BP1-GFP转基因植物能够明显降低TYLCV的蛋白积累量。

(10)为测试NbG3BP1-GFP转基因植物株系NbG3BP1-OE-1与NbG3BP1-OE-4对其他双生病毒是否具有抗性，播种种子待植物长到4-5叶期，如图2A所示，分别接种TYLCCNV和TLCYnV。接种7天或12天后观察病毒症状，如图4A和图4C所示，与对照相比，NbG3BP1-GFP转基因植物两个株系表现出的病毒症状更轻。提取系统侵染叶的总DNA，通过qPCR检测病毒积累量，转基因两个株系的病毒积累量显著低于野生型本氏烟，如图4B和4D所示。结果显示NbG3BP1-GFP转基因植物能够明显抑制TYLCCNV和TLCYnV的侵染。

上述实验结果表明：通过农杆菌介导的遗传转化方法获得的本氏烟NbG3BP1过表达植物能够显著减轻番茄黄化曲叶病毒的侵染，抑制番茄黄化曲叶病毒造成的病害，同时NbG3BP1过表达植物对包括TYLCCNV和TLCYnV在内的多种双生病毒具有广谱抗性。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。