人类脐带衍生组合物及其用于治疗神经病变的用途

技术领域

本专利申请主张2021年3月3日提交的美国临时专利申请第63/156123及2021年8月27日提交的美国临时专利申请第63/237602的优先权，其各自的全部内容通过引用而并入本文。

背景技术

本公开一般涉及神经生物学、医学及医疗程序的领域。更具体而言，其涉及具有经改良的炎症/抗炎症特性的从人类脐带(hUC)材料中萃取的经改良的生物材料、以及这些材料在神经病变的治疗中的用途。

疼痛性神经病变大部分为非手术性地进行治疗，通常通过全身施用镇痛剂或NSAIDs(非类固醇抗发炎药)来治疗疼痛。作为第一道防线，镇痛剂及NSAIDs可根据损伤类型来解决神经性疼痛；然而，若镇痛剂或NSAID疗法不能缓解疼痛，则二级治疗选项会变得更具侵入性或风险更大，例如施用类固醇抗发炎药(如皮质类固醇)、抗惊厥(anti-convulsant)药物(如普瑞巴林(pregabalin))或手术会成为选项。

不幸的是，现有的第一线治疗如镇痛剂及NSAIDs的限制在于它们不能有效地解决许多患者的疼痛性神经病变。许多患者将接受二级治疗选项，例如手术或伴随更大的副作用风险的药物(即类固醇或抗惊厥药)。接受这些更具风险的疗法的大多数患者通常会经历的副作用包括体液滞留(fluid retention)、体重增加、头痛、胃痛及肿胀。因此需要用于治疗神经病变的经改良的组合物及方法。

发明内容

在至少一个方面，本公开提供了一种经生理性缓冲的人类脐带(hUC)萃取物组合物，其包括经ECM降解蛋白酶处理的hUC的微粒化颗粒。hUC组织可包括hUC膜、hUC基质或hUC膜及hUC基质的组合、由其组成或基本上由其组成。该组合物还可包含一种或多种凝胶形成剂、交联剂、生物分子、酶和/或缓冲剂。例如，该组合物可包含原位聚合凝胶形成剂。原位聚合凝胶形成剂能够以约0.1至8mg/ml存在。

组合物可进一步包含交联剂，如京尼平(genipin)或转谷氨酰胺酶，以及其他合适的交联剂/交联剂。凝胶形成剂，例如聚合凝胶形成剂，例如热聚合凝胶形成剂，可为或可包括纤维蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V、胶原蛋白VIII、胶原蛋白X、胶原蛋白XI、胶原蛋白XXIV、胶原蛋白XXVII中的一种或多种。一些示例中，经ECM降解蛋白酶处理的hUC组织包括hUC膜且热聚合凝胶形成剂不是纤维蛋白。该组合物可为缓冲于约pH 7.2至7.4的基于生理盐水的悬浮液。

该组合物可以进一步包括一种或多种生物分子，例如透明质酸、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、壳聚糖、PEG、胶原蛋白VI、胶原蛋白VII、胶原蛋白IX、胶原蛋白XII、胶原蛋白XIII、胶原蛋白XIV、胶原蛋白XV、胶原蛋白XVI、胶原蛋白XVII、胶原蛋白XVIII、胶原蛋白XIX、胶原蛋白XX、胶原蛋白XXI、胶原蛋白XXII、胶原蛋白XXIII、胶原蛋白XXVI和/或胶原蛋白XXVIII。至少一个示例中，该组合物不包含硫酸软骨素。该组合物可包括微粒化颗粒。例如，大多数微粒化颗粒的直径可为约140nm与约160nm之间。

还提供了一种制造此类组合物的方法。例如，该方法可以制造人类脐带(hUC)萃取物，该方法包括：(a)提供hUC膜和/或hUC基质；(b)机械性撞击该hUC膜和/或该hUC基质以产生微粒化颗粒；及(c)以ECM降解蛋白酶处理：(i)机械性撞击之前的步骤(a)的组合物；(ii)机械性撞击过程中的步骤(b)的组合物；和(iii)由步骤(b)产生的该微粒化颗粒中的一种或多种。

本文的方法可进一步包括使蛋白酶失活。在ECM降解蛋白酶失活后，可添加原位凝胶形成剂，例如聚合凝胶形成剂。该方法可以进一步包括聚合凝胶形成剂。聚合可发生于存在交联剂如京尼平或转谷氨酰胺酶的情况下。

凝胶形成剂可为或可包括纤维蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V、胶原蛋白VIII、胶原蛋白X、胶原蛋白XI、胶原蛋白XXIV、胶原蛋白XXVII中的一种或多种。原位凝胶形成剂，例如聚合凝胶形成剂，能够以约0.1mg/ml至8mg/ml存在。在步骤(a)中可提供约0.5至1.0cm

机械性撞击进行1至约5个循环之间。此外，举例来说，机械性撞击能够以每个循环约60秒的持续时间，以范围从例如约3400RPM至约3700RPM的速度进行。本文的方法可进一步包括在ECM降解蛋白酶处理之前以如约5000xg的速度离心微粒化颗粒。

蛋白酶，例如ECM降解蛋白酶，可为胶原蛋白酶或基质金属蛋白酶(MMP)，如胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶III、MMP-2、MMP-3或MMP-7。例如在该ECM降解蛋白酶失活后，可对该组合物添加透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、PEG、胶原蛋白VI、胶原蛋白VII、胶原蛋白IX、胶原蛋白XII、胶原蛋白XIII、胶原蛋白XIV、胶原蛋白XV、胶原蛋白XVI、胶原蛋白XVII、胶原蛋白XVIII、胶原蛋白XIX、胶原蛋白XX、胶原蛋白XXI、胶原蛋白XXII、胶原蛋白XXIII、胶原蛋白XXVI或胶原蛋白XXVIII中的一种或多种。机械性撞击可提供直径约140nm至约160nm之间，例如平均直径范围为约140nm至约150nm的粒度分布的大多数微粒化颗粒。

本公开还包括治疗周边神经病变的方法，包括在周围神经病变部位或附近对受试者施用(例如注射)本文所述的组合物。例如，治疗周边神经病变的方法可包括将通过本文限定的方法制备的组合物注射到受试者的周边神经病变部位处或附近。受试者可为人类、灵长类动物、非人类哺乳动物或另一种脊椎动物或动物。该方法可进一步包括以第二疗法如镇痛疗法、NSAID疗法和/或抗惊厥药物治疗该受试者。本文的方法还可包括至少第二次、第三次、第四次或第五次或在持续或永久、慢性的基础上，对该受试者施用、例如注射该组合物。

如本文所使用的说明书，“一”及“一个”表示一个或多个。如本文所用，当与词语“包括”结合使用时，词语“一”及“一个”表示一个或多于一个。

术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指替代方案与“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”是指至少第二个或两个或更多个。

贯穿本申请中，术语“约”用于指示包括装置的固有误差变化、用于确定该值的方法或研究受试者之间所存在的变化的值。除非另有说明，否则术语“约”应理解为涵盖特定量或值的±5％。

本公开的其他目的、特征及优点于以下详细描述中将更为显而易见。然而，应该理解的是，详细描述及具体示例虽然指示了本发明的具体实施方式，但仅以说明的方式提供，因为从该详细描述，在本发明的精神及范围内的各种变化与修改对于该技术领域中具有通常知识者而言将是显而易见的。请注意，仅因特定化合物属于一个特定的通式并非意指其也不能属于另一个通式。

附图说明

以下图式形成本申请的一部分并且被包含以进一步展示本公开的某些方面。通过参考这些图式中的一个或多个并结合在此呈现的示例性实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开。

专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。专利局将根据请求及支付必要的费用提供本专利或专利申请出版物的彩色附图副本。

图1A至1B示出如示例1中所讨论的hUC膜萃取物的制备。(图1A)装有700μL 1X PBS的约0.7cm

图2示出如示例2中所讨论的以26G针头从注射器排出的hUC膜萃取物。

图3示出如示例2中所讨论的胶原蛋白凝胶及hUC膜萃取物聚合，包括在圆形模具中在37℃下保温培养30分钟。

图4示出如示例2中所讨论的胶原蛋白凝胶及hUC膜萃取物聚合。预聚合凝胶萃取物混合物以26G针头从注射器排出，随后在37℃下保温培养60分钟。

图5至6示出如示例3中所讨论的聚合曲线。装载hUC萃取物的凝胶在不添加凝胶交联剂的情况下在37℃下在10分钟内聚合，且在添加交联剂的情况下在8分钟内聚合，表示迅速反应的原位凝胶聚合。

图7示出如示例2中所讨论的凝胶降解曲线。在不添加交联剂的生理条件下，聚合凝胶保持50％以上的质量持续1天的时间，而在添加凝胶交联剂的情况下可以持续长达36天。

图8A至8B示出如示例3中所讨论的粒度分布。(图8A)含有单分散颗粒悬浮液的hUC萃取物，其中颗粒的主要部分的直径为160与180nm之间。(图8B)根据制备条件而含有可变的颗粒分散度及粒度分布曲线的萃取物。

图9示出如示例4中所讨论的免疫调节测定的结果。观察到hUC萃取物通过改变其免疫生物标志物：IL-1b、IL-10及MMP-9的分泌反应，在炎症攻击期间调节人类周边血液单核细胞(human peripheral blood mononuclear cells)的体外免疫反应。

图10A至10B示出如示例4中所讨论的人类U937细胞株衍生的巨噬类细胞(macrophage-like cells)中的免疫反应调节。hUC萃取物通过改变其免疫生物标志物：IL-1β及IL-10的分泌反应，在炎症攻击期间体外调节人类U937细胞株衍生的巨噬类细胞的免疫反应。

图11示出如示例5中所讨论的胶原蛋白聚合物形成的胶原蛋白酶破坏。破坏的胶原蛋白聚合物片段的浓度通过以胶原蛋白酶进行处理而降低。

图12示出用于制备hUC凝胶组合物的示例性示意图。hUC组合物可通过机械加工hUC组织以获得萃取物、纯化萃取物(例如去除细胞碎片)、以蛋白酶处理经纯化的萃取物以减少炎症成分、以及将经处理/纯化的hUC萃取物配制为适合注射的水凝胶。

图13示出如示例6中所讨论的核心蛋白聚糖的表现降低。与未处理的对照组相比，经MMP-7处理的hUC组合物显示出核心蛋白聚糖(decorin，DCN)的表现降低。

图14A示出人类U937细胞株衍生的巨噬类细胞中的免疫反应调节，如示例7中所述。图14B报告经处理及未经处理的hUC萃取物的总蛋白质含量，如示例7中所述。

图15示出用于进行免疫调节测定的示例性示意图，如示例7中所述。

图16A至16B示出经蛋白酶处理的hUC萃取物的免疫调节测定的结果，如示例7中所述。

图17示出经蛋白酶处理的hUC萃取物中的核心蛋白聚糖的表现降低，如示例7中所述。

图18A至18B示出经蛋白酶处理的hUC萃取物的另一免疫调节测定的结果，如示例7中所述。

具体实施方式

如上所述，羊膜/分娩材料的使用是在组织再生治疗包括神经病变领域中有前景的途径。本公开提供了用于产生经改良的生物材料的方法及其使用方法。一般而言，本公开是关于通过人类脐带(hUC)膜及hUC基质切片的机械性撞击(例如，珠击(bead-beating)均质化)产生的hUC材料衍生的基于生理盐水的悬浮液。这种制造技术旨在将大量与炎症调节及健康组织恢复相关的可溶性生物活性成分释出至基于生理盐水的悬浮液中，同时减少同一悬浮液中的hUC膜及基质的炎症成分如DNA、细胞溶质损伤相关分子模式(damageassociated molecular patterns，DAMPs)及ECM蛋白片段的可溶性含量。通过与ECM降解蛋白酶(例如，胶原蛋白酶或基质金属蛋白酶(MMP)如MMP-7)一起保温培养，可以进一步处理该悬浮液以减少炎症蛋白片段。也可对该悬浮液补充一定浓度的胶原蛋白凝胶，以增强治疗剂向局部组织的持续递送。这种hUC膜及基质衍生的基于生理盐水的悬浮液可通过如注射而递送至组织损伤(例如神经病变)部位。以下详细描述本公开的这些和其他特征。

I.神经病变

神经病变通常是指神经损伤。周边神经病变描述了对中枢神经系统以外的神经的损伤，即对大脑及脊髓以外的神经的损伤。例如，周边神经病变包括对连接大脑及脊髓与身体其他部位的感觉及运动神经的损伤。周边神经损伤会损害感觉、运动及功能，取决于损伤程度及受影响的周边神经。周边神经病变包括可逆性或永久性损伤，其影响可能是突然发作的急性、快速进展或随着时间的推移不易察觉地开始并进展的慢性症状。周边神经病变的原因可为遗传或自发性(未知原因)，并且可伴随其他医疗状况或处方医疗。

II.脐带材料及其萃取方法

本文的组合物衍生自脐带组织，包括膜和/或基质。与衍生自其他类型组织的材料相比，脐带萃取物在治疗神经病变方面可能具有益处。不受理论束缚，据信本文的衍生自脐带组织的组合物可导致免疫反应降低，例如因为脐带组织缺乏人类白血球抗原(humanleukocyte antigen，HLA)。此外，脐带组织包括可有助于促进神经修复的更高等级的生物活性生长因子、干细胞、游离蛋白及葡萄糖胺。

本文所述的组合物可由本文所述的人类脐带材料制备。这些材料可由任何合适的来源获得。例如，至少一种成分可从人体组织获得。这些成分也可从市售来源获得。成分可为纯化的、基本纯化的、部分纯化的或未纯化的。

人类脐带组织可例如从市售来源或从医院或外科/产科中心获得。组织通常以新鲜或冷冻状态获得。可清洗组织以去除多余的储存缓冲剂、血液或污染物。例如，可使用简短的离心步骤或通过其他方式去除多余的液体。可使用例如液态氮或其他冷却手段将组织冷冻，以促进后续的均质化。脐带组织的来源可为人类脐带(hUC)。整个hUC材料可例如通过使用外科切割工具、手动切割机或自动切割机进行清创，以去除与膜和/或基质无关的材料。

还可通过使用机械性撞击如「珠击」技术来处理hUC以制造萃取物。此处理可去除细胞碎片。珠击是一种实验室规模的机械方法，使用例如玻璃、陶瓷或钢珠，与悬浮在水性介质中的样品混合以处理生物样品。通过例如搅拌或摇动对样品及珠粒的混合物进行搅拌。珠粒与组织材料碰撞，机械地破坏组织以释出治疗性生物活性分子。与其他机械处理方法相比，其优点在于能够产生具有独特分布的生物活性分子及小颗粒的微粒化萃取物、一次处理许多样品而没有交叉污染的问题，以及在过程中不会释出潜在有害的气溶胶。

在该方法的一个示例中，将一定量的珠粒，例如与组织的量相比等体积的珠粒，添加至容器内的组织悬浮液中，并在实验室旋涡混合器中剧烈地混合样品。虽然处理时间可能相对较慢，比专业摇动机长3至10倍，但其可有效地处理组织并且价格便宜。可以想到具有更大体积及更快处理时间的放大程序。

成功的珠击不仅取决于摇动机的设计特征(考虑每分钟的摇动振荡、摇动摆度(shaking throw)或距离、摇动方向及小瓶方向)，而且还取决于选择正确的珠粒尺寸、珠粒的成分(玻璃、陶瓷、钢)及小瓶中的珠粒负载。

高能珠击机通常由于均质化期间的珠粒的摩擦碰撞而使样品升温。在珠击期间或之后可能需要冷却样品，以防止对热敏感蛋白质如酶的损害。样品升温可通过短时间间隔的珠击和/或在每个间隔之间于冰/干冰上进行冷却、通过在预冷的铝制小瓶架中处理样品、通过在珠击期间使气态冷却剂经该摇动机循环来控制。本文的一些示例中，处理腔室中的样品以干冰进行冷却，例如使用来自MP Biomedicals的装置。

适用于较大样品体积的不同珠击器的配置使用15-、50-或200-ml腔室内的旋转碳氟化合物转子来搅拌珠粒。此配置中，腔室可被静态冷却夹套包围。使用相同的转子/腔室配置，大型商用机器能够处理数公升的细胞悬浮液。目前，这些机器仅限于处理单细胞生物，例如酵母、藻类及细菌。

这种最初处理可以制造hUC组织的微粒化颗粒。例如，hUC萃取物可包括具有单峰或双峰粒度分布的颗粒，其取决于加工条件。本文的一些示例中，组合物(如下文进一步讨论，在用蛋白酶处理之前和/或之后)的平均直径可为约50nm至约500nm，例如约70nm至约250nm、80nm至约180nm、约120nm至约350nm、约150nm至约300nm、约165nm至约200nm、约140nm至约160nm、约200nm至约275nm、约175nm至约325nm、或约250nm至约450nm。一些示例中，可去除高于给定阈值的颗粒(例如去除均质化期间释出的大蛋白聚糖和/或大组织碎片等)，产生所需的单峰或双峰粒度分布。粒度例如可通过奈米粒子跟踪分析(nanoparticletracking analysis，NTA)或多角度动力学光散射(Multi Angle Dynamics LightScattering，MADLS)测量。

组织可以任选地在撞击过程之前被冷冻。冷冻步骤可通过任何合适的冷却过程进行。例如，可使用液态氮对组织进行急速冷冻。或者，可将材料置于异丙醇/干冰浴中，或可在其他冷却剂中急速冷冻。可使用市售可得的快速冷冻过程。此外，可将材料放入冰箱中，以使其更缓慢地平衡至储存温度，而非急速冷冻。组织可储存于任何所需的温度。例如，-20℃或-80℃或其他可用于储存的温度。在冷冻时而非冷冻前破坏组织为制备组织的一种可选的方法。

hUC制备物可为液体、悬浮液或干燥(包括但不限于冷冻干燥)形式。可添加抗微生物剂，如抗生素或抗真菌剂。该材料可在使用前例如在室温下或例如在-20℃或-80℃下被包装及储存。

在一些实施方式中，用于制备组合物例如凝胶组合物的hUC材料在本文中作为干燥制剂(dry formulation)存在。干燥制剂能够以较小的体积储存，并且可不需要相同的低温储存需求来防止制剂随着时间经过而降解。干燥制剂可储存及在使用前重构(reconstitute)。例如，干燥制剂可通过制备如本文所述的经冷冻切碎的hUC，然后去除组合物中的至少一部分水来制备。可通过任何合适的方式从制剂中去除水。去除水的示例性方法是使用市售可得的冻干机或冷冻干燥机进行冷冻干燥。例如可经由Virtis,Gardiner,N.Y.；FTS Systems,Stone Ridge,N.Y；以及SpeedVac(Savant Instruments Inc.,Farmingdale,N.Y.)找到合适的设备。某些实施方式中，干燥制剂的水含量按制剂的重量计算将小于约20％、低至约10％、低至约5％或低至约1％。一些实施方式中，基本上所有的水都被去除。接着可储存经冷冻干燥的组合物。储存温度可从低于约-196℃、-80℃、-50℃或-20℃至高于约23℃不等。如果需要，可在储存前描述组合物的特征(重量、蛋白质含量等)。

冷冻干燥组合物可于使用前在合适的溶液或缓冲剂中重构。示例性溶液包括但不限于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)及平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)。溶液的pH值可依需求进行调整。hUC的浓度可依需求变化。在本文的一些示例中，更为浓缩的hUC溶液是有用的，而在其他示例中，具有低浓度hUC的溶液是有用的。可将其他化合物添加至溶液中。可添加至经重构的制剂的示例性化合物包括但不限于pH调节剂、缓冲剂、胶原蛋白、透明质酸(HA)、抗生素、表面活性剂、稳定剂、蛋白质等(在下文进一步描述)。

III.脐带萃取物组合物

根据本公开，提供如上所述的hUC组合物。这些组合物能够以本文所述的其他材料进一步进行处理或补充，包括但不限于凝胶形成剂、交联剂、生物分子、酶和/或缓冲剂的一种或多种。本文的组合物可配制成例如溶液或凝胶形式，以施用于受试者。

A.凝胶形成剂

本文的组合物可包括一种或多种凝胶形成剂。合适的凝胶形成剂可在人体中的温度(约37℃(98至99°F))下进行热聚合。示例性凝胶形成剂包括但不限于胶原蛋I、II、III、IV、V、VIII、X、XI、XXIV及XXVII；聚乙二醇(PEG)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lacticco-glycolic acid)，PLGA)；聚(乙二醇)二丙烯酸酯(poly(ethylene glycol)diacrylate，PEGDA)；甲基丙烯酸化明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)；及甲基丙烯酸化透明质酸(methacrylated hyaluronic acid，MeHA)；以及纤维蛋白。纤维蛋白，也称为因子Ia，是一种参与血液凝固的纤维状非球状蛋白质。

凝胶形成剂的量通常可为0.1g/mL至8mg/mL，如0.5g/mL至约5mg/mL、1mg/mL至4mg/mL，或约3.5mg/mL至约4.5mg/mL。

胶原蛋白

在至少一个方面，包括hUC萃取物的组合物可包括一种或多种胶原蛋白类型。包括I、II、III、IV、V、VIII、X、XI、XXIV或XXVII型的原纤维形成(Fibril-forming)或网状形成(network-forming)胶原蛋白可用作原位聚合凝胶形成剂(于下文讨论)。其他胶原蛋白也可以包含在组合物中。

另一方面，包括hUC萃取物的组合物可包含一种或多种胶原蛋白类型，其中没有一种是原纤维形成或网状形成胶原蛋白。

胶原蛋白是体内各种结缔组织的细胞外基质中的主要结构蛋白。作为结缔组织的主要成分，其为哺乳动物中含量最多的蛋白质，占全身蛋白质含量的25％至35％。胶原蛋白是由结合在一起的胺基酸组成，形成被称为胶原蛋白螺旋的细长原纤维的三螺旋。其主要发现于肌腱、韧带及皮肤等纤维组织中。

hUC萃取物的组合物中可包含以下任何一种或多种：

纤维状(I、II、III、V、XI、XXIV、XXVII型)

非纤维状

FACIT(Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple Helices，具有中断三螺旋的纤维相关胶原蛋白)(IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI、XXII型)

网状形成胶原蛋白(VIII、IV、X型)

Multiplexin(Multiple Triple Helix domains with Interruptions，具有中断的多个三螺旋结构域)(XV、XVIII型)

MACIT(Membrane Associated Collagens with Interrupted Triple Helices，具有中断三螺旋的膜相关胶原蛋白)(XIII、XVII型)

跨膜相关胶原蛋白(XXIII)

其他(VI、VII、XXVI、XXVIII型)

五种最常见的类型为I型(皮肤、肌腱、脉管系统、器官、骨(骨的有机部分的主要成分)、II型(软骨；软骨的主要胶原成分)、III型(网状；网状纤维的主要成分；常见于I型旁)、IV型(形成基底层、基底膜的上皮分泌层)及V型(细胞表面、毛发及胎盘)。

在伤口愈合的四个阶段中，胶原蛋白被理解为在伤口愈合中执行以下某些功能或所有功能：

引导功能：胶原蛋白纤维用于引导纤维母细胞。纤维母细胞沿结缔组织基质迁移。

趋化特性：胶原蛋白纤维上可得的大表面积区域可吸引纤维母细胞，其有助于愈合。

成核作用：在某些中性盐分子存在的情况下，胶原蛋白可作为成核剂，导致纤维状结构的形成。胶原蛋白伤口敷料可作为定向新的胶原蛋白沉积及微血管生长的引导。

止血特性：血小板与胶原蛋白相互作用以形成止血栓。

B.交联剂

本文中的组合物另外或替代地可包括交联剂，在本文中也称为交联剂。交联剂通常提供将一个聚合物链链接至另一聚合物链的键。这些链接可以采用共价键或离子键的形式，且聚合物可为合成聚合物或天然聚合物(如蛋白质)。聚合物化学中，“交联”通常是指使用交联以促进聚合物的物理特性的变化。当在生物学中使用“交联”时，通常是指使用试剂将蛋白质链接在一起，以检查蛋白质-蛋白质相互作用或增强整体生物材料。

可用于本公开的示例性交联剂包括但不限于京尼平、转谷氨酰胺酶、亚胺基酸酯交联剂辛二亚胺酸二甲酯(imidoester crosslinker dimethyl suberimidate)、N-羟基琥珀酰亚胺酯交联剂BS3(N-hydroxysuccinimide-ester crosslinker BS3)及甲醛。此外，例如，本文的组合物可包括一种或多种可光交联的成分，例如其中可使用UV光来引发交联。

交联剂辛二亚胺酸二甲酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯交联剂BS3及甲醛通常通过诱导离胺酸的胺基的亲核攻击及随后经由交联剂的共价键结而形成键。零长度碳二亚胺(carbodiimide)交联剂EDC通过将羧基转化为与离胺酸残基或其他可用的一级胺结合的胺反应性异脲(isourea)中间体而发挥作用。SMCC或其水溶性类似物Sulfo-SMCC，可用在制备用于抗体开发的抗体-半抗原(antibody-hapten)共轭物。

京尼平是一种在栀子果实萃取物中发现的化合物。它是一种源自栀子花(Gardenia jasminoides)果实中被称为栀子苷(geniposide)的环烯醚萜苷(iridoidglycoside)的糖苷配基。京尼平是蛋白质、胶原蛋白、明胶及壳聚糖交联的天然交联剂。其具有在小鼠中为LD50 i.v.382mg/kg的低急性毒性(acute toxicity)，因此毒性远低于戊二醛与许多其他常用的合成交联剂。此外，京尼平可用作药物递送的调节剂及作为生物碱合成的中间物。体外实验显示京尼平阻断酶解耦蛋白2的作用。

另一类交联剂/交联剂转谷氨酰胺酶，其为本质上主要催化麸酰胺酸残基侧链的γ-酰胺基(γ-carboxamide groups)(-(C＝O)NH

转谷氨酰胺酶形成广泛交联的、通常不可溶的蛋白质聚合物。这些生物聚合物对于生物体创造屏障及稳定结构而言不可或缺。示例如血栓(凝血因子XIII)，以及皮肤及头发。催化反应通常被认为是不可逆的，且必须经由控制机制进行密切监控。

交联剂/交联剂的量的范围可为约0.1mM至约5mM，如约0.5mM至约3mM、约3mM至约4mM、约1.5mM至约2.5mM、或约1mM至约2mM。

C.其他生物分子

除了已经讨论的试剂之外，hUC组合物还可包括一种或多种成分，例如透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖和/或聚乙二醇(PEG)。

透明质酸，也称为玻尿酸，是一种阴离子性、非硫酸化的糖胺聚多糖，广泛分布于结缔组织、上皮组织及神经组织。其于糖胺聚多糖中是独特的，因为其为非硫酸化的，形成于质膜而非高基氏体中，且可为非常大，如人类滑膜HA(human synovial HA)平均每个分子约7百万Da，或约两万个双糖单体，而其他所提到的来源为3至4百万Da。透明质酸作为细胞外基质的主要成分之一，对细胞增殖及迁移有显著贡献，还可能参与某些恶性肿瘤的进展。

硫酸软骨素是硫酸化的糖胺聚多糖(GAG)，其包括交替的糖(N-乙酰半乳糖胺及醛糖酸(glucuronic acid))。通常发现其作为蛋白聚糖的一部分附着于蛋白质。软骨素链可具有超过100种单独的糖，每一种都能够以不同的位置及数量被硫酸化。

本文的一些实施方式中，组合物包含减量的与天然hUC组织相关的一种或多种类型的蛋白聚糖(例如，双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖(versican)等)和/或硫酸化GAGs。一些示例中，组合物不包括与天然hUC组织相关的一种或多种类型的蛋白聚糖和/或硫酸化GAGs。例如，与天然hUC组织相比，本文的组合物可具有减量的双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖。一些示例中，本文的组合物不含(例如具有低于检测的等级)存在于天然hUC组织中的一种或多种蛋白聚糖，如双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖。

壳聚糖是由从甲壳素获得的随机分布的β-(1→4)-链接的D-葡萄糖胺(去乙酰基单元)及N-乙酰基-D-葡萄糖胺(乙酰基化单元)组成的线性多糖。其通过用碱性物质(如氢氧化钠)处理虾及其他甲壳类动物的甲壳素外壳而制成。

聚乙二醇(PEG)是一种聚醚化合物，也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)，取决于其分子量。PEG的结构通常表示为H-(O-CH

D.酶处理

在hUC组织的一个或多个处理步骤(例如利用珠击的机械撞击)之后，所得的hUC萃取物可包括被破坏的蛋白质片段，如蛋白质单体及ECM片段。此类成分在施用于患者时可能引起或导致不良反应。例如，当在神经损伤部位注射时，hUC萃取物的某些成分可能会引发炎症反应和/或免疫反应或与之相关。本文的组合物可通过以蛋白酶进行处理而选择性地去除、减少或灭活某些成分，同时保留可用于促进神经修复的生物活性成分来制备。可至少部分地、基本上地或完全地去除的成分可包括例如天然蛋白聚糖，如核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖。

不受理论束缚，据信蛋白酶处理可导致经由TLR4途径而与炎症相关的ECM中所存在的蛋白聚糖如核心蛋白聚糖的降解或表现降低。例如，据信核心蛋白聚糖会影响炎症信号事件(inflammatory signaling events)，被炎症细胞辨识为DAMP。当施用本文的组合物时，去除或减少蛋白聚糖(如核心蛋白聚糖)的量可降低受试者发生炎症反应的风险。本公开的实施方式可有效地引导免疫系统以促进愈合，同时减少或防止免疫反应的潜在的破坏性方面。

例如，本文中hUC组合物的制备可包含以一种或多种ECM降解蛋白酶进行处理。蛋白酶可为胶原蛋白酶，例如胶原蛋白酶I、II、III、IV、V、VI或VII，或其他合适的蛋白酶，包含但不限于MMPs，例如MMP-2、MMP-3或MMP-7。酶处理可在引入凝胶形成剂(如上所述)之前和/或可在进一步引入一种或多种其他成分包含如上所述的胶原蛋白类型和/或其他凝胶形成剂之前进行。

胶原蛋白酶是破坏胶原蛋白中的肽键的酶。它们有助于破坏梭菌属(Clostridium)等细菌的发病机制中的细胞外结构。它们被认为是一种毒力因子(virulence factor)，促进了气坏疽(gas gangrene)的传播。它们通常以肌肉细胞及其他身体器官中的结缔组织为目标。一旦胶原蛋白酶从细胞分泌，胶原蛋白，动物细胞外基质的一关键成分，就会经由胶原蛋白酶对原胶原蛋白的切割而制造。这阻止了在细胞本身内部形成大型结构。除了由某些细菌制造外，胶原蛋白酶还可作为其正常免疫反应的一部分而由身体制造。这种制造是由细胞因子诱导的，细胞因子会刺激纤维母细胞及成骨细胞等细胞，并可导致间接的组织损伤。

蛋白酶的浓度范围可为约0.1μg/mL至约25μg/mL，例如约0.5μg/mL至约20μg/mL，约1μg/mL至约15μg/mL，约0.5μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2.5μg/mL至约5μg/mL、约3μg/mL至约8μg/mL、约5μg/mL至约15μg/mL、约10μg/mL至约18μg/mL、约15μg/mL至约22μg/mL。此外，例如，hUC萃取物能够以蛋白酶处理的时间段的范围为约5分钟至约18小时，如约1小时至约16小时、约4小时至约12小时、约8小时约16小时、约12小时至约16小时、约2小时至约8小时、约30分钟至约5小时、或约5分钟至约2小时。在一非限制性示例中，hUC萃取物能够以约0.5μg/mL至约5μg/mL的蛋白酶处理约1小时至约16小时的时间段。

根据本文的一些示例，制备组合物的方法包含至少部分地使蛋白酶失活。例如，可添加试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、伊洛马他(ilomastat)(例如GM-6001或

E.缓冲剂

本文中的组合物，例如经修饰的萃取物可有利地与缓冲溶液组合以维持目标pH。通常，缓冲溶液(例如pH缓冲剂或氢离子缓冲剂)为弱酸及其共轭碱的混合物的水溶液，反之亦然。加入少量强酸或强碱后，其pH变化很小。缓冲溶液用于在各种化学应用中将pH保持在几乎恒定的值。

包含缓冲试剂的溶液不管溶液中可能存在何物，其pH通常于有限范围内变化。在生物系统中，这允许酶发挥其预期功能。若溶液的pH值上升或下降过多，酶的有效性会在称为变性的过程中降低，这可能是不可逆的。大多数用于研究的生物样品都保存于缓冲溶液，通常为磷酸盐缓冲液(PBS)，pH约为7.4。

与生理pH相关的一些示例性缓冲剂包括柠檬酸及KH2PO4。通过组合pKa值仅相差2或更少的物质并调节pH，可以获得广范围的缓冲剂。柠檬酸为缓冲剂混合物的有用成分，因其具有三个pKa值，该三个pKa值被未满2的值隔开。缓冲范围可通过添加其他缓冲剂来扩展。由Na

图12示出根据以上讨论及以下示例制备hUC凝胶组合物的示例性示意图。如图所示，组合物可通过hUC组织的机械加工(例如珠击或其他合适的技术)以获得萃取物、纯化萃取物(其可包括例如去除细胞碎片)、用蛋白酶进行处理以减少炎症成分，及将经处理/纯化的hUC萃取物配制成适于注射的水凝胶。

IV.处理方法

根据本公开，还提供了用于治疗受试者的组织损伤(包含但不限于肌肉、肌腱、韧带等)，特别是治疗神经病变的方法。与镇痛治疗或目前可用的羊膜/分娩组织衍生(birth-tissue-derived)的可流动产品(例如Mimedx的OrthoFlo)相比，这些方法旨在为疼痛如周边神经病变的部位提供更好的治疗，并使局部组织恢复正常功能的健康状态。这旨在减轻可能会以及可能不会接受手术干预的患者的症状。作为一种可注射疗法，这些方法被设计成微创的。该治疗作为一种可注射疗法，其微创及多样性质旨在为体内疼痛性神经病变的一系列解剖学区域提供治疗的可及性。

因此，在至少一个方面，该方法是关于将hUC衍生材料注射至损伤部位。医疗专业人员能够根据症状及诊断评估适当的部位，其可包括脚、手及关节如肩膀、肘部、手腕及膝盖。类似地，医生可确定适当的手术程序来递送药剂，例如结合注射与影像引导递送或受影响区域的手术切除。

如上所述，本文的组合物可配制成凝胶，例如水凝胶，用于在损伤部位处或其附近或是在需要治疗的部位处注射。将组合物配制成凝胶可提供更长的治疗持续时间，例如凝胶因诸如其黏度、内聚力等因素而可在预期的标靶部位处停留更久。因此，可通过使用凝胶组合物来实现缓释。可配制凝胶以提供所需的特性，例如降解速率、密度、刚性和/或货物负载量。

该方法可包含在一段时间内的多次治疗，如在持续的或永久的、长期的基础上。例如，可以进行任何数量的处理，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多处理。这样的治疗可间隔数天、数周、数月甚至数年。

该方法还可包括将使用本文所述的hUC组合物的施用与一种或多种公认的神经病变疗法相结合的混合式治疗，例如改变饮食和/或施用NSAIDs、镇痛剂或抗惊厥药(于上文更详细地讨论并通过引用并入本文)。

V.示例

包括以下示例以说明本公开的示例性实施方式，然而，本质上并非限制性的。应当理解，本公开包括与前文描述及以下示例一致的附加实施方式。本领域技术人员应当理解，在随后的示例中公开的技术代表了发明人发现的在本公开的实践中能够很好地发挥作用的技术，因此可认为构成其实践的示例性模式。然而，本领域技术人员应了解，根据本公开内容，在不脱离本公开内容的精神及范围的情况下，可以对所公开的具体实施方式进行许多改变并且仍然获得类似或相似的结果。

示例1

hUC萃取物的制备

如下述由hUC萃取物制备组合物。将hUC膜组织样品装入试管中并加入700μL 1XPBS(图1A)。然后将样品在

示例2

hUC凝胶的制备

进行研究以评估利用hUC萃取物及凝胶形成剂的凝胶形成。将根据示例1制备的hUC萃取物装入注射器，通过26G针头(图2)挤出，并于37℃利用作为凝胶形成剂的胶原蛋白聚合成凝胶，例如适合用作微创注射疗法的制剂。图3描绘在圆形模具中在37℃下保温培养30分钟后的胶原蛋白凝胶与hUC膜萃取物的聚合。图4描绘胶原蛋白凝胶与hUC膜萃取物的聚合，其中预聚合凝胶萃取物混合物从带有26G针头的注射器中排出，随后在37℃下保温培养60分钟。

样品在以不同量的胶原蛋白(1mg/mL、2mg/mL及4mg/mL)作为凝胶形成剂，以及在使用与不使用京尼平(2mM)作为交联剂保温培养30分钟期间的情况下制备，以确定对聚合时间的影响。410nm处的吸光度被用作聚合度的指示。结果示于图5及6。观察到装有hUC萃取物的凝胶在37℃下于不添加凝胶交联剂的情况下在8分钟内聚合，于添加交联剂的情况下在10分钟内聚合，表示原位凝胶聚合反应迅速。于不存在交联剂的情况下，使用更高量的凝胶形成剂会观察到更快的聚合。使用4mg/mL胶原蛋白且未使用京尼平进行制备的样品表现出最快的聚合时间，其次是使用2mg/mL胶原蛋白且未使用京尼平进行制备的样品。使用4mg/mL与2mg/mL胶原蛋白且使用2mM京尼平制备的样品表现出相似的聚合时间。使用1mg/mL胶原蛋白及2mM京尼平制备的样品表现出最慢的聚合。

对于以hUC萃取物结合4mg/mL胶原蛋白作为凝胶形成剂及不同量的京尼平(0、0.5mM、1mM、2mM及5mM)作为交联剂制备的样品进行了进一步研究，以调查聚合凝胶随时间的降解(共64天)。将样品在1mL消化胶原蛋白酶溶液中在37℃下保温培养30分钟，历时6周。在聚合及去除过量液体后进行研究，然后每周称重以确定初始质量并评估抗降解能力。每次称重后使用新鲜的酶溶液。观察到聚合凝胶在生理条件下在不添加交联剂的情况下保留超过50％的质量达1天，在添加凝胶交联剂的情况下多达36天(图7)。

示例3

hUC萃取物的粒度的特征

分析根据示例1制备的hUC萃取物以确定粒度分布。Malvern Zetasizer Ultra分析仪用于通过多角度动力学光散射(Multi Angle Dynamics Light Scattering，MADLS)测量平均直径。图8A示出其中hUC膜组织(脐带膜(umbilical cord membrane，UCM))以4m/s在每个循环60秒的条件下均质化1个循环、2个循环及3个循环的样品的结果，显示均质时间较长则尺寸分布略宽。这些数据支持样品制备的一致性，例如来自经均质化的hUC膜组织的成分之一致混合物。样品包含单分散颗粒悬浮液，其中颗粒的主要部分直径范围在160与180nm之间(图8A)。改变速度(4m/s、5m/s或6m/s)及循环数(1、3或5个循环，每个循环60秒)进一步进行研究，以调查对粒径造成的影响。取决于制备条件，萃取物含有可变的颗粒分散度及尺寸分布曲线(图8B)。

示例4

hUC萃取物的免疫调节

对于hUC萃取物调节源自人类U937细胞株的人类周边血液单核细胞的免疫反应的能力，在两种炎症攻击期间通过改变其对以下免疫生物标志物的分泌反应来进行体外研究：IL-1β、IL-10及MMP-9(图9及10A至10B)。第一项研究(图9)中，以每个循环4000rpm均质化hUC膜组织3分钟，总共4至5个循环来制备hUC萃取物。第二项研究(图10A至10B)中，以每个循环6m/s均质化hUC膜组织60秒，总共3个循环来制备hUC萃取物。对于免疫调节试验，以20ng/mL佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate13-acetate，PMA)处理U937细胞培养物48小时以产生巨噬类细胞，然后给予M1分化刺激(50ng/mL LPS+10ng/mL IFN-γ)(“Stim”)或未刺激(“Unstim”)。用各自的hUC萃取物(“UC”)处理M1培养物来进行比较。结果显示，hUC萃取物通过改变其免疫生物标志物IL-1β及IL-10的分泌反应，在炎症攻击期间于体外调节人类U937细胞株衍生的巨噬类细胞的免疫反应。图9示出48小时时间点的结果。图10A至10B示出24、48、72及96小时时间点的结果。

示例5

hUC萃取物的蛋白酶(胶原蛋白酶)处理

以胶原蛋白酶处理(25μg/mL)来进行研究，以与对照组进行比较，结果示于图11。如图所示，与未处理的对照组相比，以胶原蛋白酶处理的被破坏的胶原蛋白聚合物片段的浓度降低。以胶原蛋白酶处理的样品及对照组样品以4m/s(1个60分钟的循环)及6m/s(3个60分钟的循环)的速度设定被均质化，且胶原蛋白酶组相对于对照组，胶原蛋白聚合物片段在两种速度设定下均减少。

示例6

hUC萃取物的蛋白酶(MMP-7)处理

制备经修饰/处理的hUC萃取物以研究MMP-7蛋白酶的处理。hUC组织通过6m/s，每个循环1分钟的均质化，总共3个循环来进行机械处理，然后以MMP-7(0.8μg/mL)处理16小时(“经处理的UC”)。这在图12的过程中示意性地示出。制备无MMP-7处理(“UC”)的另一对照组。如图13所示，与无处理的对照组相比，经MMP-7处理的萃取物展现核心蛋白聚糖(DCN)的表现降低。以ELISA套组(ThermoFisher Scientific)测量核心蛋白聚糖。

制备附加的hUC萃取物并在与图13相同的条件下以MMP-7进行处理；图14A所示的核心蛋白聚糖表现等级证实，经由蛋白酶处理减少了约45％的核心蛋白聚糖。核心蛋白聚糖相对量的差异可能与组织之间的差异有关，例如从不同的供体或同一组织来源获得。图14B示出针对经处理的样品与对照组样品测量的总蛋白质含量(μg/mL)，示出相似的等级。使用BCA(bicinchoninic acid，二辛可宁酸)蛋白质检测试剂套组(ThrmoFisherScientific)测量总蛋白质含量，并测试600种不同的蛋白质，其中辨识出448种蛋白质生物标志物。这表示MMP-7处理成功地去除了核心蛋白聚糖成分，而对其他蛋白质包括潜在的有益成分没有显著的损害。

示例7

经蛋白酶处理的hUC萃取物的免疫调节

根据示例6制备的图14A至14B的样品在免疫调节测定中被进一步调查以确定其对免疫生物标志物IL-1β与IL-10的影响。以20ng/mL佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)处理U937细胞培养物48小时以产生巨噬类细胞，然后给予M1分化刺激(50ng/mL LPS+10ng/mLIFN-γ)(“Stim”)或未刺激(“Unstim”)。M1培养物也用未处理的hUC萃取物(“UC”)及经MMP-7处理的hUC萃取物(“经处理的UC”)处理。该测定在图15中示意性地说明。图16A及16B的结果显示，蛋白酶处理导致IL-1β及IL-10的分泌反应降低。不受理论的束缚，据信经处理的hUC萃取物中较低量的核心蛋白聚糖导致炎症反应减少。

进行了另外的研究以调查来自经处理的hUC萃取物的残留蛋白酶对IL-1β及IL-10的影响。如示例6所述制备hUC萃取物并以MMP-7进行处理。如示例6所述测量未处理的hUC萃取物对照组(“UC”)及经MMP-7处理的hUC萃取物(“经处理的UC”)的核心蛋白聚糖等级。图17所示的结果证实经处理的hUC萃取物的核心蛋白聚糖减少。

对经处理及未处理的hUC萃取物样品进行如上所述的免疫调节测定。图18A及18B分别报告了对于无hUC萃取物的未刺激的培养物(“Unstim”)、无hUC萃取物的经刺激的培养物(“Stim”)、具有未处理的hUC萃取物的经刺激的培养物(“UC”)、具有经MMP-7处理的hUC萃取物的经刺激的培养物(“经处理的UC”)、以及具有MMP-7(0.8μg/mL)且无hUC萃取物的经刺激的培养物(“MMP-7”)的IL-1β与IL-10的等级。这些结果与图16A至16B的结果一致，显示hUC萃取物的蛋白酶处理导致IL-1β与IL-10的显著降低。与“Stim”对照组相比，单独的MMP-7未观察到影响IL-1β(图18A)，并且相对于对照组引起IL-10的轻微(无统计学意义)降低(图18B)。这表示炎症反应的减少并非因为残留的蛋白酶，支持经由蛋白酶处理去除核心蛋白聚糖会降低免疫反应的结论。

根据本公开及该技术领域中具有通常知识者的知识，可在没有过度实验的情况下制作及执行本文公开与要求保护的所有方法。尽管已经根据示例性实施方式描述了本公开的组合物及方法，但是对于该技术领域中具有通常知识者而言，显而易见的是在不脱离本公开的概念、精神及范围的情况下，可将变化应用于本文所述的方法以及该方法的步骤或步骤程序中。更具体而言，显而易见的是，某些化学及生理相关的试剂可替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于该技术领域中具有通常知识者而言，显而易见的是所有这些类似的替代及修改被认为落在所附申请专利范围所限定的本公开的精神、范围及概念内。