一种悬臂大环双核镍金属配合物、其制法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种悬臂大环双核镍金属配合物、其制法和应用。

背景技术

大环配合物的研究由来已久，在自然界中、生物体中大环配合物的身比比皆是，比如血红蛋白卟啉铁衍生物、叶绿素卟啉镁衍生物以及环状离子载体等。因为大环配合物在结构性质和生物活性上的潜力，使人们对这大类的配合物研究的兴趣一直未减。

N(amine)

由于吡啶类化合物具有良好的生物亲和性和生物活性以及吡啶环上的氮原子的强配位能力，使其具有作为用于脱氧核糖核酸(DNA)编辑的“分子剪刀”的潜力；同时通过选择带适当的功能臂和链长的多胺、合适的金属离子，可以得到具有不同吸收小分子能力的配合物，能够用于诸如二氧化碳和氢气的固定、一氧化碳和氮氧化物等有害气体的处理中。近来含有吡啶环悬臂的N(amine)

发明内容

本发明的目的之一在于，提供式A所示的悬臂大环双核镍金属配合物；其能作为DNA切割剂使用。

本发明的目的之二在于，提供该配合物的制备方法。

本发明的目的之三在于，提供该配合物在制备DNA切割剂中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的一种悬臂大环双核镍金属配合物，其结构为式A所示：

，

其中R选自取代或未取代的C

本发明的部分实施方案中，R选自甲基、甲氧基、F、Cl或Br中的任意一种。

本发明提供的悬臂大环双核镍金属配合物的制备方法，包括以下步骤：

式I所示的前驱物与N,N-二(3-氨丙基)-2-呋喃甲胺、二胺化合物通过模板法合成得到，其反应式为：

本发明的部分实施方案中，所述配合物的制备方法包括：式A配合物的制备方法包括：

将Ni(OAc)

本发明的部分实施方案中，Ni(OAc)

优选地，Ni(OAc)

本发明的部分实施方案中，所述制备方法还包括精制步骤：反应完全后，将反应液冷却，过滤，得到绿色沉淀，将绿色沉淀用溶剂溶解，挥发溶剂，即得所述配合物。

本发明的部分实施方案中，所述式I所示的前驱物的制备方法包括以下步骤：

以3-溴甲基-5-甲基水杨醛和1,2-二(3-吡啶甲胺基)乙烷为原料，通过取代反应得到前驱物N,N'-二(3-亚甲基吡啶)-N,N'-二(3-亚甲基-5-甲基水杨醛)乙二胺，其反应式如下如示：

。

本发明的部分实施方案中，将3-溴甲基-5-甲基水杨醛溶于溶剂中，搅拌，另取1,2-二(3-吡啶甲胺基)乙烷、三乙胺，加入溶剂，得到混悬液，将所述混悬液滴入到3-溴甲基-5-甲基水杨醛溶液中，反应，得到式I化合物。本发明的部分实施例中，该溶剂为四氢呋喃。

本发明的部分实施方案中，3-溴甲基-5-甲基水杨醛、1,2-二(3-吡啶甲胺基)乙烷、三乙胺的摩尔比为2~2.5：0.8~1.2：2~5；更优选为2.2：1：4；

优选地，反应温度为室温；

优选地，包括精制步骤：将反应后的溶液过滤，滤液旋干，得到橙色油固；加入乙腈溶解，低温放置后有固体析出，将固体用砂芯抽滤并用少量冷的乙腈洗涤3次，得到淡黄色固体。

本发明提供的式A配合物在制备DNA切割剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地合成了悬臂大环双核镍金属配合物，其合成方法简单，操作简便，收率高。

本发明的式A配合物能与DNA很好结合，而式B配合物、式C配合物与DNA均不能很好结合。从结构上看，在式B配合物、式C配合物中，由于醋酸根离子的配位，使得配合物分子整个大环的结构不再“扁平”，与DNA双螺旋的沟槽结合形成很大的空间位阻，结合困难；式A配合物由于分子结构扭曲，成“V”型，能较好的嵌入DNA螺旋的沟槽。凝胶电泳实验证明式A配合物对DNA有较强的切割能力。

附图说明

图1为1,2-二(3-吡啶甲胺基)乙烷的核磁氢谱图；

图2为式B配合物的电喷雾质谱图；

图3为式C配合物的电喷雾质谱图；

图4为式A-1配合物的电喷雾质谱图；

图5为式B配合物的EDS谱图；

图6为式I所示的前驱物的晶体结构图；

图7为式I所示的前驱物沿b轴的氢键一维堆积图；

图8为式B配合物的晶体阳离子结构图；

图9为式B配合物的晶体结构中两种水簇单元图；

图10为式B配合物的晶体结构中水簇一维堆积图；

图11为式B配合物分子与水簇氢键图；

图12为式B配合物的分子沿c轴的堆积图；

图13为式C配合物的晶体阳离子结构图；

图14为式C配合物的晶体结构中的水簇图；

图15为式C配合物的分子沿c轴的堆积图；

图16为式A-1配合物的晶体结构图(a)和金属配位环境多面体图(b)；

图17为式A-1配合物分子与水分子氢键图(氢键用虚线表示)；

图18为式B配合物的TG曲线图；

图19为DNA对式A-1配合物吸收光谱的影响图；其中:1-式A-1配合物=5×10

图20为式A-1配合物的[DNA]/(ε

图21为式A-1配合物浓度变化的DNA粘度图，DNA浓度=2×10

图22为式A-1配合物与DNA作用的循环伏安图；

图23为不同浓度的式A-1配合物对pBR322DNA切割活性示意图：图中标记为：1-DNA空白；2-5依次为：DNA+式A-1配合物(50μM,100μM,200μM,400μM，800μM)，作用时间：4h。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的保护范围进行举例说明，但不能认为是对本发明保护范围的限制。

实施例1

本实施例公开了式I所示的前驱物的原料1,2-二(3-吡啶甲胺基)乙烷的合成方法，具体为：

称取乙二胺(3.0g,0.05mol)溶于20mL绝对乙醇中，缓慢滴加到3-吡啶甲醛(98%)(11.2g,0.1mol)的20mL绝对乙醇溶液中并磁力搅拌。滴加完毕后，有白色沉淀生成，继续反应10小时。其间用TCL监测。将溶液旋去一半并用砂芯抽滤，得到白色固体。将白色固体溶于50mL绝对甲醇，在冰浴下分多次加入NaBH

实施例2

本实施例公开了本发明式I所示的前驱物N,N'-二(3-亚甲基吡啶)-N,N'-二(3-亚甲基-5-甲基水杨醛)乙二胺(H

称取3-溴甲基-5-甲基水杨醛(5.2g，0.022mol)溶于30ml重蒸的四氢呋喃(THF)中，磁力搅拌。称取1,2-二(3-吡啶甲胺基)乙烷(2.5g，0.01mol)和经氢氧化钾干燥过的三乙胺(4.2g，0.04mol)混合溶于30mlTHF中(白色浑浊)，用恒压漏斗缓慢滴入到以上的溶液中(滴加的前1个小时，有白色固体产生，磁子被糊住，约两小时后变成浑浊一段时间后磁子可转动)。反应过程中TLC检测，24小时后停止反应。将溶液过滤并将滤液旋干，得到橙色油固。加入少量乙腈溶解，低温放置24小时后有固体析出，将固体用砂芯抽滤并用少量冷的乙腈洗涤3次，得到淡黄色固体3g，即为产物。将乙腈合并后旋去3/4，仍可得到产物0.6g。产率：66.8%，熔点122~124℃。产物溶于乙腈溶并挥发可得到适合于X射线晶体衍射的淡黄色长方体单晶。

1

实施例3

本实施例公开了式A-1配合物[Ni

所述合成方法具体为：

将Ni(OAc)

元素分析(%)：实测值：C 58.64, H 6.23, N 10.01；计算值(Ni

IR(KBr，cm

对比例1

本对比例公开了式B配合物[CuZnL

所述合成方法具体为：

将Cu(OAc)

元素分析(%)：实测值：C 54.39, H 6.12, N 9.87；计算值(CuZnC

IR(KBr，cm

对比例2

本对比例公开了式C配合物[Cu

所述合成方法具体为：

将Cu(OAc)

元素分析(%)：实测值：C 54.19, H 5.71, N 9.52；计算值(Cu

IR(KBr，cm

试验例1

本试验例考察了式B配合物、式A-1配合物和式C配合物的电喷雾质谱。

1. 式B配合物在甲醇溶液中的电喷雾质谱如图2所示，m/z762.17的质谱峰丰度为100%，归属于[CuZnL

2. 式C配合物在甲醇溶液中的电喷雾质谱如图3所示，m/z 775.92的质谱峰丰度为100%，归属于[Cu

3. 式A-1配合物在甲醇溶液中的电喷雾质谱如图4所示，只有一个质谱峰m/z888.25，归属于[Ni

试验例2

本试验例考察了式B配合物的X-射线能谱，借此可以半定量的确定配合物中是否含有铜锌元素。EDS谱见如附图5所示。测试结果表明，配合物中Cu的质量分数为4.66%，Zn的质量分数为8.54%，与计算值(Cu:7.9%,Zn:8.1%)基本相符。这也试验例1的质谱结果相吻合。

试验例3

本试验例考察了式I前驱物、式B配合物、式A-1配合物和式C配合物的分子和晶体结构。

1. 式I前驱物

配体前驱物H

表1 前驱配体H

表1中，I>2.0sigma(I)表示概率大于95%。

表2 前驱配体H

用于生成等价原子的对称变换：（i）-x,y,-z+1/2，b x,2-y,z+1/2。

2. 式B配合物

式B配合物的晶体结构数据和相关数据收集及结构优化数据见表3，其分子结构图见图8，其部分建长键角数据列于表4。由分子晶体结构图知，配合物分子以铜原子和锌原子的连线所在直线为对称轴，铜原子位于大环配体(N(amine)

式B配合物晶体结构中含有两种形式的水簇，一种为三元环状水簇，一种为6元环状水簇。如图9所示，左图为三元环水簇，三个水分子成等边三角形排布，水分子两两之间氧原子O2W–O2W的距离为2.031Å；中图为六元环水簇，水分子两两之间氧原子O1W–O1W的距离为2.139Å；右图为沿C轴上水簇堆积图。图10为两种水簇的一维堆积图，水簇三元环和六元环相互交错等距排列，其中三元环水簇所在平面A与六元环水簇所在平面B的距离为4.599Å。

三元环水簇和配合物分子通过与一个溶剂水分子形成的氢键桥联起来。如图11所示，氢键O4W–H4X...O3中H4–X...O3的距离为2.021nm，氢键夹角为138.3°;氢键O4W–H4X...O2W中H4X...O2W的距离为2.689nm，氢键夹角103.4°。

由晶体结构知配合物分子和水分子的比例约为1:3.33。式B配合物的堆积图见图12，可以看到在沿c轴方向上存在大量的含有水簇的通道。

表3 式B配合物和式C配合物的晶体数据和结构主要精修数据

表3中，I>2.0sigma(I)表示概率大于95%。

3. 式C配合物

式C配合物的晶体结构数据和相关数据收集及结构优化数据见表3，其分子结构图见图13，其部分建长键角数据列于表5。式C配合物是双核铜配合物，其晶体结构特征与式B配合物相似，由分子晶体结构图知，配合物分子以两个铜原子的连线所在直线为对称轴，铜原子的配位环境可近似地看作四方锥结构，两个铜原子通过苯氧和醋酸根桥联起来，醋酸根的两个氧原子分别为四方锥的轴向顶点。两个Cu1–O–Cu2建的键角分别为101.5°，两个Cu之间的距离为2.967Å，这比式B配合物中Cu与Zn的距离2.897Å要长。Cu1与其配位原子的距离在1.936–2.020Å范围内；Cu2与其配位原子的距离在2.005–2.300Å范围内。Cu1和Cu2偏离各自N

表4 式B配合物的部分键长和键角

用于生成等效原子的对称变换：(i) x, y, 0.5-z。

与式B配合物类似，式C配合物中也含有水簇，但是式C配合物中的水簇单元为8个水分子组成的平行六面体结构。如图14所示，六面体的各长均为2.886nm，顶点相对的两个氧原子O1W之间的距离为5.338nm、顶点相对的两个氧原子O2W之间的距离为4.881nm。水簇沿着c轴成等距直线排列，两个相邻水簇结构单元顶点O1W之间的距离为3.334nm。

由晶体结构知配合物分子和水分子的比例约为1:1.33。式C配合物的堆积图见图15，与式B配合物相似，式C配合物在沿c轴方向上也存在大量的含有水簇的通道。

表5 式C配合物的部分键长和键角

用于生成等效原子的对称变换： (i) x, y, 1.5-z。

4. 式A-1配合物

式A-1配合物的晶体结构数据和相关数据收集及结构优化数据见表6，其分子结构图见图16，其部分建长键角数据列于表7。其中Ni1与大环配体上的两个亚胺氮原子N3和N5、一个叔胺氮原子N4、两个酚氧原子O1和O2、醋酸根上的氧原子O4配位形成6配位的八面体结构，Ni1与周围配位原子的距离范围为2.032–2.205Å；Ni2与大环配体上另一边的两个叔胺氮原子N1和N2、酚氧原子O1和O2、一个醋酸根上的氧原子O5和另一个醋酸根上的氧原子O6配位，Ni2与周围的配位原子的距离范围为1.980–2.331Å。由于Ni的强配位作用，使得大环配体扭曲成类似马鞍的“V”字形，两个苯环所在的鞍边平面的夹角为70.8°。

表6 式A-1配合物的晶体数据和结构主要精修数据

表6中，I>2.0sigma(I)表示概率大于95%。

式A-1配合物分子与晶格中水分子形成氢键，并通过氢键以水分子为桥联两两连接，氢键数据见表8。如图17所示，配合物分子中与镍原子配位的醋酸根上的氧原子O7与一个水分子形成氢键O1W–H1Y...O7，氢键H1Y...O7键长为2.300Å，其次配体吡啶环上与碳原子C30连接的氢原子H30和一个水分子形成氢键C30–H30...O3W，H30...O3W键长为2.330Å。两个配合物分子被两个水分子通过氢键连接起来，它们是C47–H47C...O2W、C8i–H8Bi...O2W和C47i–H47Ci...O2Wi、C8–H8B...O2Wi(i表示第二个分子的原子)，H47C...O2W键长为2.522Å，H8Bi...O2W键长为2.697Å。

表7 式A-1配合物的部分键长和键角

表8式A-1配合物的氢键数据

用于生成等效原子的对称变换： (i) 1-x,2-y,2-z。

试验例4

本试验例公开了式B配合物的热重分析。仪器：Q50型TGA热重分析仪(美国TA公司)；温度范围为25℃~400℃，升温速度10℃/min，采用高纯氮气为载气。

配合物热重分析式B配合物的热重曲线见图18，从热重曲线图上可以看到配合物存在两个的热分解失重平台。第一个热分解过程从35℃开始到120℃结束，失去12.7%的重量，这对应于分子中的溶游离的甲醇和1.33个自由水分子。第二个热分解过程从225℃开始到285℃结束，观测失重值为4.2%，这对应于分子中的2个水(计算失重值为4.4%)。

试验例5

本试验例考察了配合物与DNA的作用。

1. 试验方法

1.1配合物与小牛胸腺DNA(CT-DNA)结合模式的研究

称取CT-DNA约20mg，溶解于Tris-HCl缓冲溶液(100mL,50mM Tris-HCl,50mMNaCl,pH=7.2)中，在0℃的条件下保存不超过4天。CT-DNA在缓冲溶液中的溶解性不是很好，可以超声溶解。注意：长时间超声会使水温变高，容易导致DNA溶液变质。用紫外测定溶液在260和280nm处的吸收值A

1.1.1紫外光谱

(1)配合物溶解在DMF或甲醇中，浓度为5.0×10

(2)将不同浓度的CT-DNA溶液分别与配合物溶液按1:1的体积混合，混合液共3mL，常温放置30min，测定混合液的紫外吸收。紫外吸收光谱的测定采用1cm的比色皿、在25℃下进行，波长扫描范围为190–700nm。

(3)配合物与CT-DNA的结合常数根据公式[DNA]/

1.1.2.粘度的测定

采用乌式粘度计测量粘度，实验温度：25.0±0.1℃。

(1)DNA溶液的浓度为定值，配合物溶于甲醇。

(2)将DNA溶液与不同浓度的配合物溶液按1:1的体积比混合，静置30min，记录下混合溶液流经刻度的时间，每组样品测量三次，取时间的平均值。

(3)以(F/F

1.1.3.电化学测试

通过循环伏安法研究配合物与DNA的相互作用。实验在Tris-HCl缓冲溶液(100ml,50mM Tris-HCl,50mMNaCl,pH=7.2)中进行，采用0.1M的四丁基高氯酸铵(TBAP)做支持电解质，扫描范围为–1.0到–0.4V。

1.2配合物对pBR322 DNA的切割作用研究

(1) Tris-HCl缓冲溶液的配制：(50mM Tris，pH=7.2，50mM NaC1)称取1.21g Tris碱和0.59g NaC1，用大约120mL去离子水溶解，之后用1M的HCl溶液调节至pH=7.2，再用去离子水定容至200mL。

(2)配合物溶液的配制：将配合物用合适的溶剂(如DMF)溶解，然后用缓冲溶液稀释配制成800μM备用。

(3) TAE(50×)电泳缓冲液的配制：(40mmol/L Tris，20mmol/L冰醋酸，1mmol/LEDTA，pH7.4)称取24.2g Tris碱、5.7mL冰乙酸和3.72g EDTA，加50mL水溶解，然后定容至100mL并摇匀，静置待用。使用时稀释50倍。

(4) 终止剂的配制：0.25％溴酚蓝，40％(W/V)蔗糖水溶液，4℃保存。

(5) 凝胶板的制备：称取0.5g琼脂糖加入装有1mL TAE电泳缓冲液(用二次水稀释50倍)的三角烧瓶中，摇匀后在电子天平上称重。在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，放在电子天平上滴加二次水至原重，加入2–4滴1μg/mL的溴化乙锭溶液并摇匀，冷却至60℃左右。在凝胶模具中插入适当的梳子，将琼脂糖透明溶液(约50℃)倒入，冷却到室温使其凝固。

(6)DNA样品纯度的测定：取2μL DNA用Tris-HCl缓冲溶液稀释后，分别测定其在260nm、280nm处吸光度，如果测定的A

(7)配合物对DNA的作用影响：取1μL DNA(约0.2μg)和一定量的配合物溶液于Ep管中，然后再用Tris-HCl缓冲溶液稀释到5μL，在37℃下反应一段时间。加入1μL终止剂终止反应，然后取反应液2μL加入到凝胶板的孔中，进行电泳实验。

(8)取下凝胶，放入UVPGDS8000凝胶成像分析系统成像。

2.结果与分析

2.1 配合物的紫外-可见吸收光谱

当式B配合物、式C配合物与CT-DNA作用时，两个配合物的紫外吸收光谱随DNA浓度的变化均不明显，这表明配合物很难与DNA的双螺旋结构发生作用。由电喷雾质谱可知，在溶液中式B配合物、式C配合物中醋酸根均是稳固的结合在配合物上；从配合物的晶体结构上看，两个配合物分子上参与配位的醋酸根的空间位置几乎与大环平面垂直，这使得分子的大环结构不再扁平，与DNA作用时的空间位阻变大很多，不能顺利插入双螺旋结构，从而使溶液中游离的配合物分子不会减少，因此其吸光度没有明显变化。

图19为DNA对式A-1配合物的紫外吸收光谱的影响。由图19可知，式A-1配合物的最大吸收峰在367nm处，在DNA与配合物混合后，其最大吸收峰显示出12%的减色率，并且在[DNA]/[Complex]=2.2时伴随有6nm的红移，这说明式A-1配合物与DNA能发生结合作用，而且作用模式为插入模式。其中，Complex是指A-1配合物，[Complex]是指A-1配合物的浓度。利用公式[DNA]/(

2.2 配合物与DNA结合的粘度测试

图21为式A-1配合物与DNA作用的粘度曲线图，由图21可知，随着配合物浓度的增加，DNA的粘度均是增大，说明了式A-1配合物与DNA的结合模式均为插入结合，这与前面配合物的紫外吸收光谱的结论相吻合。

2.3配合物与DNA结合的电化学性质

图22为式A-1配合物与CT-DNA作用的循环伏安图。其中曲线a是没有加入DNA的配合物的循环伏安曲线，曲线b是加入DNA后的配合物的循环伏安曲线。没加入DNA时，阴极电位(E

2.4配合物对DNA的切割作用研究

我们进一步考察了式A-1配合物对pBR322DNA的作用。凝胶电泳图23显示，式A-1配合物对DNA具有良好的切割效果，在配合物浓度为50μM就可将FormI切割成FormII。随着配合物浓度的逐渐增大切割效果增强，在800μM时FormII的转化率达到91%。这可以从式A-1配合物的结构上来解释：由于配合物分子扭曲成“V”型，使得镍原子处在“V”型的尖端，容易与DNA的磷酸酯键发生作用从而使其段裂。

最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围。也就是说，但凡在本发明的主体设计思想和精神上做出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。