一种产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的养殖用培养基质、养殖方法和抗菌肽提取方法

技术领域

本发明属于抗菌肽生产技术领域，具体涉及一种产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的养殖用培养基质、养殖方法和抗菌肽提取方法。

背景技术

滥用抗生素导致病原菌抗药性增强，甚至催生“超级致病菌”，从而减弱抗生素使用效果。目前，抗生素耐药性与安全性已被世界卫生组织列为全球公共卫生的威胁之一。“饲料禁止使用抗生素”的形势已经非常明朗，尤其是在抗生素越来越被严格限制使用的背景下，寻找绿色安全高效的抗生素替代品成为行业迫切所需。

昆虫源抗菌肽因具有良好的抑菌活性、稳定性及安全性，被认为是潜在的抗生素替代品之一。作为昆虫宿主防御机制的代表,抗菌肽广泛存在于许多昆虫体内，是昆虫宿主天然免疫系统的主要构成成分。昆虫抗菌肽主要是由小分子次级代谢物以及小蛋白和肽组成，对细菌、真菌及病毒等病原体都有着防御机制，具有较大的“替抗”潜力。

首个昆虫抗菌肽发现于1981年，系从家蚕滞育蛹中鉴定出的诱导抑菌因子，被命名为天蚕素。目前在抗菌肽数据库中(https://aps.unmc.edu/AP/)，报道的昆虫抗菌肽共有约325种，根据氨基酸特性可以分为四大类：(1)含半胱氨酸的抗菌肽；(2)α-螺旋结构抗菌肽；(3)含脯氨酸的抗菌肽；(4)含甘氨酸的抗菌肽。

在众多昆虫中，黑水虻幼虫含有50多种抗菌肽基因，是迄今为止在昆虫中发现的最大的抗菌肽家族，同时黑水虻被人们发现其具有将废弃物转化为自身资源的能力，能够在多致病菌环境下生存并产生相对应的抗菌物质。黑水虻抗菌肽在不同基质下有不同种类的表达，这为黑水虻养殖且产高活性抗菌肽提供了科学依据。但目前仍缺乏一种产高活性抗菌肽的黑水虻培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的养殖用培养基质、养殖方法和抗菌肽提取方法。本发明所述培养基质能够实现黑水虻幼虫快速有效地生产高活性抗菌肽。

本发明提供了一种产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的养殖用培养基质，所述培养基质包括麦麸，所述培养基质的含水率为65～70％。

本发明还提供了上述技术方案所述培养基质在养殖产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫中的应用。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述培养基质养殖产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的方法，包括以下步骤：

将3日龄黑水虻幼虫置于上述技术方案所述培养基质中进行养殖，在养殖过程中，每日翻料。

优选的是，所述养殖的密度为1头/cm

本发明还提供了一种黑水虻抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：

通过过筛收集上述技术方案所述方法养殖的黑水虻幼虫，在幼虫体内注入菌液进行抗菌肽的诱导，诱导后饥饿处理24h，采用血淋巴收集法提取黑水虻抗菌肽。

优选的是，当黑水虻幼虫为8日龄时，进行所述收集的操作。

优选的是，所述过筛为使用8目筛网将幼虫与培养基质分离。

优选的是，所述菌液包括金黄色葡萄球菌菌液，所述金黄色葡萄球菌菌液中金黄色葡萄球菌的浓度为10

本发明还提供了上述技术方案所述提取方法提取得到的黑水虻抗菌肽。

本发明还提供了上述技术方案所述抗菌肽在制备抑制金黄色葡萄球菌的菌剂中的应用。

本发明提供了一种产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的养殖用培养基质。本发明所述培养基质能够实现黑水虻幼虫快速有效地生产高活性抗菌肽。试验结果表明，在70％含水量的纯麦麸基质下，以1头/cm

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的不同养殖条件下抑菌圈直径结果图；

图2为本发明提供的金黄色葡萄球菌光学显微镜及荧光显微镜照片；

图3为本发明提供的金黄色葡萄球菌扫描电镜和透射电镜照片。

具体实施方式

本发明提供了一种产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的养殖用培养基质，所述培养基质包括麦麸，所述培养基质的含水率为65～70％。在本发明中，所述含水率更优选为70％。在本发明中，所述麦麸优选包括片状粗麦麸。在本发明中，所述麦麸的粒径优选为微米到毫米级别。本发明所述培养基质用于黑水虻的养殖，可以相对提高黑水虻抗菌肽的抑菌能力。

本发明还提供了上述技术方案所述培养基质在养殖产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫中的应用。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述培养基质养殖产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的方法，包括以下步骤：

将3日龄黑水虻幼虫置于上述技术方案所述培养基质中进行养殖，在养殖过程中，每日翻料。

在本发明中，所述3日龄黑水虻优选通过取黑水虻卵进行孵化获得。在本发明中，所述孵化的温度优选为25～30℃。本发明优选将黑水虻置于黑水虻饲料上进行孵化。在本发明中，所述养殖的密度优选为1头/cm

本发明还提供了一种黑水虻抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：

通过过筛收集上述技术方案所述方法养殖的黑水虻幼虫，在幼虫体内注入菌液进行抗菌肽的诱导，诱导后饥饿处理24h，采用血淋巴收集法提取黑水虻抗菌肽。在本发明中，优选当黑水虻幼虫为8日龄时，进行所述收集的操作。在本发明中，所述过筛优选为使用8目筛网将幼虫与培养基质分离。

在本发明中，所述菌液优选包括金黄色葡萄球菌菌液，所述金黄色葡萄球菌菌液中金黄色葡萄球菌的浓度优选为10

本发明还提供了上述技术方案所述提取方法提取得到的黑水虻抗菌肽。

本发明还提供了上述技术方案所述抗菌肽在制备抑制金黄色葡萄球菌的菌剂中的应用。本发明所述抗菌肽能够用于金黄色葡萄球菌所致疾病的治疗。在本发明中，所述治疗方法优选包括将本发明抗菌肽作用于金黄色葡萄球菌所致病患。本发明所述抗菌肽能够破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜结构，使细胞膜透过性发生改变；破坏金黄色葡萄球菌细胞的完整性，导致细胞表面形态的变化；引起金黄色葡萄球菌的细胞裂解及胞质流出。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种产高活性抗菌肽的黑水虻幼虫的养殖用培养基质、养殖方法和抗菌肽提取方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.取饲喂原料：纯麦麸、黄豆饼粉、花生饼粉和菜籽饼粉分别置于烘箱60～70℃下干燥3h后待用，饲喂黑水虻前调节水分含量至70％。

2.在前期使用小型孵化箱对黑水虻虫卵进行孵化，待3日龄后，进行分箱养殖，在不同的养殖条件下(如①～⑤所示)养殖到8日龄。在养殖过程中，每日翻料，直至8日龄幼虫。

①分别调节基料纯麦麸的pH值为3、5、7、9和11，用于饲喂黑水虻幼虫(虫密度为0.5头/cm

②养殖过程中，分别采用纯麦麸、纯麦麸+黄豆饼粉(1:1)、纯麦麸+花生饼粉(1:1)、纯麦麸+菜籽饼粉(1:1)饲喂黑水虻幼虫(虫密度为0.5头/cm

③分别调节饲料含水量为50％、60％、70％和80％，用于饲喂黑水虻幼虫(基质为纯麦麸，虫密度为0.5头/cm

④分别添加食盐(0％、1％、2％和3％)或大豆油(0％、2％、4％和6％)至纯麦麸中，用于饲喂黑水虻幼虫，待8日龄时使用8目筛网进行虫与虫沙分离，取百只待用。

⑤分别调节虫养殖密度为0.25头/cm

3.将①～⑤分离出来的幼虫进行漂洗，使用浓度为10

4.诱导后饥饿24小时(饥饿处理是指将分离出的黑水虻幼虫置于通风的玻璃器皿中，不再添加饲料)，采用血淋巴收集法提取黑水虻抗菌肽，获得黑水虻幼虫抗菌肽。

5.采用滤纸片法测定抑菌圈，以其直径大小来评价抑菌活性及抑菌率，从而确定最佳饲料pH值、最佳饲料配比、最佳含水量、最佳虫养殖密度和最佳食盐/大豆油添加量。

6.为进一步确定最佳条件制备的黑水虻抗菌肽具有较好的抑菌效果，对黑水虻抗菌肽抗菌特性进行研究，采用光学电子显微镜、荧光显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察在36.97μg/mL、73.94μg/mL浓度即MIC、2MIC浓度的抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞膜作用及表面形态影响(MIC浓度通过二倍稀释法获得)。

实验结果

本实施例通过抑菌圈直径大小比对判断黑水虻产抗菌肽抗菌活性高低的能力。结果如表1和图1所示。结果表明，在不同pH条件下养殖的黑水虻幼虫，经诱导后发现，pH不影响黑水虻产抗菌肽的活性高低；不同饲料配比养殖的黑水虻幼虫，经诱导后，发现纯麦麸养殖的黑水虻幼虫产抗菌肽的活性最高；不同含水量养殖的黑水虻幼虫，经诱导后，发现70％含水量养殖的黑水虻幼虫产抗菌肽的活性最高；不同含盐量养殖的黑水虻幼虫，经诱导后，发现不添加盐养殖的黑水虻幼虫产抗菌肽的活性最高；不同含油量养殖的黑水虻幼虫，经诱导后，发现不添加油养殖的黑水虻幼虫产抗菌肽的活性最高(因0％和2％添加量之间无显著性差异，为节约成本，选择0％添加量)；不同虫密度养殖的黑水虻幼虫，经诱导后，发现1头/cm

表1不同养殖条件下抑菌圈直径结果

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根据以上本发明确定最优化条件为：在70％含水量的纯麦麸基质下，以1头/cm

最优条件下黑水虻幼虫养殖的虫体特征及抗菌肽直径数据如表2：

表2最优条件下黑水虻幼虫养殖的虫体特征及抗菌肽直径数据

最优条件下黑水虻幼虫养殖的幼虫抗菌肽抑菌特性结果如下：

图2为金黄色葡萄球菌光学显微镜及荧光显微镜照片，其中A、B、C为光学显微镜照片，D、E、F为荧光显微镜照片，A、D为金黄色葡萄球菌(对照)，B、E为MIC抗菌肽处理的金黄色葡萄球菌，C、F为2MIC抗菌肽处理的金黄色葡萄球菌，抗菌肽破坏细胞膜使PI染料进入菌体，从而出现红色荧光现象。

经过不同浓度抗菌肽处理的金黄色葡萄球菌在绿色激光下能发出红色荧光，说明抗菌肽能够破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜结构，使细胞膜透过性发生改变，从而导致PI染料能够进入菌体内与核酸结合，在绿色激光下出现红色荧光现象。

图3为金黄色葡萄球菌扫描电镜和透射电镜照片，其中，A、B、C为扫描电镜图谱，D、E、F为透射电镜图谱，A、D为金黄色葡萄球菌原图(对照)，B、E为MIC抗菌肽处理的金黄色葡萄球菌，C、F为2MIC抗菌肽处理的金黄色葡萄球菌。

抗菌肽对金黄色葡萄球菌表面形态的影响：通过扫描电镜可以观察到，MIC浓度的抗菌肽处理的金黄色葡萄球菌表面变皱，细胞发生粘附等现象，在2MIC浓度下处理的细胞，这些破坏现象更为严重，结果表明，抗菌肽能破坏金黄色葡萄球菌细胞的完整性，导致细胞表面形态的变化。

抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞内微观变化的影响：观察到未处理的金黄色葡萄球菌细胞质外观均匀，细胞壁和细胞膜清晰，而经抗菌肽处理后的金黄色葡萄球菌部分细胞细胞壁破碎，细胞周围环境可以看到部分细胞碎片，结果表明，抗菌肽可以引起金黄色葡萄球菌的细胞裂解及胞质流出。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。