一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及宠物病毒病检测技术领域，尤其是一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒及方法。

背景技术

犬细小病毒病(Canine parvovirus disease)是由犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)引起的犬的一种急性传染病，该病在临床上主要表现为发热、呕吐、出血性肠炎、白细胞减少和幼犬心肌炎。目前免疫接种是防治该病的主要措施。犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine Distemper virus,CDV)感染引起的急性、高度接触性传染疾病，以双向热型、结膜炎、肺炎、肠炎和神经症状为临床症状，死亡率高。由于高水平母源抗体的干扰或疫苗抗原性差异，往往导致免疫失败而引起犬瘟热的发生。犬疱疹病毒病毒病是由犬疱疹病毒(Canineherpesvirus,CHV)感染引起的新生幼犬致死性感染的一种疾病。21日龄以上的幼犬主要表现为上呼吸道症状，流鼻涕、咳嗽和打喷嚏等；同时可造成母犬不孕、流产和死胎以及公犬的阴茎炎和包皮炎。

近年来，由于疫苗抗原性差异，幼犬母源抗体干扰，免疫犬抗体水平过低导致免疫失败，引发CPV和CDV感染的报道不断出现。因此及时了解幼犬CPV、CDV母源抗体水平和免疫犬抗体水平，确定最佳的疫苗免疫时机，对于CPV和CDV的防控具有重要意义。

通过检测母源抗体及接种后抗体的水平，确定其是否达到预期的保护性抗体滴度，从而确定疫苗的最适接种时间。目前能够检测犬血清抗体水平的技术主要有血清中和试验、酶联免疫吸附试验、血凝抑制试验等方法。血清中和试验是检测血清中和抗体的标准方法，也常用来评价疫苗免疫效果的好坏。虽然血清中和试验灵敏特异，但花费时间较长。另外对试验操作人员要求水平较高，需要熟练掌握细胞接毒后细胞的病变现象，不利于快速检测血清抗体。酶联免疫吸附试验(ELISA)是免疫学检测技术中广泛应用于血清抗体检测的一项技术，它是将抗原或者抗体吸附在固相载体上，借助于抗原-抗体反应实现检测目的。但由于ELISA方法检测成本高以及需要特殊的仪器，需专业技术人员操作，导致这些检测只能局限于实验室或相应的宠物诊疗机构。血凝抑制试验(HI)被广泛用于定量检测CPV特异性抗体，是CPV抗体检测的金标准。但HI检测结果容易受检测者主观影响，且检测需要猪新鲜的红细胞和完整且大量的病毒粒子，在操作时容易受一些非特异性抑制剂的影响。

这些方法有一个共同的缺点：一次试验只能检测一种病原抗体水平，无法通过灵活地组合实现对多种病原抗体高通量、多通道的高效检测。因此这些技术方法都不适用于动物群体性疾病的实时检测。液相芯片是一种新型生物芯片技术平台，具有操作简便，敏感性强，灵活多变、检测范围广等显著特点，其最大的优势是可以同时对同一血清样品中多种病原抗体进行定性分析，实现多种病原抗体的实时监测。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒及方法，本发明能够满足快速、准确、高通量的宠物疫病抗体监测要求。

本发明的技术方案为：一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒，包括偶联磁珠组、检测抗体和报告分子；

所述的偶联磁珠组分别由检测犬细小病毒的磁珠CPV-35、检测犬瘟病毒的磁珠CDV-45，检测犬疱疹病毒的磁珠CHV-43组成；

所述的磁珠CPV-35是CPV VP1重组蛋白与第35号磁珠偶联获得；

所述的磁珠CDV-45是CDV天然抗原与第45号磁珠偶联获得；

所述的磁珠CHV-43是CHV天然抗原与第43号磁珠偶联获得。

作为优选的，所述检测抗体为生物素标记的抗犬IgG抗体。

作为优选的，所述报告分子为荧光蛋白或荧光素标记的链霉亲和素。

作为优选的，所述荧光蛋白或荧光素选自藻红蛋白、Cy3、Cy5中的一种。

作为优选的，所述偶联磁珠的制备方法为：

将3种不同编号(35#、45#、43#)的空白磁珠活化后，用偶联缓冲液重悬并分散磁珠，分别加入CPV VP2重组蛋白溶液、CDV天然抗原溶液、CHV天然抗原溶液混匀后室温避光下进行偶联反应2小时，离心去上清，获得3种包被不同抗原的磁珠，即偶联磁珠。

作为优选的，所述的偶联缓冲液为50～100mM乙磺酸(MES)，pH 5.0～6.0。

作为优选的，所使用的CPV VP2重组蛋白溶液、CDV天然抗原溶液、CHV天然抗原溶液的浓度为0.3～3mg/mL。

作为优选的，所述空白磁珠活化步骤包括以下步骤：

(1)、磁珠预处理：取3种不同编号(35#、45#、43#)的空白磁珠，离心弃上清，用活化缓冲液重悬磁珠，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，离心后弃上清。

(2)、磁珠的活化：将预处理的磁珠分别用活化缓冲液重悬，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，再依次加入N-羟基磺基琥珀酰亚胺溶液(Sulfo-NHS)和碳二亚胺溶液(EDC)，混匀后，室温避光作用20min，以得到活化磁珠。

作为优选的，所述活化缓冲液为100mM NaH

作为优选的，本发明还提供一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的方法，采用上述液相芯片试剂盒进行检测，具体包括如下步骤：

S1)、偶联磁珠与样品中的抗体结合：将偶联磁珠与预处理的待测样品于室温、避光条件下震荡孵育1～2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；

S2)、加入检测抗体及反应：将生物素标记的抗犬IgG抗体加入至上一步反应体系中，于室温、避光条件下震荡孵育30～60min，用洗涤缓冲液洗涤3次；

S3)、结果检测：将报告分子加入到上步反应体系中，于室温、避光条件下震荡孵育30～60min，用洗涤缓冲液洗涤3次；

S4)、结果检测：往反应体系中加入洗涤缓冲液，室温、避光条件下震荡60s，置于Luminex 200液相芯片系统读取荧光强度。

S5)、结果分析：先计算阴性对照血清的平均荧光强度值和标准差，以阴性血清的平均荧光强度值与3倍标准差的和作为临界值，高于临界值视为阳性。

作为优选的，步骤S1)中，所述待测样品为血清样品，待测样品预处理包括将待测样品进行1：10～50倍稀释、过滤。

作为优选的，步骤S1)中，所述偶联磁珠与预处理后的待测样品的体积比为1：(0.8～1.2)。

作为优选的，步骤S4)中，所述洗涤缓冲液为PBS-BN溶液、pH 7.4，其含有如下体积百分比的组分：

PBS，0.1％BSA，0.02％Tween-20，0.05％叠氮钠。

本发明的有益效果为：

1、本发明仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子，即多重检测。可以满足宠物疫病监测的要求，可极大提高宠物疫病检测的效率，缩短检测周期，减少成本，具有巨大市场应用前景。

2、本发明建立的三种免疫磁珠(偶联磁珠)，既可多种选择性地组合使用又可单独使用，充分满足了市场监测的不同需求。

附图说明

图1为本发明CPV阳性血清、CDV阳性血清和CHV阳性血清液相芯片方法检测实验结果图；其中35号磁珠表示偶联CPV VP2重组蛋白，45号磁珠表示偶联CDV天然抗原，43号磁珠表示偶联CHV天然抗原，NS表示阴性血清；

图2是本发明液相芯片试剂盒及检测方法的特异性实验结果图；35号磁珠表示偶联CPV VP2重组蛋白，45号磁珠表示偶联CDV天然抗原，43号磁珠表示偶联CHV天然抗原。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明：

实施例1

本实施例提供一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒中的偶联磁珠的制备方法

一、抗原

本研究中采用的CPV VP2重组蛋白购自海肽生物科技(上海)有限公司，CDV天然抗原和CHV天然抗原购自EastCoast Bio。

二、抗原与磁珠的偶联

参照Luminex公司的

(1)磁珠从冰箱取出，室温静置10min，涡旋10s，超声10s，使微球均匀散开，根据实验目的取适量的磁珠于低吸附离心管中，在磁力架上静置30-60s，轻轻吸弃上清(不要吸走微球)；

(2)加入100μL ddH

(3)加入80μL 100mM pH 6.2的Na

(4)加入10μL 50mg/mL的N-羟基磺基琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)，和10μL 50mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐[1-thyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimideHydrochloride，EDC]，涡旋10s，超声10s，室温避光孵育20min；

(5)磁力架上静置30-60s，轻轻吸弃上清；

(6)加入250μL 50-100mM pH 5.0-6.0的2-(N-吗啉基)乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate,MES)，涡旋10s，超声10s，并放于磁力架上，轻轻移走上清；

(7)重复步骤(6)一次。

(8)往上述活化后的微球中加入100μL 50-100mM pH 5.0-6.0的MES，涡旋10s，超声10s，分别在混匀的磁珠中加入1～20μg的蛋白抗原(加入的抗原量视不同抗原而定)，再用MES溶液定容至500μL，涡旋10s，超声10s；

(9)室温、避光条件下缓慢震荡孵育2h，并放于磁力架上静置30-60s，轻轻移走上清；

(10)再加入500-1000μL PBS-TBN，涡旋混匀后，涡旋10s，超声10s，并放于磁力架上静置30-60s，轻轻移走上清；

(11)重复操作步骤(10)一次；

(12)加入适量PBS-TBN重悬磁珠，即得偶联抗原的磁珠：CPV-35、CDV-45、CHV-43，4℃避光保存。

实施例2

本实施例提供一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒

本实施例所述的液芯片中含有实施例1制备的偶联磁珠、检测抗体和报告分子。

所述检测抗体为生物素标记的抗犬IgG抗体。

所述报告分子为荧光蛋白或荧光素标记的链霉亲和素。

所述荧光蛋白或荧光素选自藻红蛋白、Cy3、Cy5中的一种。

实施例3

本实施例提供一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的方法

参照Luminex公司的

(1)每孔加入50μL(约2500个)偶联有抗原的磁珠和50μL已处理的待检测样品(血清)，室温震荡(500r/min)避光孵育1～2h，用PBS-TBN溶液洗涤3次，200μL/孔。

(2)加入已经稀释好的生物素标记的抗犬IgG抗体，100μL/孔，室温震荡(500r/min)避光孵育30～60min，用PBS-TBN溶液洗涤3次，200μL/孔。

(3)加入已经稀释好的报告分子，100μL/孔，室温震荡(500r/min)避光孵育30～60min，用PBS-TBN溶液洗涤3次，200μL/孔。

(4)每孔加入100μL PBS-TBN溶液重悬，于Luminex 200液相芯片检测系统进行读取中位数荧光强度(MFI)。

(5)结果分析：以液相芯片检测系统对阴性对照血清进行3次重复检测，计算每份血清的平均荧光强度(Median Fluorescent Intensity,MFI)，计算阴性血清的均值(平均荧光强度)和标准差，以阴性血清的均数与3倍标准差的和(cut-off值)作为检测指标的临界值，高于临界值就视为该样品阳性。

按照上述实施例3所述的方法，对CPV阳性血清样品、CDV阳性血清样品和CHV阳性血清样品进行检测，检测结果如图1所示，35号磁珠表示偶联CPVVP2重组蛋白，45号磁珠表示偶联CDV天然抗原，43号磁珠表示偶联CHV天然抗原，NS表示阴性血清；从中可以看出，本发明方法对三种单独的阳性血清能很好的检测，且无交叉反应。

实施例4

特异性试验

利用实施例2所述的液相芯片试剂盒及实施例3所述的方法，对CPV、CDV、狂犬病毒(Canine Rabies Virus,CRV)、犬腺病毒(Canine Adenovirus,CADV)、犬副流感病毒(Canine Parainfluenza Virus,CPIV)、犬冠状病毒(CanineCoronavirus,CCoV)和CHV的阳性血清进行检测。

检测结果如图2所示，CPV阳性血清、CDV阳性血清、CHV阳性血清的荧光值较高，呈阳性；而其它病毒感染的阳性血清荧光值都很低，呈阴性，说明本发明液相芯片及检测体系特异性良好。

实施例5

灵敏性试验

用样品稀释液稀释阳性血清，稀释倍数为1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600。利用实施例2所述的液相芯片检测试剂盒及实施例3所述的方法，以及ELISA试剂盒对三种阳性血清稀释液检测，每个稀释度重复检测3次，记录MFI值和OD值，计算平均值。

检测结果显示，对于CPV阳性血清，本发明液相芯片试剂盒检测到的抗体效价最低为1:3200；对于CDV阳性血清，本发明液相芯片试剂盒检测到的抗体效价最低为1:1600；对于CHV阳性血清，本发明液相芯片检测试剂盒检测到的抗体效价最低为1:1600。上述结果表明，本发明研制备的液相芯片检测试剂盒比现有商品ELISA试剂盒的敏感性相当。

实施例6

重复性试验

利用实施例2所述的液相芯片试剂盒及实施例3所述的方法分别检测5管不同阳性血清，每管重复检测3次，记录MFI值，计算组间变异系数(CV)和组内变异系数(CV)。

检测结果如表1和表2所示，结果显示，本发明方法平均批内变异系数(CV)为2.91％(表1)，平均批间变异系数为5.27％(表2)，说明本发明液相芯片及结果可信，重复性好。

表1批内重复性测试结果(n＝3)

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表2批间重复性测试结果(n＝3)

实施例7

宠物样品的检测

待测样品前处理：取10μL待测血清样品加入490μL血清稀释液中，将血清做1:50倍稀释。对9份宠物血清样品采用上实施例3所述方法进行3种病原抗体检测。

检测结果如表3所示，9份宠物血清样品的结果均为阳性，显示这9只宠物均有CPV、CDV和CHV抗体。

表3液相芯片方法对9份宠物血清样品的检测结果

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上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。