一种Msrs荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光成像及生物传感技术领域，涉及一种检测Msrs的荧光探针及其制备方法，以及其在细胞成像与生物传感中的应用。

背景技术

氧化应激是机体中活性氧或活性氮(ROS/RNS)的产生与抗氧化防御之间的一种失衡状态，可能导致生物体内的蛋白质损伤和组织损伤。一般来说，细胞通过两种途径抵抗这种氧化损伤。一种是采取预防机制，如超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶可以在损伤发生前清除活性氧，从而保护细胞。另一种是修复损伤的生物大分子，包括DNA和蛋白质。例如，蛋白质中的蛋氨酸残基是最易受ROS影响的物质之一，会被氧化成蛋氨酸亚砜，导致蛋白质的结构和功能被破坏。而蛋氨酸亚砜还原酶能特异性地催化蛋氨酸亚砜还原为蛋氨酸，从而修复含Met的蛋白质结构并恢复其生理活性。蛋氨酸亚砜还原酶(Msrs)水平的异常波动与一系列疾病如精神分裂症、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等相关神经系统疾病密切相关，鉴于这些相关性，识别和成像氧化应激下活神经元的Msrs水平的变化可以进一步了解Msrs和这些疾病间的联系。

荧光传感和成像技术因具有高灵敏度、高选择性等优点被认为是研究包括酶在内的生物目标的有力工具。目前所报道的Msrs探针大多仅通过单单一波长发射的荧光强度变化进行检测，这会受到探针浓度偏差或环境因素(如光源)的干扰。比率型荧光传感器提供了一种更可取的方法，它依赖于两种不同波长发射的荧光强度的比值，从而可以最大限度地减少这些干扰。然而迄今为止，报道的两种检测Msrs的比率荧光探针，都是基于分子内电荷转移作用(ICT)的“关闭-开启”机制设计的，它们或者表现出高度重叠的发射峰，而且没有线性响应；或者需要紫外光激发，且只能表现出非常弱的比率特性，所以不适合在活细胞中精确检测Msrs。因此，开发具有明显的双通道发射、可靠的比率响应和长波长激发的新型荧光探针是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种检测Msrs的新型荧光探针及其在细胞成像与生物传感中的应用，所述荧光探针(式CPSO所示)具有选择性高、准确性好等优点。

本发明提供了一种Msrs荧光探针，其结构如下式CPSO所示，其中，阴离子可以是包括但不限于氯离子(Cl

其中，所述Msrs荧光探针为比率型探针，随着Msrs浓度升高，探针原有的432nm左右的荧光发射峰强度逐渐降低，553nm左右的荧光发射峰强度逐渐升高，通过两个发射峰强度的比值变化可以对Msrs进行定量分析。与其他探针相比，本发明所述Msrs荧光探针选择性好、生物相容性好，并且具备定量分析能力，使检测更准确，在生物传感、成像等方面具有很大优势。

本发明还提供了一种Msrs荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

将化合物2和化合物3在乙腈中进行第一步反应得到淡黄色固体化合物CPS。然后将化合物CPS和3-氯过氧苯甲酸在有机溶剂中进行第二步反应，得到所述Msrs荧光探针CPSO。所述制备方法的反应过程如下反应式(a)所示：

其中，所述第一反应的温度为80℃-90℃；优选地，为82℃。

其中，所述第一步反应的时间为12h-24h；优选地，为24h。

优选地，所述第一步反应结束后，冷却至室温滴加到乙酸乙酯中得到CPS，再将CPS与3-氯过氧苯甲酸进行第二步反应。

其中，所述第二步反应的温度为0℃-25℃；优选地，为0℃。

其中，所述第一步反应优选地在耐压管中进行。

其中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等中的一种或多种；优选地，为1,2-二氯乙烷。

其中，所述第二步反应的时间为10h-18h；优选地，为18h。

其中，所述化合物2、化合物3的摩尔比为1:1；

其中，所述化合物CPS、3-氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:1.2。

其中，所述化合物2的合成方法如下：将化合物1与1，3-二溴丙烷和K

其中，所述的有机溶剂选自乙腈，丙酮或N,N-二甲基甲酰胺等中的一种或多种；优选地，为丙酮。

其中，所述反应的反应温度为50℃-60℃；优选地，为56℃。

其中，所述反应的反应时间为12h-24h；优选地，为24h。

其中，所述化合物1、1，3-二溴丙烷和K

其中，反应式(c)的制备步骤如下：将化合物3与3-氯过氧苯甲酸溶于有机溶剂反应。反应结束后，滴入乙酸乙酯中，得到化合物4。

其中，所述的有机溶剂选自乙腈，丙酮或二氯甲烷等中的一种或多种；优选地，为二氯甲烷。

其中，所述反应的反应温度为0℃-25℃；优选地，为0℃。

其中，所述反应的反应时间为12h-18h；优选地，为18h。

其中，所述化合物3与3-氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:1。

其中，反应式(d)的制备步骤如下：将化合物3与1，3-二溴丙烷溶于有机溶剂中，加热回流。反应结束后，用乙酸乙酯重结晶，得到淡黄色固体化合物5。

其中，所述的有机溶剂选自乙腈，丙酮或二氯甲烷等中的一种或多种；优选地，为乙腈。

其中，所述反应的反应温度为70℃-90℃；优选地，为85℃。

其中，所述反应的反应时间为12h-24h；优选地，为24h。

其中，所述化合物3与3-氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:10。

其中，反应式(e)的制备步骤如下：将化合物4和1，3-二溴丙烷溶于有机溶剂中，加热回流。反应结束后，用无水乙醚重结晶，搅拌直至有粉末析出，过滤，用丙酮洗涤得到白色固体化合物6。

其中，所述的有机溶剂选自乙腈，丙酮或二氯甲烷等中的一种或多种；优选地，为乙腈。

其中，所述反应的反应温度为70℃-90℃；优选地，为85℃。

其中，所述反应的反应时间为12h-24h；优选地，为12h。

其中，所述化合物4和1，3-二溴丙烷的摩尔比为1:10。

本发明还提出了Msrs荧光探针的构建方法，即，首先合成化合物2苯并香豆素衍生物荧光团，然后通过柔性烷基链在荧光团引入化合物6吡啶乙烯-苯基亚砜单元，构建成一种新型双光子比率型荧光探针。当溶液中存在Msrs时，所述荧光探针中的吡啶乙烯-苯基亚砜单元会被Msrs催化还原为新的荧光物质吡啶-苯基硫醚单元(化合物5)，形成新的荧光发射峰，实现比率模式对Msrs的荧光检测，并且进一步可以实现对Msrs在细胞内的比率型荧光成像。

在本发明的一个具体实施方式中，所述Msrs荧光探针的制备方法包括：

将化合物2(63.5mg，0.28mmol)和3(93.3mg，0.28mmol)溶于6mL乙腈中，回流24小时，冷却至室温后，滴入乙酸乙酯中，析出沉淀物，过滤得到淡黄色产物，即化合物CPS。然后将CPS(50mg，0.09mmol)和3-氯过氧苯甲酸(85％，15.5mg，0.09mmol)溶解于6mL二氯甲烷中，回流24小时。冷却至室温后，滴入乙酸乙酯中，析出沉淀物，过滤得到白色固体产物，即Msrs荧光探针CPSO。

本发明还提供了一种如上所述方法制备得到的Msrs荧光探针。

本发明所述Msrs荧光探针为比率型探针，对Msrs具有高选择性的双光子比率型荧光探针，随Msrs浓度升高，探针原有的432nm左右的荧光发射峰强度逐渐降低，553nm左右的荧光发射峰强度逐渐升高，通过两个发射峰强度的比值变化可以对Msrs进行定量分析。与其他探针相比，本发明所述Msrs荧光探针选择性好、生物相容性好、稳定性较高，并且具备定量分析能力，使检测更准确，在生物传感、成像等方面具有很大优势。

本发明还提供了所述Msrs荧光探针在体外和/或细胞内和/或活体内检测Msrs中的应用；通过双光子荧光激发、实现对Msrs的检测；其中，所述细胞包括但不限于神经元细胞，海拉(HeLa)细胞等；所述细胞不包括来源于人的细胞；所述活体不包括人。

在一些具体实施方案中，所述荧光检测方法中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液；和/或，所述反应的温度为37℃恒温；和/或，所述反应的时间为60min。

本发明还提供了所述Msrs荧光探针在细胞成像与生物传感中的应用。

由于Msrs荧光探针可以与Msrs反应形成一种新的荧光物质，导致探针原有432左右处的荧光发射峰逐渐淬灭，并在553nm出现一个逐渐增强的荧光发射峰，显示出一个比率荧光输出。因此，本发明还提供了一种体外Msrs的荧光检测方法，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将本发明所述Msrs荧光探针与Msrs混合摇匀进行反应，在700nm(双光子激发)，或者405nm(单光子激发)波长的光源激发下，测定体系的荧光强度比率变化，从而实现对Msrs的定量检测。

其中，所述缓冲液包括但不限于Tris-HCl缓冲液；优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为25mM，pH为7.4。

其中，所述反应的温度为37℃。

其中，所述反应的时间为30min-90min；优选地，为60min。

其中，所述方法的线性范围为0.1-1μg/mL；最低检测限为0.01μg/mL。

其中，双光子荧光强度比与Msrs浓度的线性关系为R

其中，所述方法可应用于细胞、活体中。

在本发明的一个具体实施方式中，所述体外Msrs的荧光检测方法具体包括：取0.575mg上述方法制备的Msrs荧光探针，用含有Tris-HCl缓冲液稀释到100mL，分别取上述溶液200mL向其中加入不同体积的浓度为500μg/mL的Msrs，然后在700nm(双光子激发)，或者405nm(单光子激发)波长的光源激发下，测定体系的荧光强度变化；随着Msrs加入浓度的增加，探针原有432左右处的荧光发射峰逐渐淬灭，并在553nm出现一个逐渐增强的荧光发射峰，显示出一个比率荧光输出，并在0.1-1μg/mL范围内展现良好线性，最低检测限为0.01μg/mL，可用于Msrs有效检测，见图3。

在本发明的一个具体实施方式中，所述在细胞内Msrs的荧光成像方法，包括以下步骤：将细胞与所述的Msrs探针共同孵育，之后加入缓冲液，然后利用共聚焦显微镜进行观察，用激发波长为700nm的波长激发，观察细胞随着Msrs的不断增加，探针的432nm左右发射荧光逐渐降低，在553nm处的荧光逐渐增强，得到了一个比率响应，从而实现对细胞内Msrs的比率荧光响应并进行成像分析。

其中，所述孵育温度为37℃；所述细胞与Msrs探针孵育的时间为10min-60min。

本发明有益效果包括，本发明首先合成了一种对Msrs具有高选择性的双光子比率型荧光探针，将两个氯原子和醛基引入香豆素衍生物的荧光团中，构建得到一种新型Msrs荧光探针。该探针是一个融合分子内电荷转移(ICT)和荧光共振能量转移(FRET)双机制的分子平台。通过激活能量供体与能量受体之间的FRET体系，成功构建比率型探针，克服了传统单一检测波长荧光探针在生物体中难以对Msrs水平定量检测的局限，提高了对Msrs检测的准确性。同时，本探针可以使用近红外(700nm)的双光子长波长激发光源激发，减小了激发光对生物的光损伤，增加了组织穿透深度，有利于实现活细胞、组织中的Msrs检测。并且首次探究了氧化应激状态下的神经元中Msrs的变化以及对AD鼠脑切片中Msrs的荧光成像。

附图说明

图1表示本发明Msrs荧光探针分子的核磁共振氢谱。

图2化合物2，化合物6的吸收光谱和荧光光谱(A)；化合物2，化合物5的吸收光谱和荧光光谱(B)。

图3表示本发明中化合物5与化合物6的荧光光谱。

图4表示本发明中化合物CPSO和2的双光子吸收截面和荧光寿命。

图5表示(A)本发明中化合物CPSO的核磁共振氢谱(p)，CPSO与MsrA反应20min(q)、40min(r)、60min(s)和CPS(t)，在298K的D

图6是本发明Msrs荧光探针对不同浓度MsrA(0.1-4μg/mL)响应的荧光发射光谱(A)和比率变化线性关系(B)。

图7是本发明Msrs荧光探针对MsrA时间响应。

图8是本发明Msrs荧光探针对Msrs检测的选择性和干扰实验；图中左侧的柱条为各种干扰氨基酸单独存在时情况，右侧的柱条为Msrs与潜在干扰氨基酸(A)、活性氧(B)及离子(C)共存时的情况。左侧的柱条代表选择性实验，左侧的柱条代表干扰实验。

图9是本发明Msrs荧光探针用于神经元细胞内不同浓度Msrs的荧光成像。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1.Msrs荧光探针的制备

将如前述文本中提到的化合物2(63.5mg，0.28mmol)和化合物3(93.3mg，0.28mmol)溶于6mL乙腈中，回流24小时，冷却至室温后，滴入乙酸乙酯中，析出沉淀物，过滤得到淡黄色产物，即化合物CPS。然后将CPS(50mg，0.09mmol)和3-氯过氧苯甲酸(85％，15.5mg，0.09mmol)溶解于6mL二氯甲烷中，回流24小时。冷却至室温后，滴入乙酸乙酯中，析出沉淀物，过滤得到白色固体产物，即Msrs荧光探针CPSO(产率65％)。

实施例2.探针CPSO与Msrs反应前后荧光共振能量转移(FRET)机制

用Tris-HCl缓冲液(25mM，pH＝7.4)作为溶剂，配制10μM的如前述文本中提到的化合物2、化合物5以及化合物6溶液，测试他们的吸收光谱与荧光光谱(如图2)。发现化合物2的荧光光谱与化合物5的吸收光谱有非常明显的光谱重叠，而化合物2与化合物6的光谱重叠很小，这清楚地证实了Msrs催化还原的FRET活化过程的可行性。

实施例3.探针CPSO与Msrs反应前后分子内电荷转移(ICT)机制

用Tris-HCl缓冲液(25mM，pH＝7.4)作为溶剂，配制10μM的如前述文本中提到的化合物5以及化合物6溶液，测试他们的荧光光谱。如图3所示，最初的化合物6由于结构两端的吸电子特性而不发射，但当亚砜基转化为硫醚(化合物5)时，荧光强度显著增强，提高了大约17倍。这是由于化合物5的共轭结构中存在明显的推电子效应。因此，通过硫化物/亚砜的化合物5和6之间的结构转换，分别证实了依赖氧化还原的FRET和ICT双重调控的可行性。

实施例4.探针CPSO的双光子性能及FRET效率

接着本发明利用参比法测定了本发明实施例1制备的探针CPSO的双光子吸收截面。第一步先计算探针的荧光量子产率，公式如下：

Φ

σ

下标s和r代表样本和参照样品，σ为双光子截面，F为测量的双光子荧光强度，

σ′＝Φ×σ

φ为荧光量子产率，σ为双光子截面。如图4A所示，综合权衡近红外区域和TPA双光子吸收截面后，选择700nm作为激发波长进行后续实验。然后，在相同的条件下，测定了化合物2、CPSO和CPS的荧光寿命(如图4B)，以评价CPSO和CPS的FRET效率。供体化合物2的寿命最长，为5.15ns，探针CPSO的寿命稍短，为4.37ns。而在CPS中，寿命下降尤为明显(1.25ns)，这明确表明了CPS具有非常高效率的FRET，经过计算，其效率为76％，而在CPSO中，效率仅为15％。

实施例5.探针CPSO与MsrA的反应过程

用Tris-HCl缓冲液(25mM，pH＝7.4)作为溶剂，配制10μM的本发明实施例1制备的CPSO以及CPS用于核磁滴定、高效液相色谱以及高分辨质谱的分析检测。如图5所示，混合物的核磁逐渐发生变化，甲基位置的氢向低场移动，这是因为硫氧双键被还原成甲硫键后，产生的推电子效应引起的(图5a)。接着采用高效液相色谱(HPLC)进一步跟踪了MsrA催化还原CPSO的转化过程。如图5b所示，探针与MsrA的反应混合物显示出两种保留时间很好的物质(图5b曲线f)，与相应的参考样品(图5b曲线e、g)比较，这两种物质分别是探针CPSO和还原产物CPS。此外，高分辨质谱(HR-MS)分析再次证实了MsrA催化CPSO向CPS的转变(图5c)，除了出现了[CPSO-Br]+的峰外，还出现了一个m/z值为480.1608的新峰([CPS-Br]+，称为C30H26NO3S+)，与之前推测的酶解产物CPS相对应。

实施例6.体外环境下检测Msrs

(1)荧光强度校准曲线的制作

取0.575mg上述方法制备的Msrs荧光探针，用含有Tris-HCl缓冲液稀释到100mL，分别取上述溶液200mL向其中个加入不同体积的浓度为500μg/mL的Msrs，然后以激发波长为700nm测量溶液的荧光强度；随着Msrs加入浓度的增加，探针本身的荧光强度逐渐降低，新的荧光发射峰强度逐渐增高，并在0.1-1μg/mL范围内展现良好线性，最低检测限为0.01μg/mL，线性关系为R

(2)体外样品检测

取0.575mg上述方法制备的Msrs荧光探针，用含有Tris-HCl缓冲液稀释到100mL，分别取上述溶液200mL向其中个加入不同体积的浓度为500μg/mL的Msrs，然后以激发波长为700nm测量溶液的荧光强度；随着Msrs加入浓度的增加，探针本身的荧光强度逐渐降低，新的荧光发射峰强度逐渐增高，并在0.1-1μg/mL范围内展现良好线性，最低检测限为0.01μg/mL，说明本发明的Msrs荧光探针可用于Msrs有效检测。

实施例7.探针CPSO与Msrs的反应动力学

用Tris-HCl缓冲液(25mM，pH＝7.4)作为溶剂，配制10μM的本发明实施例1制备的CPSO与不同浓度的MsrA混合，测定探针对MsrA的动态响应。如图7所示，随着MsrA的浓度增加，CPSO对MsrA的响应时间逐渐加快，当MsrA的浓度达到4μg/mL，探针与其MsrA反应的时间达到最快，约为8min，比文献已经报道的MsrA探针快得多。这得益于探针CPSO的高特异性和比率型荧光传感模式。

实施例8.实施例1制备的Msrs荧光探针的选择性及抗干扰能力

为了评估本发明实施例1制备的Msrs荧光探针的选择性和抗干扰能力，分别考察了Cys、GSH、AA、Glu、BSA、DTT、Thr、His、Gly、Hcy；金属离子K

由图8可知，常见的氨基酸、金属离子和活性氧/活性氮均对Msrs检测没有明显影响(干扰<10％)，选择性和抗干扰干扰实验说明本发明中的Msrs荧光探针具有很好的选择性和抗干扰能力。

实施例9.细胞内Msrs的荧光成像

本发明实施例1制备的Msrs荧光探针在嗜铬细胞中对Msrs的共聚焦荧光成像，将培养后的神经元细胞用Msrs荧光探针孵育1h，然后将细胞培养液吸净，加入PBS缓冲液。然后用共聚焦显微镜找好细胞形态，用激发波长为700nm的荧光激发，进行荧光成像，随着Msrs的不断增加，细胞中探针的荧光逐渐降低，另外一个新的荧光逐渐增强，因此说明本发明实施例1制备的Msrs荧光探针可用于细胞内Msrs的荧光成像。双光子具有穿透性强的优势，同时比率模式对Msrs的检测可以减少环境因素的干扰，实现对Msrs在细胞内的定量准确检测。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。