一种氟康唑中氯乙酰氯的检测方法

技术领域

本申请涉及化学检测的技术领域，具体涉及一种氟康唑中氯乙酰氯的检测方法。

背景技术

作为一种新型三唑类抗真菌药物，氟康唑(CAS号为86386-73-4)为广谱抗真菌药，具有吸收快、体内分布广、半衰期长、耐受性好、不良反应小等优点；另外，氟康唑治疗人和动物的真菌感染的效果较好，因此，氟康唑的应用十分广泛。

由氟康唑的合成工艺路线可知，氯乙酰氯(CAS号为79-04-9)是反应的起始物料，常常存在于氟康唑药物中。氯乙酰氯带有警示结构基团，是潜在的基因毒性杂质，可能具有遗传毒性和致癌性。为保证氟康唑药物的安全性和有效性，有必要对氟康唑中的氯乙酰氯杂质进行检测，进而对氟康唑中的氯乙酰氯杂质进行控制。

目前，针对氟康唑中氯乙酰氯的痕量检测，尚无成熟的检测方法。因此，建立一种灵敏度高的方法对氟康唑中的氯乙酰氯杂质进行检测是十分必要的。

发明内容

为了能够检测氟康唑中的痕量杂质氯乙酰氯，同时提高检测方法的精密度和准确度，本申请提供一种氟康唑中氯乙酰氯的检测方法。

本申请提供了一种氟康唑中氯乙酰氯的检测方法，采用如下的技术方案：

一种氟康唑中氯乙酰氯的检测方法，具体包括以下步骤：

配制溶液：分别配制标准溶液和供试品溶液；

测定：利用液质联用对所述标准溶液和所述供试品溶液进行检测，通过绘制所述标准溶液的标准曲线，获得所述供试品溶液中氯乙酰氯的含量。

本申请利用上述检测方法，通过绘制氯乙酰氯标准溶液的标准曲线，得线性回归方程；然后将供试品溶液的测试结果代入标准曲线，即可快速获得供试品溶液中氯乙酰氯的含量。上述检测方法具有高灵敏度、高重复性、高准确性、高精密度的优点。

本申请采用的测定方法为液质联用(LC-MS)，该测定方法以液相色谱作为待测样品中氯乙酰氯和其他物质的分离系统，质谱为氯乙酰氯的检测系统。液质联用将液相色谱对待测样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。

液相色谱法对于待测样品具有分离度较强的特点，通过选择合适的色谱柱、柱温、流动相、洗脱程序以及其他参数条件，能够有效提高氯乙酰氯和其他物质的分离效果，不仅可以为质谱测试分析提供足够的离子，还能将对质谱有干扰的杂质初步分离出去，避免干扰杂质对后续质谱造成影响，进而获得良好的峰型参数，从而能够有效提高检测结果的准确性和精密度。

优选地，所述液质联用中：液相色谱采用的色谱柱为安捷伦InfinityLabPoroshell120SB-AQ柱，3.0×100mm，2.7μm。

由于SB-Aq色谱柱具有亲水性的表面，可以有效地防止固定相的塌陷；SB-Aq色谱柱表面为多孔核-壳填料颗粒，可以提供更高的通量和更高的分离度。因此，本申请采用SB-Aq柱分离待测样品，可以获得良好的重复性和出色的峰形。

优选地，所述液质联用中：液相色谱的测试条件为：柱温为25-35℃，进样体积为15-25μL，流速为0.2-0.4mL/min，流动相A为缓冲溶液，流动相B为有机溶剂。

优选地，所述液质联用中：液相色谱采用流动相梯度洗脱方法对待测溶液进行分离；

所述流动相梯度洗脱方法的程序为：0-1.0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；1.0-4.0min时，流动相A由95％线性减少至5％，流动相B由5％线性增加至95％；4.0-6.0min，流动相A为5％，流动相B为95％；6.0-6.1min时，流动相A由5％线性增加至95％，流动相B由95％线性减少至5％；6.1-10.0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；流动相A和流动相B均以体积百分比计。

进一步地，所述流动相A为甲酸-水溶液；所述甲酸-水溶液中甲酸的体积浓度为0.07-0.13％。

进一步地，所述流动相B为乙腈。

本申请选择使用甲酸-水溶液作为流动相A，并将甲酸-水溶液中甲酸的体积浓度控制在上述范围内，能够使待测样品维持在合适的pH环境下，提高待测样品的稳定性，有效避免了待测样品的解离。

进一步地，所述流动相A为乙酸-水溶液；所述乙酸-水溶液中乙酸的体积浓度为0.09-0.15％。

优选地，所述液质联用中：质谱测试条件为：离子化形式为ESI，极性为负，离子化电压为-4500V，碰撞气压力为8psi，雾化气压力为40psi，辅助加热气压力为40psi，气帘气压力为20psi，干燥气温度为280-320℃。

优选地，所述液质联用中：MRM扫描参数为：母离子为93.0，子离子为35.0，驻留时间为200ms。

优选地，所述标准溶液的配制方法为：分别精密移取氯乙酰氯储备液0.10mL、0.25mL、0.40mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL于不同容量瓶中，分别加乙腈将体积补足至1mL，用0.01％氨水溶液稀释至刻度，涡旋1min，即得一系列不同浓度的标准溶液。

综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：

通过液质联用技术对氟康唑中的氯乙酰氯进行检测，本申请提供了一种检测速度快、操作方法简单的检测方法。

本申请通过对液质联用中的液相色谱与质谱的相关测试条件进行筛选与优化，提供的氟康唑中氯乙酰氯的检测方法具有检出限低、精密度高、重复性高、准确度高的优点。

附图说明

图1为本申请实施例1中氯乙酰氯标准溶液的标准曲线图。

具体实施方式

本申请提供一种氟康唑中氯乙酰氯的检测方法，具体包括以下步骤：

配制溶液：分别配制标准溶液和供试品溶液；

测定：利用液质联用对标准溶液和供试品溶液进行检测，通过绘制标准溶液的标准曲线，获得供试品溶液中氯乙酰氯的含量。

其中，液质联用中液相色谱的测试条件为：色谱柱为安捷伦InfinityLabPoroshell120SB-AQ柱，3.0×100mm，2.7μm；柱温为25-35℃，进样体积为15-25μL，流速为0.2-0.4mL/min，流动相A为缓冲溶液，流动相B为有机溶剂；

液相色谱采用流动相梯度洗脱方法对待测溶液进行分离；流动相梯度洗脱方法的程序为：0-1.0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；1.0-4.0min时，流动相A由95％线性减少至5％，流动相B由5％线性增加至95％；4.0-6.0min，流动相A为5％，流动相B为95％；6.0-6.1min时，流动相A由5％线性增加至95％，流动相B由95％线性减少至5％；6.1-10.0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；流动相A和流动相B均以体积百分比计。

进一步地，流动相A为甲酸-水溶液；甲酸-水溶液中甲酸的体积浓度为0.07-0.13％；流动相B为乙腈。

进一步地，流动相A还可以为乙酸-水溶液；乙酸-水溶液中乙酸的体积浓度为0.09-0.15％。

其中，液质联用中质谱测试条件为：离子化形式为ESI，极性为负，离子化电压为-4500V，碰撞气压力为8psi，雾化气压力为40psi，辅助加热气压力为40psi，气帘气压力为20psi，干燥气温度为280-320℃。

具体地，液质联用中MRM扫描参数为：母离子为93.0，子离子为35.0，驻留时间为200ms。

进一步地，标准溶液的配制方法为：分别精密移取氯乙酰氯储备液0.10mL、0.25mL、0.40mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL于不同容量瓶中，分别加乙腈将体积补足至1mL，用0.01％氨水溶液稀释至刻度，涡旋1min，即得一系列不同浓度的标准溶液。

本申请中，所用仪器液质联用仪为液相色谱-串联质谱联用仪，型号为ABSCIEXTripleQuad5500+(厂家ABSCIEX)；所用氟康唑原料及其来源如表1所示；其余原料、试剂、溶剂等均可通过商购获得。

其中，氟康唑中的氯乙酰氯带有警示结构，参照ICH指导原则M7部分制定限度为3.75ppm。

表1实施例所用的原料及其来源

以下结合实施例以及性能检测试验对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例

实施例1

实施例1提供了一种氯乙酰氯标准溶液的标准曲线。

本实施例的具体步骤如下：

S1：配置标准溶液

以含氯乙酰氯151.2894ng/mL的氯乙酰氯储备液作为标准液，分别精密移取0.10mL、0.25mL、0.40mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL于不同容量瓶中，分别加乙腈将体积补足至1mL，用0.01％氨水溶液稀释至刻度，涡旋1min，即得一系列不同浓度的标准溶液，标准溶液的浓度分别为1.51ng/mL、3.78ng/mL、6.05ng/mL、7.56ng/mL、11.35ng/mL、15.13ng/mL。

S2：LC-MS的测试条件

S2.1：液相色谱测试条件

色谱柱为安捷伦InfinityLab Poroshell 120SB-AQ柱(3.0×100mm，2.7μm)，色谱柱编号为GB-L-20-09-121；柱温为30℃；进样体积为20μL；流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为乙腈；流速为0.30mL/min；采用流动相梯度洗脱方法对待测样品溶液进行洗脱；

流动相梯度洗脱条件具体为：0-1.0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；1.0-4.0min时，流动相A由95％线性减少至5％，流动相B由5％线性增加至95％；4.0-6.0min，流动相A为5％，流动相B为95％；6.0-6.1min时，流动相A由5％线性增加至95％，流动相B由95％线性减少至5％；6.1-10.0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；流动相A和流动相B均以体积百分比计。

S2.2：质谱测试条件

质谱测试条件为：离子化形式为ESI，极性为负，离子化电压为-4500V，碰撞气压力为8psi，雾化气压力为40psi，辅助加热气压力为40psi，气帘气压力为20psi，干燥气温度为280-320℃。

S2.3：氯乙酰氯的质谱多反应监测(MRM)扫描参数

氯乙酰氯的MRM扫描参数如表2所示。

表2氯乙酰氯的MRM扫描参数

S3：测定结果与分析

利用S3中LC-MS的测试条件，对步骤S2中一系列不同浓度的标准溶液进行测试，根据测试结果，绘制标准曲线。

S3.1：标准曲线与回归方程

以标准溶液中氯乙酰氯的响应值对氯乙酰氯的相应浓度进行回归分析，得到标准曲线如图1所示。

通过图1可知，氯乙酰氯标准曲线的回归方程为y＝1609.53064x-459.40944，相关系数为r＝0.99234，表明氯乙酰氯的浓度与峰面积呈良好的线性关系，本申请提供的氯乙酰氯的标准曲线可以用来定量检测氟康唑中氯乙酰氯的含量。

S3.2：标准曲线的检出限

检出限是通过检测响应信号与噪声之比约为3：1，即，以3倍信噪比(S/N)得到的氯乙酰氯的检出限。

经测定，氯乙酰氯检测方法的检出限(LOD)为0.76ng/mL(0.38ppm或0.38ug/g)，表明该检测方法具有较高的灵敏度。

S3.3：标准曲线的定量限

定量限是通过检测响应信号与噪声之比约为10：1，即，以10倍信噪比(S/N)得到的氯乙酰氯的定量限。然后配制浓度为定量限的标准溶液6份，并进行测试，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察定量限的重复性。

检测结果：如表3所示。

表3定量限重复性检测结果

通过表3的检测结果，可知，氯乙酰氯检测方法的定量限(LOQ)为1.51ng/mL；且6份定量限溶液中氯乙酰氯峰面积的RSD为7.4％，表明本申请提供的氯乙酰氯检测方法中定量限的溶液具有良好的重复性。

S3.4：标准曲线的重复性与精密度

配制供试品溶液：分别精密称取氟康唑原料20mg，精确到0.01mg，置于10mL容量瓶中，准确加入1mL乙腈涡旋溶解，再加0.01％氨水溶液稀释并定容至刻度，涡旋1min，即得供试品溶液。利用步骤S2中LC-MS的测试条件，对供试品溶液进行测定。

利用上述供试品溶液和步骤S1提供的标准溶液，配制了浓度为7.56ng/mL、7.66ng/mL的加标供试品溶液，然后利用步骤S2提供的LC-MS检测条件对上述加标供试品溶液进行检测，并根据加标浓度和加标供试品溶液的检测浓度结果，计算加标供试品溶液的加标回收率。

将加标供试品检测浓度与加标浓度进行比较，计算氯乙酰氯的平均回收率，考察检测方法的重复性。对每个浓度水平平行测定6次，得其相对标准偏差，考察检测方法的精密度。

检测结果：如表4所示

表4重复性与精密度检测结果

由表4可知，浓度为7.56ng/mL的加标供试品溶液经过测试的加标回收率在102.4-109.4％范围内，相对标准偏差为2.6％；浓度为7.66ng/mL的加标供试品溶液经过测试的加标回收率在93.9-105.1％范围内，相对标准偏差为4.3％。综上分析，本申请提供的氯乙酰氯的检测方法中的加标回收率接近于100％，表明本申请提供的氯乙酰氯的检测方法具有较高的重复性；且相对标准偏差均小于5.0％，表明本申请提供的氯乙酰氯的检测方法具有较高的精密度。

S3.5：标准曲线的准确度

配制供试品溶液：分别精密称取的氟康唑原料20mg，精确到0.01mg，置于10mL容量瓶中，准确加入1mL乙腈涡旋溶解，再加0.01％氨水溶液稀释并定容至刻度，涡旋1min，即得供试品溶液。利用步骤S2中LC-MS的测试条件，对供试品溶液进行测定。

利用上述供试品溶液和步骤S1提供的标准溶液，配制了50％限度浓度加标供试品溶液、100％限度浓度加标供试品溶液和150％限度浓度加标供试品溶液(浓度分别为3.78ng/mL、7.56ng/mL、11.35ng/mL)，然后利用步骤S2提供的LC-MS检测条件对上述加标供试品溶液进行检测，并根据加标浓度和加标供试品溶液的检测浓度结果，计算加标供试品溶液的加标回收率。(注：氯乙酰氯的限度浓度为3.75ppm，即7.56ng/mL)

将加标供试品检测浓度与加标浓度进行比较，计算氯乙酰氯的平均回收率，对每个浓度水平平行测定3次，计算相对标准偏差，考察检测方法的准确度。

检测结果：如表5所示。

表5准确度检测结果

由表5的检测结果可知，加标供试品溶液的加标回收率在99.6-108.3％之间，加标回收率接近于100％，表明本申请提供的氯乙酰氯的检测方法具有较高的准确性。

实施例2

本实施例提供了一种氟康唑原料中氯乙酰氯的检测方法。

根据实施例1提供的配制供试品溶液的方法，分别精密称取三批次(批号分别为11#、12#、13#)的氟康唑原料20mg(精确到0.01mg)，置于10mL容量瓶中，准确加入1mL乙腈涡旋溶解，再加0.01％氨水溶液稀释并定容至刻度，涡旋1min，即得供试品溶液。

利用实施例1提供的LC-MS检测条件下，分别精密量取上述供试品溶液20μL注入液质联用仪中进行检测，然后将检测结果与标准曲线对照，即可获得氟康唑原料中氯乙酰氯杂质的检测结果。

检测结果：如表6所示。

实施例3

本实施例提供了一种氟康唑氯化钠注射液中氯乙酰氯的检测方法。

分别精密移取三批次(批号分别为21#、22#、23#)的氟康唑氯化钠注射液25mL，置于冻干杯中，冷冻干燥后，加入50％乙腈复溶后转移至5mL容量瓶中定容，即可获得供试品溶液。

利用实施例1提供的LC-MS检测条件下，分别精密量取上述供试品溶液20μL注入液质联用仪中进行检测，然后将检测结果与标准曲线对照，即可获得氟康唑氯化钠注射液中氯乙酰氯杂质的检测结果。

检测结果：如表6所示。

检测结果

实施例2与实施例3获得的氟康唑原料中氯乙酰氯与氟康唑氯化钠注射液中氯乙酰氯的检测结果如表6所示。

表6氟康唑原料和氟康唑氯化钠注射液中氯乙酰氯的检测结果

由上表可知，利用本申请中氟康唑中氯乙酰氯的检测方法对市售氟康唑原料和市售氟康唑氯化钠注射液中的氯乙酰氯杂质进行检测，检测结果为市售氟康唑原料和市售氟康唑氯化钠注射液均不含有氯乙酰氯杂质。

实施例4

本实施例提供了一种氟康唑中氯乙酰氯的检测方法。

待测溶液的配制：取实施例1中的150％限度浓度加标供试品溶液、100％限度浓度加标供试品溶液、50％限度浓度加标供试品溶液、定量限溶液、检测限溶液(浓度分别为11.35ng/mL、7.56ng/mL、3.78ng/mL、1.51ng/mL、0.76ng/mL)作为5份待测溶液。

(1-2)测定：利用实施例1提供的检测方法和标准曲线对上述5份待测溶液进行检测，分别平行测定3次，计算待测溶液的回收率和相对标准偏差。

检测结果：如表7所示。

表7实施例4中检测方法的检测结果

对比例

对比例提供了一种氟康唑中氯乙酰氯的检测方法。

本对比例是参考申请号为202110530984.4的专利对氟康唑中氯乙酰氯进行检测的。

具体方法为：

(1)配制对照溶液：精密称取氯乙酰氯对照品约150mg，利用甲醇作为稀释液，配制浓度为1.51μg/ml的氯乙酰氯对照溶液。

配制待测溶液：分别精密称取氟康唑原料20mg，精确到0.01mg，置于10mL容量瓶中，准确加入1mL甲醇涡旋溶解，即得供试品溶液。并利用氯乙酰氯对照溶液配制加标浓度分别为11.35ng/mL、7.56ng/mL、3.78ng/mL、1.51ng/mL、0.76ng/mL的5份待测溶液。

(2)气相色谱法的测定条件

色谱柱为填料为改性聚乙二醇(ZebronZB-FFAP30m×0.32mm，0.5μm的色谱柱)；柱温：60℃保留20分钟；进样口温度：200℃检测器温度：220℃；进样量：3μl；载气：N2；分流比：2：1线速率：50cm/sec。

(3)测定

待系统稳定后，进甲醇溶液1针，对照溶液5针，待测溶液1针，记录色谱图。

对上述5份待测溶液进行检测，分别平行测定3次，计算待测溶液的回收率和相对标准偏差。

待测溶液中氯乙酰氯的检测浓度＝待测溶液图谱中氯乙酰氯的峰面积/5针对照溶液图谱中氯乙酰氯的平均峰面积×对照溶液中氯乙酰氯的浓度。

检测结果：如表8所示。

表8对比例中检测方法的检测结果

结合表7和表8的检测结果，利用对比例提供的检测方法对氟康唑中氯乙酰氯检测时，当待测溶液中氯乙酰氯的浓度为0.76ng/mL时，检测结果为未检出；而本申请提供的检测方法的检测限低至0.76ng/mL，进一步证明了本申请提供的检测方法具有较高的灵敏度。

当待测溶液中氯乙酰氯的浓度为同一水平时(11.35ng/mL、7.56ng/mL、3.78ng/mL、1.51ng/mL)，相比于对比例1提供的检测方法，利用本申请的检测方法获得的检测结果的回收率更接近100％，且相对标准偏差较小，表明本申请提供的检测方法具有较高的准确度和精密度。

综上所述，本申请提供的氟康唑中氯乙酰氯的检测方法检测速度快、操作方法简单，且该检测方法具有检出限低、定量限重复性好、精密度高、重复性高、准确度高的优点。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。