类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系及试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体检测技术领域，尤其涉及类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系及试剂盒。

背景技术

类风湿因子(rheumatoid factor,RF)是首先在类风湿性关节炎上发现的自体抗体，是诊断类风湿性关节炎的重要标准之一。其针对变性IgG的FC的不同部分，它与IgG结合后，形成免疫复合体，进一步促成疾病的形成。类风湿因子可以是一种冷凝球蛋白(一种在血液样本冷却时会沉淀析出的抗体)，也可以是第二型(单株IgM到多株IgG)或第三型(多株IgM到多株IgG)的冷凝球蛋白。虽然类风湿因子主要以IgM形式存在，但也包括任何一个同种型的免疫球蛋白，如IgA，IgG，IgM，IgE或IgD。

目前，类风湿因子检测试剂盒所运用的检测方法主要包括普通免疫比浊法、胶乳增强免疫比浊法以及酶联免疫法(ELISA)等。而免疫比浊法由于其测定自动化，速度快，结果准确，重复性好等优点被国内外广泛应用。而当前试剂盒里质控品、校准品中的抗体一般通过两种途径得到，分别为动物腹水免疫提取和天然血液中提取。但天然血液中提取的类风湿因子来源少，价格极其昂贵，普通的试剂盒无法控制成本，也无法保证生化常规检测试剂盒的大量供应。因此较常用动物腹水提取，且一般是小鼠腹水。又类风湿因子的种类较多，其主要类型为IgM亚型的抗体，但IgM亚型的单抗提取困难，不易纯化，里面含有杂蛋白，且倾向于由单体变为多聚体，因而其IgM亚型抗体的液体储存稳定性(尤其是低浓度的蛋白)较差，放置一段时间后，其与试剂里的抗原反应度会有较大的变化，从而极大地影响了试剂的性能，导致试剂的准确度降低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系及试剂盒，以提高抗体的储存稳定性，从而提高试剂盒的检测准确度。

为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系，包括如下组分：第一缓冲液、第二缓冲液、无机盐离子、第一稳定剂、第二稳定剂、第三稳定剂、第一表面活性剂及防腐剂，溶剂为纯化水；

所述第一缓冲液选自Tris，磷酸盐，Mops，氨基乙酸，柠檬酸盐，MES，HEPPS，PIPES，Bicine，CHES，CAPS中的至少一种，所述第一缓冲液的浓度为30-200mmol/L；

所述第二缓冲液为甘氨酸，所述第二缓冲液的浓度为50～200mmol/L；

所述第一表面活性剂为TWEEN 20，NP40及TriTonX-100中的至少一种。

其进一步地技术方案为，第一缓冲液与第二缓冲液的比例为摩尔浓度1：1，在该比例下既能满足在所需pH缓冲范围内的缓冲能力，又能充分起到一个稳定体系的作用。

其进一步地技术方案为，所述类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系还包括第二表面活性剂，所述第二表面活性剂为CE510和CE210中的至少一种。

其进一步地技术方案为，所述第二表面活性剂的浓度为0.5-3g/L。

其进一步地技术方案为，所述第一表面活性剂的浓度为0.5-3g/L。

其进一步地技术方案为，所述第一稳定剂为蔗糖，葡萄糖，海藻糖，甘露醇，山梨醇，木糖醇，丙三醇中的至少一种，所述第一稳定剂的浓度为10-50g/L。

其进一步地技术方案为，所述第二稳定剂为BSA，小牛血清，酪蛋白中的一种或两种，所述第二稳定剂的浓度为1.0-10g/L。

其进一步地技术方案为，所述第三稳定剂为EDTANa

其进一步地技术方案为，所述校准品的pH为5.5-7.5。

其进一步地技术方案为，所述无机盐离子为钠离子或钾离子中的任一种，所述无机盐离子的浓度为20-200mmol/L。

第二方面，本发明还提供一种制备所述的类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系的方法，包括如下步骤：

S1、将第一缓冲液、第二缓冲液、第一稳定剂、第二稳定剂及防腐剂加入至纯化水中溶解混匀，调节pH至5.5-7.5，得初始缓冲体系；

S2、向所述初始缓冲体系中加入第一表面活性剂、无机盐离子及第三稳定剂，充分混匀后即得校准品。

其进一步地技术方案为，所述制备方法在步骤S2中，还包括向所述初始缓冲体系中加入第二表面活性剂。

第三方面，本发明还提供一种类风湿因子检测试剂盒，包括校准品和/或质控品，所述校准品和/或质控品是由第一方面所述的类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系与抗体母液配制至达到预设浓度的抗体得到。

其进一步地技术方案为，所述抗体母液为小鼠腹水中提取的抗人变性IgG FC端的IgM亚型的抗体308B。

例如，在具体实施例中，将所述的类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系与小鼠腹水提取的抗体308B母液进行稀释至所需浓度，即得到RF校准品或者质控品。

与现有技术相比，本发明能达到的技术效果为：

本发明提供的类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系，含有多种不同类型的稳定剂，双缓冲液、无机盐离子和表面活性剂，其中，双缓冲液的复配不仅可以稳定维持缓冲体系的pH，还起到稳定抗体蛋白的作用；无机盐离子可以维持抗体蛋白的净电荷，去除抗体的自我吸引作用，防止蛋白的聚集。本发明的缓冲体系通过各组分的复配，得以有效提高抗体蛋白的储存稳定性，实现了RF校准品、质控品随试剂盒内附且作为液体长期储存的大量需求。本发明提供的缓冲体系在临床检验学上，有广泛的应用前景。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

此外，“大致”、“基本”等用语旨在说明相关内容并不是要求绝对的精确，而是可以有一定的偏差。例如：“大致相等”并不仅仅表示绝对的相等，由于实际生产、操作过程中，难以做到绝对的“相等”，一般都存在一定的偏差。因此，除了绝对相等之外，“大致等于”还包括上述的存在一定偏差的情况。以此为例，其他情况下，除非有特别说明，“大致”、“基本”等用语均为与上述类似的含义。

在类风湿因子检测试剂盒中，需要使用校准品来获得校准曲线，以保障试剂盒的检测准确率。而类风湿因子抗体的种类较多，其主要类型为IgM亚型的抗体，但其IgM亚型的单抗提取困难，不易纯化，里面含有杂蛋白，且倾向于由单体变为多聚体，因而其IgM亚型抗体的液体储存稳定性(尤其是低浓度的蛋白)一般都比较差，放置一段时间后，其与试剂里的抗原反应度会有较大的变化，从而极大地影响了试剂的性能，导致试剂的准确度的降低。

为此，本发明提供了一种类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系，本发明通过采用小鼠腹水的方式，得到大量的抗人变性IgG FC端的IgM亚型的抗体308B作为RF校准品、质控品中的抗体，然后优化抗体储存缓冲体系从而提高抗体的储存稳定性，实现了RF校准、质控品随试剂盒内附且作为液体稳定长期储存的大量需求。本发明提供的类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系在临床检验学上，有广泛的应用前景。

实施例1

本发明实施例1提供一种类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系，其各组份及浓度见表1。

表1:

本发明还提供上述类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系的制备方法，其具体步骤如下：

S1、将第一缓冲液、第二缓冲液、第一稳定剂、第二稳定剂及防腐剂加入至纯化水中溶解混匀，调pH至5.5-7.5，制得初始缓冲体系；

S2、向所述初始缓冲体系中加入第一表面活性剂、无机盐离子及第三稳定剂，充分混匀后即制得校准品质控品用缓冲体系。

本实施例还提供一种类风湿因子检测试剂盒，包括校准品和/或质控品，所述校准品和/或质控品是由所述的类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系与抗体母液配制至达到预设浓度的抗体得到。

本实施例将上述缓冲体系制备成校准品或质控品的操作如下：

将配置好的缓冲体系与小鼠腹水提取的抗体308B母液进行稀释至所需浓度得到RF校准品或者质控品。

所述校准品或质控品中的抗体含量检测方法为：将稀释好的RF校准品或者质控品与类风湿因子试剂盒里的R1试剂以及R2试剂混合，搅拌混匀，使其充分反应；再用全自动生化分析仪(日立7180)测定反应后的吸光度差值(主波长600nm，仪器读点18-34)；最后根据吸光度变化值计算出校准品、质控品中的抗体含量。

在实施例1缓冲体系的基础上配制对比例1-5的缓冲体系，验证各组分的协同复配作用。

对比例1-5提供的缓冲体系各组份及浓度见表1-1。

表1-1:

稳定性验证实验：

检测本发明实施例1以及对比例1-5的缓冲体系以及市售的常用缓冲体系分别配制得到的校准品在4℃下放置7天、在37℃下放置7天的稳定性情况，实验结果见表2-1以及表2-2。

市售的常用缓冲体系组成具体如下：

A组的缓冲体系为：生理盐水；

B组的缓冲体系为：100mM Mops，0.5g/L EDTA Na

C组的缓冲体系为：100mM Tris缓冲，5g/L氯化钠，20g/L甘露醇；

D组的缓冲体系为：200mM磷酸缓冲，10g/L甘油；

E组的缓冲体系为：200mM Tris缓冲，3g/L小牛血清，4g/L氯化钠；

F组的缓冲体系为：100mM Mops，3g/L BSA，0.5g/L EDTA Na

G组的缓冲体系为：200mM磷酸缓冲，5g/L小牛血清，5g/LBSA，2g/L Vc；

其中，H组的缓冲体系为：实施例1的缓冲体系。

校准品1-4的浓度分别为：6.125微克/毫升、12.5微克/毫升、25微克/毫升及50微克/毫升。

表2-1:

表2-2:

根据表2-1和表2-2的结果可知，从7天的4℃加速之后的测值偏差情况来看，除A组外，其他各组以及对比例1-5缓冲体系的偏差数值相差不大；然而，在7天的37℃热加速之后，H组(实施例1缓冲体系)的各浓度校准品在0-7天的测值偏差变化最小，且综合比较，H组较其他各组的偏差值不在同一个数量级。因此，相对于其它校准品缓冲液而言，实施例1缓冲体系配制的校准品储存性能更稳定。

实施例2

在实施例1的缓冲体系基础上，比较第一缓冲液与第二缓冲液的不同摩尔配比对体系稳定性的影响。

本实施例共设置5组实验进行验证，各组缓冲体系的第一缓冲液与第二缓冲液的摩尔配比如下：

A组：100mM MOPS缓冲液、200mM甘氨酸；

B组：100mM MOPS缓冲液、50mM甘氨酸；

C组：50mM MOPS缓冲液、100mM甘氨酸；

D组：200mM MOPS缓冲液、100mM甘氨酸；

E组：本发明实施例1所述缓冲体系。

*上述四组的缓冲体系与实施例1的区别仅在于第一缓冲液与第二缓冲液的浓度不相同。

将上述五组缓冲体系配制成校准品，在4℃下放置7天、在37℃下放置7天，检测其稳定性情况，结果见表3。

其中，校准品1-4的浓度分别为：6.125微克/毫升、12.5微克/毫升、25微克/毫升及50微克/毫升。

表3:

根据表3结果可知，第一缓冲液与第二缓冲液的比例不同，对校准品体系的冷、热储存稳定性具有极大的影响。从7天的4℃加速和37℃热加速结果来看，E组的测值偏差变化均是最小的，且E组(实施例1的缓冲体系)较其他各组的偏差值不在同一个数量级。可见，在本发明限定的缓冲体系中，当第一缓冲液与第二缓冲液的比例为摩尔浓度1：1时，在该比例下既能满足在所需pH缓冲范围内的缓冲能力，又能充分起到一个稳定体系的作用。

需要说明的是，本发明的第一缓冲液选自Tris，磷酸盐，Mops，氨基乙酸，柠檬酸盐，MES，HEPPS，PIPES，Bicine，CHES，CAPS中的至少一种，本发明实施例仅以Mops为例进行实验验证，对于其他选项：Tris，磷酸盐，氨基乙酸，柠檬酸盐，MES，HEPPS，PIPES，Bicine，CHES，CAPS均能发挥与Mops相近似的效果。

本发明的第一稳定剂选自蔗糖，葡萄糖，海藻糖，甘露醇，山梨醇，木糖醇，丙三醇中的至少一种，本发明实施例仅以海藻糖为例进行实验验证，对于其他选项：糖，葡萄糖，甘露醇，山梨醇，木糖醇，丙三醇均能发挥与Mops相近似的效果。

实施例3

本发明实施例3提供一种类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系，其各组份及浓度见表4。

表4:

本发明还提供上述类风湿因子检测试剂盒校准品质控品用缓冲体系的制备方法，其具体步骤如下：

S1、将第一缓冲液、第二缓冲液、第一稳定剂、第二稳定剂及防腐剂加入至纯化水中溶解混匀，调pH至5.5-7.5，制得初始缓冲体系；

S2、向所述初始缓冲体系中加入第一表面活性剂、第二表面活性剂、无机盐离子及第三稳定剂，充分混匀后即制得校准品质控品用缓冲体系。

将上述实施例3的缓冲体系配制成校准品，与实施例1的缓冲体系配制成校准品，在4℃下放置7天、在37℃下放置7天，检测其稳定性情况，结果见表5。

校准品1-4的浓度分别为：6.125微克/毫升、12.5微克/毫升、25微克/毫升及50微克/毫升。

表5：

由表5结果可知，实施例3的缓冲体系中添加了第二表面活性剂CE510，从7天的4℃加速和37℃热加速结果相对偏差结果来看，实施例1的更加小，说明第二表面活性剂的加入有助于进一步提高缓冲体系的稳定性。

可以理解地，对于实施例1在不同次检测实验中的数据结果不同，这是仪器、操作误差等原因造成，从检测结果来看，检测值的偏差在误差范围内。

需要说明的是，CE210与CE510有相似的结构，均为末端连接了寡氨短链的PEG分子，区别在于CE210的分子量为2000，CE510的分子量为5000，在本发明的缓冲体系中，第二表面活性剂可选择CE210或CE510，均有助于提高缓冲体系的稳定性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。