一种含磷脂样品中快速光催化分解磷脂的原位质谱检测方法

技术领域

本发明原位质谱反应领域，尤其涉及一种含磷脂样品中快速光催化分解磷脂的原位质谱检测方法。

背景技术

原位质谱是利用不同的电离采样技术实现在样品表面进行原位检测的质谱技术，如基质辅助激光解析电离质谱、二次离子质谱、解析电喷雾质谱、激光辅助电喷雾电离质谱、实时直接分析质谱、原位液体萃取质谱等。这些电离采样技术虽然可实现实时原位快速检测以及较高的空间分辨能力，但复杂生物组织样品中存在很强的基质效应。例如，在组织样品中原位分析脂质组的含量时，由于脂质的种类繁多，其中高丰度的结构性脂质磷脂由于在组织内高的含量和高的电离能力将极大的抑制低丰度的鞘脂和糖脂以及甘油酯的电离和检测。因此，原位质谱的检测覆盖率和检测灵敏度都不高。

为解决以上问题，原位质谱需要采用非破坏性的样品前处理方法，如组织选择性印记、在组织衍生反应、在组织分解反应等方法来实现微区内高丰度基质(如磷脂)的去除分解或分析物的标记衍生。但这些手段需要较长时间的样品前处理，会增加人工操作的误差、分析物的分解、空间分布上的移位等。而原位液体萃取-质谱技术由于是在样品表面的采样技术因而具有更高的灵活性，易于实现在质谱电离与采样之间的在线反应、吸附富集分离以及加标等过程，通过这些快速在线过程在原位萃取-质谱检测体系中的引入，有希望无需任何样品前处理过程来实现原位质谱检测覆盖率和灵敏度的提高。但这些化学过程必须满足三个重要条件：1.化学过程，如吸附分离或衍生、分解反应的动力学速率要很高；2.化学过程的溶剂环境必须温和，与原位液体萃取以及质谱电离过程相兼容。3.在复杂的样品组成中，化学过程需对目标物质具有较高选择性。

光催化反应是利用光催化材料在特定波长光的照射下产生光生空穴与电子可有效的催化氧化还原反应而产生的新型反应。他具有绿色温和的反应条件、快速的反应动力学、由光催化材料带来的高选择性以及可进行光控的特性。因此，将光催化反应引入原位液体萃取-质谱系统中来实现快速在线的分解高丰度基质将极大程度的减小复杂样品表面的离子抑制和基质效应，提高原位质谱的检测覆盖范围和灵敏度，但目前还未有此类方法报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种含磷脂样品中快速光催化分解磷脂的原位质谱检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种含磷脂样品中快速光催化分解磷脂的原位质谱检测方法，包括以下步骤：

(1)对待测含磷脂样品进行原位萃取，得到原位液体萃取体系；

(2)在原位液体萃取体系的传输管路中原位合成含二氧化钛整体材料，并在整体材料位置进行紫外光辐射；

(3)在原位液体萃取体系的溶剂中加入无机酸水溶液，利用原位液体萃取探针对待测含磷脂样品表面进行原位微区萃取；

(4)萃取溶液在线通过含二氧化钛整体材料的被紫外光辐射的传输管，并直接进入质谱进行检测。

优选的，所述含磷脂样品为含有磷脂的待检测生物样品，所述磷脂为含有磷酸基团亲水头的脂质；更优选的，所述磷脂包括乙酰胆碱磷脂。乙酰胆碱磷脂在待检测的复杂生物样品中含量最高、电离能力最强，最需要分解去除。

本申请提供的一种含磷脂样品中快速光催化分解磷脂的原位质谱检测方法，针对目前含磷脂的生物材料容易受磷脂成分影响的问题，本申请的原位质谱检测方法中设计光催化分解步骤，针对磷脂成分进行选择性快速分解；原为液体萃取体系中的溶剂中添加无机酸水溶液，在酸性水溶液的配合下，利用含二氧化钛整体材料中二氧化钛的分解以及选择性吸附作用，提升对磷脂的动态分解效率，从而提升原位质谱检测方法对待测生物样品中代谢物、内源性小分子等其它组分的检测精度。

优选的，所述整体材料为以整体形式存在于毛细管中的多孔凝胶网络

优选的，所述含二氧化钛整体材料为以二氧化钛为基体的煅烧过的整体材料和/或包埋二氧化钛纳米颗粒的整体材料。

整体材料必须含有包埋的二氧化钛颗粒或者本身以二氧化钛为基体且经过煅烧，二氧化钛的光催化性能以及对磷脂的选择性吸附作用对于快速光催化分解磷脂起到了决定性的作用。

优选的，所述包埋二氧化钛纳米颗粒的整体材料的基体为无机二氧化钛整体材料或无机二氧化硅整体材料，所述包埋的二氧化钛纳米颗粒为煅烧过的二氧化钛纳米颗粒，所述煅烧晶型包括锐钛矿和/或金红石，所述煅烧的二氧化钛纳米颗粒包括二氧化钛或二氧化钛颗粒与金属、非金属元素掺杂的复合物；所述二氧化钛纳米颗粒直径小于50nm。

优选的，所述紫外光为或包含有200-300nm波长的光，所述紫外光采用汞灯、氙灯或激光器产生。

优选的，所述原位液体萃取体系的溶剂为甲醇、乙腈、乙醇或丙醇极性溶剂中的至少一种。

优选的，所述无机酸水溶液为浓度为0-0.03mol/L的盐酸或硫酸水溶液，无机酸水溶液的加入量为有机溶剂中占5％-20％(v/v)。

优选的，所述无机酸水溶液为硫酸水溶液，所述有机溶剂为甲醇。硫酸水溶液以及甲醇对于选择性快速光催化分解磷脂有着更进一步的协同效果，能够大大提升分解效率。

优选的，所述原位微区萃取为向原位液体萃取探针不断泵入萃取液，原位液体萃取探针与质谱离子源相连，通过质谱离子源喷嘴的真空度将萃取液连续不断抽吸入质谱，在探针尖端形成液节点，液节点与含磷脂样品表面接触时实现萃取；所述原位液体萃取探针包括毛细管内外套管、双孔石英管、鹅形管或折管中至少一种，所述质谱离子源包括电喷雾电离源或大气压化学电离源。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明首次提出通过二氧化钛光催化作用选择性快速去除原位质谱采样过程中复杂生物样品中高含量磷脂基质的方法。相比于没有光催化分解的原位质谱系统而言，低丰度的甘油酯、糖脂和鞘脂的检测覆盖种类提高了3-20倍。

(2)与传统的二氧化钛吸附作用除磷脂的方法相比：首先，光催化分解不受二氧化钛吸附容量限制，理论上可无限长时间连续不间断的去除磷脂，尤其适用于质谱成像这种需要长时间不间断检测的要求；其次，由于光催化实时分解吸附到二氧化钛整体材料表面的磷脂，二氧化钛材料无需洗脱磷脂回收利用，不存在材料表面磷脂的交叉污染。

(3)本发明优选了添加硫酸的水溶液作为磷脂光催化分解的溶剂环境，此溶剂比其他酸性溶剂(盐酸或甲酸)环境的在线分解效率提高了5-10倍。同时采用了包埋二氧化钛纳米颗粒的整体毛细管进行光催化，提高了二氧化钛与溶液的接触面积，使得磷脂溶液以3μL/min的流速实时经过二氧化钛毛细管便可实现80％以上的分解效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明光催化反应原理图；

图2为本发明二氧化钛整体材料的扫描电镜图(A)以及Ti元素(B)和Si元素(C)在截面的空间分布电子能谱图和显微镜图(D)；

图3为本发明原位质谱系统的六通阀切换采样体系和质谱进样体系的连接示意图；

图4为实施例1采用不同溶剂组成环境进行在线光催化反应对磷脂(PC(34:1))的分解效率柱状图；

图5为实施例1采用最优溶剂环境将各个脂质通入TiO

图6为实施例2中利用最优在线分解条件进行实际脑组织样品的原位液体萃取-在线光催化分解-质谱检测后得到的脑组织质谱图(A)与传统原位质谱方法的脑组织质谱图(B)的对比及显示两种方法测得的脂质种类数目的韦恩图(C)；CB表示脑苷脂；Cer表示神经酰胺；DG表示甘油二酯；TG表示甘油三酯；PC表示乙酰胆碱磷脂；LPC表示乙酰胆碱溶血磷脂；SM表示乙酰胆碱鞘磷脂；

图7为实施例3中利用最优在线分解条件进行大鼠小脑的原位液体萃取-在线光催化分解-质谱成像的成像图(A)与传统质谱成像方法的脑组织质谱成像图(B)的对比；CB表示脑苷脂；Cer表示神经酰胺；PC表示乙酰胆碱磷脂。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

如图1，本发明磷脂的选择性光催化分解反应原理分为以下几步：1.煅烧后的二氧化钛纳米材料在酸性条件下对含有磷酸基团的脂质的选择性吸附作用使得磷脂特异性的吸附在二氧化钛表面；2.在紫外光的照射下二氧化钛会吸收紫外光，从而外层电子被激发，越过禁带进入导带，从而形成空穴-电子对。在水溶液环境中，水中的氧以及高价态的酸吸收电子而产生OH自由基，水被空穴氧化也产生OH自由基。3.被吸附在二氧化钛表面的磷脂首先被产生的具有氧化活性的OH自由基所氧化分解为高价态的脂肪酸、甘油醛以及磷酸等小分子，并进一步氧化分解。而溶液中高价钛溶解氧或无机酸水溶液被还原为水或低价态酸等。而其他脂质由于无法吸附到二氧化钛表面而难以被光分解，从而使得二氧化钛可以选择性的催化磷脂分解。

本发明一个具体实施方式的用于一种含磷脂样品中快速光催化分解磷脂的原位质谱检测方法，包括下述的步骤：

S1.煅烧的二氧化钛纳米颗粒包埋的整体材料毛细管的制备

首先采用1mol/L NaOH水溶液在60℃下对熔融石英毛细管(100μm内径,170μm外径)进行活化1小时。活化的石英毛细管分别用水和乙醇清洗60分钟和10分钟。最后，将活化的石英毛细管在氮气下常温干燥10min，再在60℃烘箱中干燥2h。

TiO

最终得到的整体材料毛细管的电镜图如图2所示，其中二氧化钛整体材料的扫描电镜图为图A，Ti元素的电子能谱图为图B，Si元素的电子能谱图为图C，显微镜图为图D。

S2.引入在线光催化分解过程的原位液体萃取-质谱系统的搭建

原位质谱系统中六通阀切换采样体系和质谱进样体系的连接示意图如图3所示。原位液体萃取探针固定在三轴平台的z轴平台上，而样品固定在xy轴平台上，通过三轴移动来控制定位探针与样品之间的位置关系。当原位液体萃取系统与质谱直接相连时，原位微液结点采样-质谱技术是通过向采样探针不断泵入萃取液，同时通过质谱离子源喷嘴的真空度将萃取液连续不断的抽吸入质谱，在探针尖端形成液节点，液节点与样品表面接触时实现萃取。采用显微摄像头实时观察探针与样品表面形成的液节点。在探针出口与质谱之间连接的毛细管为二氧化钛整体材料毛细管。当原位液体萃取系统通过六通阀与质谱相连时，探针出口与接有定量环的六通阀相连，六通阀再与真空泵相连。通过真空泵将萃取液连续不断的抽吸入定量环，在探针尖端形成液节点。六通阀切换使定量环在采样体系与质谱进样体系之间切换。二氧化钛整体材料在六通阀与质谱入口之间的传输管路中原位合成。采样探针可以是毛细管内外套管、双孔石英管、鹅形管或折管等。质谱离子源可以是电喷雾电离源或大气压化学电离源等。

其中煅烧的二氧化钛纳米颗粒可以是纯TiO

所述二氧化钛开管毛细管内径需<300μm，优选100μm。

在进行步骤S2的装置搭建后，进行下述的检测步骤：

S3.基于光催化分解磷脂的原位液体萃取-质谱检测

以一定比例的硫酸或盐酸水溶液和甲醇的混合溶液为萃取液采用原位液体萃取微采样技术将样品微小区域中的分析物萃取至溶剂中，然后通过质谱或真空泵负压将提取液抽入二氧化钛整体材料毛细管中，在检测时，二氧化钛整体柱管在紫外光的照射下，使得提取出的分析物在管内经历紫外光照，再在线进入质谱中。

紫外光波长可以是200-400nm，优选200-300nm，更优选250nm。采用紫外灯照射需要毛细管整体材料反应管保持一定照射距离，照射距离主要影响光的单位面积功率，最优距离与紫外灯单位面积光强有关。所用紫外灯并无限制，例如可以是任何产生200-400nm通带或单一波段的光的汞灯、氙灯或者是紫光光区的激光器等。

原位检测可以是采用上述原位质谱技术在样品单个点上进行原位质谱检测，也可以采用原位质谱技术扫描样品表面的一定面积进行检测。还可以对一定面积进行逐点扫描检测得到成像结果。

扫描成像指的是采用具有空间分辨能力的原位质谱技术对样品表面的每个像素点进行逐一采样电离，最后将每个像素点的信号重组成分析物在不同样品空间位置上的信号，从而得到不同分析物的信号成像图。

采样探针扫描的速度为0-1000μm/s，在这个速度范围内探针形成的微液结点才稳定，微液结点始终保持恒定的液结点覆盖面积且无气泡产生。

以下通过实施例对本发明做进一步的介绍。

实施例1：不同溶剂条件下的在线光催化磷脂分解

1)脂质标样溶液的配置：将PC(34:1)、Cer(d18:1/18:0)、GlcCer(d18:2/16:0)、DG(16:0/16:1)和SM(18:0/20:2)几种脂质单标溶解在0.003M/0.01M/0.03M硫酸-10％水甲醇、0.003M/0.01M/0.03M盐酸-10％水甲醇、0.01M硫酸-0％/5％/10％/20％水-甲醇、0.01M硫酸10％水-乙腈溶液中，得到各个脂质浓度为10ng/mL的混标溶液。

2)光催化分解磷脂过程：将不同溶剂组成的混标溶液以3μL/min的流速泵入整体材料毛细管，同时对毛细管进行紫外光照射(汞灯，200-400nm)。将毛细管末端通过接有定量环的六通阀与质谱相连，六通阀切换使定量环在整体材料毛细管体系与质谱进样体系之间切换，使得整体材料中流出的溶液被收集在定量环中，通过阀切换进样与质谱入口进行检测。

3)质谱分析参数：质谱检测条件为：质谱为电喷雾离子源-离子阱串联飞行时间质谱(IT-TOF，岛津公司，日本)。离子源在正负离子切换模式下工作，喷雾针所加电压为正离子模式4500V，负离子模式3000V，离子源温度200℃，雾化气体(N

4)结果分析：通过将从紫外光照的整体材料毛细管流出的脂质信号(Se)与未经过整体材料毛细管的脂质信号(Ss)进行对比，就可以得到磷脂(PC(34:1))在整体材料中动态光分解的效率，公式如下：

E＝(Ss-Se)/Ss

最终得到不同溶剂组成环境进行在线光催化反应对磷脂(PC(34:1))的分解效率柱状图如图4。从结果可以看出，酸性水溶液均能起到一定的光催化反应分解磷脂的效果，硫酸溶液比盐酸溶液具有更高对磷脂的光分解效率。同时，溶液中的水含量也对光分解有很大的影响，完全没有水的溶液无法实现明显的光分解效果。而不同性质的有机溶剂也对光分解效率有影响，质子溶剂甲醇中的光分解效率高于非质子溶剂乙腈。

同时，其他的低电离能力的脂质在经过毛细管前后的信号值也在图5中进行了比较，其中CB表示脑苷脂；Cer表示神经酰胺；DG表示甘油二酯；PC表示乙酰胆碱磷脂；SM表示乙酰胆碱鞘磷脂。从结果可见，大部分的其他脂质在光分解前后的质谱信号都没有明显的下降。低电离能力的脂质，如糖脂(GlcCer(d18:2/16:0))和甘油酯(DG)，在光分解后的信号甚至远高于光分解前，这说明这些脂质在光分解前由于溶液中存在的磷脂PC而受到了很大的电离抑制，而在光分解磷脂后，由于磷脂的去除而消除了对他们的电离抑制，使得信号提高。

实施例2：基于在线光催化分解的小鼠大脑组织原位液体萃取-质谱分析

1)小鼠大脑组织处理：用冰冻切片机将小鼠大脑组织切为厚度为10μm薄片，然后热裱到玻璃板上，并将切片放入干燥器中备用。

2)基于在线光催化分解的原位液体萃取-质谱分析：整个原位质谱装置如图2所示，将组织切片固定在xy轴样品台上。原位液体萃取系统通过六通阀与质谱相连。具体的装置结构在前面已经描述。这里萃取液为10％0.01M H

3)质谱仪器参数设置：同实施例1。

4)结果分析：从得到的经过在线光分解的大脑组织质谱图与未经过在线光分解的大脑组织质谱图进行对比，如图6所示。A为原位液体萃取-在线光催化分解-质谱检测后得到的脑组织质谱图，B为传统原位质谱方法的脑组织质谱图。从结果可以看出，为经过在线光分解的大脑组织质谱图中大部分都是磷脂峰和溶血磷脂峰。而经过光分解后的大脑组织质谱图中出现大量的脑苷脂、乙酰胆碱鞘磷脂、甘油酯和神经酰胺等脂质。如图6中两种方法测得的脂质种类数目的韦恩图C所示，新方法将糖脂的检测数量提高了20倍，神经酰胺和甘油酯的检测数量提高了3倍。

实施例3：基于在线光催化分解的大鼠小脑组织原位液体萃取-质谱成像

1)大鼠小脑组织处理：用冰冻切片机将大鼠小脑组织切为厚度为20μm薄片，然后热裱到玻璃板上，并将切片放入干燥器中备用。

2)基于在线光催化分解的原位液体萃取-质谱成像：原位质谱成像装置如图2。成像过程中探针在小脑组织上进行15*20个像素点的扫描，而探针在点与点之间的移动速度为200μm/s，探针直径与探针步进均为200μm。每个像素点停留17s。其他实验条件同实施例1。

3)质谱仪器参数设置：同实施例1。

4)成像数据的处理：探针以Z字形路径逐点扫描形成15*20个点的矩阵。扫描的过程中质谱进行信号采集，最终得到的质谱信号根据探针行驶路线还原成空间位置对应的物质信号高度，最终重组成成像图。成像图结果如图7所示：原位液体萃取-在线光催化分解-质谱成像的成像图(A)与传统质谱成像方法的脑组织质谱成像图(B)的对比；CB表示脑苷脂；Cer表示神经酰胺；PC表示乙酰胆碱磷脂。

5)结果分析：从结果可以看出，大部分糖脂、神经酰胺和鞘脂在有在线光分解的成像体系中的质谱成像图都具有更高的信号和更清楚的空间分布，如神经酰胺m/z548.3300、糖脂m/z810.667、m/z792.667、806.665、812.6700等。且有一些糖脂在无光分解的成像体系中还会受到临近磷脂信号分布的影响而无法得到真实的分布，如糖脂m/z808.667。