miRNA剂型的骨关节炎药物制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于骨关节炎治疗技术领域，具体提供了一种miRNA剂型的骨关节炎药物制剂及其制备方法。

背景技术

骨关节炎(OA)是一种以慢性炎症、进行性关节软骨破坏和软骨下骨硬化为主要特征的慢性关节疾病。目前，早期和中期OA的治疗策略是缓解关节疼痛和关节内注射，晚期OA的治疗策略是关节置换手术。早中期骨关节炎最常用的方法为药物治疗，通过口服给药，药物经过全身循环很难到达病变区域，不但对病情治疗效果欠佳，还可能产生不必要的副作用。关节内注射给药，药物能够直达病变区域，但现有的药物主要是发挥消炎和镇痛作用，对软骨修复作用微乎其微。

近年来，通过将微小核糖核酸(microRNA，miRNA)应用于疾病治疗己引起广泛的关注。miRNA是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个miRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标miRNAs而调节基因的表达，从而实现从基因水平上治疗疾病。比如，miRNA可以通过调节软骨细胞内与软骨基质合成相关基因的表达，进而使细胞外基质的合成增加并产生分解抑制，可以有效的加快软骨损伤的恢复。但miRNA在细胞外作用极其脆弱，且难以进入细胞内发挥生物学效应。因此，开发新型miRNA药物制剂用于骨关节炎治疗成为领域内的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有骨关节炎药物存在的问题，提供一种miRNA剂型的骨关节炎药物制剂及其制备方法，所述miRNA剂型的骨关节炎药物可以直接关节注射给药，在消炎和镇痛的同时，实现软骨修复。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种miRNA剂型的骨关节炎药物制剂，所述制剂由miRNA和脂质纳米颗粒(LNP)组成。

miRNA为miR-200c-3p，序列为UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA。

miRNA剂型的骨关节炎药物制剂中miRNA用量为100～2800μg/ml。

LNP是由二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(cholesterol)和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)或((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、胆固醇和二硬脂酰基基磷脂乙醇胺-聚乙二醇组成的混合物。

miRNA剂型的骨关节炎药物为直径介于20-600纳米的颗粒组合物。

药物制剂作用靶点为ZEB2基因。miRNA剂型的骨关节炎药物用于预防或改善骨关节炎。

miRNA剂型的骨关节炎药物的施用方式包括皮下、肌肉、静脉和关节腔内注射。

本发明的另一方面：

miRNA剂型的骨关节炎药物制剂是采用微流控设备制备得到的。制备方法包括以下步骤：

(1)将脂质体原料溶解于无水乙醇，形成溶液A；

(2)将miRNA溶于柠檬酸缓冲液，形成溶液B；

(3)使用微流体纳米药物生产装置将所述溶液A、溶液B混合后，使用PBS缓冲液透析，过滤膜除菌后即得miRNA剂型的骨关节炎药物。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1.miRNA类药物可以从基因水平上抑制炎症，使细胞外基质的合成增加并产生分解抑制，可以有效的加快软骨损伤的恢复。克服现有的药物主要是发挥消炎和镇痛作用，对软骨修复作用微乎其微的弊端。

2.通过脂质纳米粒包裹miRNA方法克服了miRNA在细胞外及其脆弱，且难以进入细胞内发挥生物学作用的弊端。

3.通过微流控技术生产miRNA剂型的骨关节炎药物，可以有效降低生产成本；且其制备的纳米粒理化性质(包括粒径、电势、包封率、稳定性)较为均一、生产和纯化过程易实现标准化操作，进一步节省了时间和经济成本。

4.miRNA剂型的骨关节炎药物可减少LPS刺激后小鼠ADTC5细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1蛋白的表达水平，增强细胞活力，同时拮抗细胞凋亡，降低MMP3、MMP13、ADAMTS-4的表达和提高Collagen II的表达。

附图说明：

图1为微流控通道水相和乙醇相流速比对制备miRNA剂型的骨关节炎药物粒径(Z-AVE)与分散性(PDI)影响图。

图2为微流控通道水相和乙醇总流速对制备miRNA剂型的骨关节炎药物粒径(Z-AVE)与分散性(PDI)影响图。

图3为不同miR-200c-3p浓度对于miRNA剂型的骨关节炎药物中miR-200c-3p包封率的影响。

图4药物制剂的电镜图。

图5miRNA剂型的骨关节炎药物在生理环境下，随时间变化，粒径与分散性变化图。

图6LPS对ATDC5细胞活性及miR-200c-3p表达水平的影响图。其中，A.采用CCK-8检测LPS处理后细胞活性，B.LPS处理后miR-200c-3p的表达水平。其中与Control比较，***p<0.001。

图7RT-PCR检测LPS处理ATDC5细胞，Lipo-miR-200c-3p转染miR-200c-3p后，miR-200c-3p的表达水平，***p<0.001。

图8Lipo-miR-200c-3p传递miR-200c-3p后抑制LPS诱导ATDC5细胞的活力损伤图。

图9Lipo-miR-200c-3p传递miR-200c-3p对于ATDC5细胞炎症因子表达的影响图。

图10Lipo-miR-200c-3p传递miR-200c-3p对于ATDC5细胞凋亡的影响图。A：Tunel染色观察细胞凋亡的变化，B：凋亡相关蛋白(bcl2,bax,cleaved-caspase3,caspase3)表达变化。*p<0.05，***p<0.001。

图11Lipo-miR-200c-3p传递miR-200c-3p对于ATDC5细胞基质及相关蛋白酶的影响。蛋白质印迹检测MMP3，MMP13，ADAMTS-4和Collagen II的表达水平，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图12在ATDC5细胞中转染miR-200c-3p后，检测ZEB2的表达水平，**p<0.01。

图13双荧光素酶报告基因实验结果提示miR-200c-3p和ZEB2结合，*p<0.05。

图14采用ELISA测定敲低ZEB2对细胞中促炎因子(TNF-α，IL-6，IL-1β和MCP-1)含量的影响图，**p<0.01。

图15采用western blot检测敲低ZEB2对MMP3，MMP13，ADAMTS-4和Collagen II的表达水平的影响，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图16ALC-miR-200c-3p传递miR-200c-3p对于ATDC5细胞炎症因子表达的影响图。

图17为本发明使用的涡流混合器的示意图。

具体实施方式

为进一步说明本发明，具体实施方式如下。

实施例1纳米微粒Lipo-miR-200c-3p的制备及检测

(1)采用微流控芯片技术自制涡流混合器制备脂质体，用于封装包裹miR-200c-3p。

本发明自制涡流混合器具有s型的混合芯片，左边Y两端是进口，右边是出口，有利于制备尺寸在纳米级别，粒径均一的颗粒。

(2)将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇和二硬脂酰基基磷脂乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)按摩尔比为(90：5：5)溶解在5ml甲醇溶液中作为A溶液(甲醇相)。将10微克生工加工合成的miR-200c-3p(固体粉末)分散在5ml柠檬酸缓冲溶液中作为B溶液(水相)。然后将A溶液和B溶液按照不同流速比同时注入自制混合器中，从而形成荷载有miR-200c-3p脂质体纳米粒溶液(Lipo-miR-200c-3p)。配方中的初始脂质(二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC))浓度为4mg/ml，水:有机流速比(FRR)为4:1，总流速(TFR)为25ml/min。

为了优化微流控芯片制备脂质体条件，对两通道的流速比、总流速进行了探究。如图1所示，随着流速比从1：1上升到5：1，所制备的脂质体粒径从143nm逐渐下降到95nm，综合考虑粒径和均一性(PDI)，后续试验选择流速比为3：1。在固定流速比为3：1的条件下，继续对总流速进行探究，从图2可知，随着总流速不断上升，所制备的脂质体粒径不断减小，PDI逐渐变大。综合考虑粒径和均一性，总流速固定在15ml/min：5ml/min。

(3)依次改变miR-200c-3p溶液浓度从250μg/mL到500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、4000μg/mL，按照步骤(2)中脂质体配比和最优流速比和总流速，研究miR-200c-3p浓度与包封率的关系(图3)，从图3中可以看出miR-200c-3p浓度越大，包封率越高，当miR-200c-3p浓度为250μg/mL时，包封率为40％，此时miRNA剂型的骨关节炎药物制剂中miRNA用量为100μg/mL。当miR-200c-3p浓度为4000μg/mL时，此时miRNA剂型的骨关节炎药物制剂中miRNA用量为2800g/mL。因此，通过调节miR-200c-3p溶液浓度，很容易制备出miRNA剂量在100-2800μg/mL的骨关节炎药物。

(3)所有新形成的脂质体(8ml)在1×PBS pH 7.4的磁性搅拌下通过透析缓冲液交换1小时，以确保所有脂质体都在1×PBS pH 7.4的溶液中。通过离心和透析去除任何非掺入的游离miR-200c-3p。

(4)透射电镜(TEM)：Lipo-miR-200c-3p纳米微粒形貌采用JEOL JEM-2010TEM在100KV加速电压下观察(图4)。通过TEM成像可知，Lipo-miR-200c-3p粒径约100nm，

(5)动态光散射(DLS)：Lipo-miR-200c-3p纳米微粒的粒径分布采用动态光散射(DLS)来测量，采用马尔文公司的Zetasizer Nano-ZS 90的粒径仪和电位仪测定纳米微粒的粒径、粒径分布指数(particle distribution index，PDI)及Zeta电位，。

(6)Lipo-miR-200c-3p纳米微粒粒径12周稳定性检测：将制备的Lipo-miR-200c-3p纳米微粒储存在4℃冰箱中，每隔一段时间，取一部分进行粒径检测以分析其稳定性(图5)。如图4所示，12周粒径维持在100～140nm之间，PDI维持在0.2至0.3之间，长时间保存后Lipo-miR-200c-3p的结构保持稳定。粒径分布均匀，能利于存放。

实施例2

脂质体纳米微粒Lipo-miR-200c-3p对ATDC5细胞炎症反应及凋亡等作用的研究

细胞炎症模型建立

将ATDC5细胞培养于含10％FBS DMEM培养基中。待细胞长至70％时使用350μg/mlLPS诱导细胞6h、12h和24h以构建骨关节炎软骨细胞模型(图5)。实验结果表明，使用350μg/ml LPS分别处理ATDC5细胞6h，12h，24h，随着时间的增加，细胞活力与miR-200c-3p的表达均逐渐降低，且与对照组Control相比，LPS处理12h和24h后细胞活力显著下降(图5)。因此选用350μg/ml LPS诱导ATDC5细胞24h这一条件来构建骨关节炎软骨细胞模型。

细胞转染

将ATDC5细胞接种于12孔板或者6孔板中，待细胞融合度为70％-80％时进行转染。

(1)取出培养板置于无菌操净台上，为细胞换取新鲜完全培养基。

(2)稀释Lipo-miR-200c-3p：利用一定的Opti-MEM转染培养基及适当体积Lipo-miR-200c-3p于EP管内，然后均分到培养板孔中，第二日换新鲜培养基继续培养用于后续实验。miR-200c-3p序列如下：

实验结果表明(图6)，LPS处理ATDC5细胞后，miR-200c-3p含量相比对照组显著降低。再经Lipo-miR-200c-3p转染miR-200c-3p后，miR-200c-3p的表达较LPS、LPS+miR-NC组都显著增加，表明Lipo-miR-200c-3p能高效将miR-200c-3p递送进细胞并转染成功。

CCK8检测

采用DMEM完全培养基培养ATDC5细胞。第二代的软骨细胞生长至90％，且细胞生长状态良好，将处于对数生长期的细胞用吸引器吸去完全培养基，加入PBS清洗培养皿，含EDTA的0.25％胰酶消化3min,加入含血清的完全培养基3ml终止消化，后将ATDC5细胞离心，吹打重悬细胞后计数，取5×103个细胞接种于96孔板中，每组设置3复孔，分别培养6h、12h和24h，弃旧培养基，PBS洗涤后每孔加入CCK8溶液10μl，继续37℃孵育2h。将孔板放置于预热的酶标仪中，450nm测定各孔的吸光度(OD)。

CCK8实验结果表明，经LPS诱导处理后，ATDC5细胞活力下降明显。然而，LPS处理并转染miR-200c-3p后，细胞活力较LPS处理后有所增加。LPS处理后，再加入Lipo-miR-200c-3p转染miR-200c-3p后，ATDC5细胞活力较LPS+miR-NC组有所增加，表明经Lipo-miR-200c-3p传递miR-200c-3p可以有效的抑制LPS诱导的细胞活力损伤(图7)

RT-PCR

将ATDC5细胞按照5万/孔密度接种于12孔板，在实验处理后提取mRNA。

mRNA的提取与定量步骤：

(1)取出实验处理后的12孔板，去除完全培养基，PBS清洗2遍，每孔中加入500μlTRIZOL裂解液，室温静置5min。

(2)将mRNA裂解液吸于1.5ml的EP管中，加入100μl三氯甲烷剧烈震荡15s，室温静置10min。

(3)1.3×104rpm离心15min，取上清于新的1.5ml EP管中，加入700μl异丙醇，充分混匀，室温静置10min。

(4)静置后以相同转速继续离心10min，去上清，随后加入500μl 75％乙醇，6000rpm离心5min，重复3次。

(5)去除离心管中剩余乙醇，晾干后，加入20-40μl去离子水溶解mRNA，5min后酶标仪定量mRNA的浓度。用TRIZOL液裂解提取RNA后调整浓度至1μg/μl后开始进行逆转录、荧光定量PCR。反应体系如下：

以上体系混匀，50℃5min，85℃5s。即为cDNA。

逆转录后按下表反应体系进行Q-PCR操作：

按如下程序进行PCR扩增：

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按照程序共进行40个循环。RT-PCR仪观察判断引物是否可行，以U6作为内参照。7000HT PCR仪(美国AB公司)检测mRNA水平,2-△△CT法分析数据。

PCR引物序列如下：

结果显示(图8)，LPS处理ATDC5细胞后，TNF-α，IL-6，IL-1β及MCP-1等促炎因子的表达明显增加。LPS处理并转染miR-200c-3p后，ATDC5细胞表达促炎因子含量较LPS组显著下降，表明过表达miR-200c-3p可在一定程度上缓解LPS诱导的细胞炎症反应。加入Lipo-miR-200c-3p并转染miR-200c-3p后，促炎因子含量较LPS+miR-200c-3p显著下降，表明经Lipo-miR-200c-3p传递miR-200c-3p可以更加有效的抑制LPS诱导的ATDC5细胞炎症反应

ELISA

ELISA法(标准双抗体夹心法)检测ATDC5细胞培养上清中(TNF)-α，IL-1β，IL-6和MCP-1的表达。在酶标仪上450nm和570nm(参比)读取OD值，根据标准曲线使用Gen5 DataAnalysis software计算浓度。

(1)样品采集与贮存

将ATDC5细胞按照10万每孔浓度接种于12孔板，采用LPS诱导骨关节炎软骨细胞模型后，24小时后转染miRNA，培养48小时后收集细胞培养上清液500μl，离心后去除沉淀，检测或者进行分装后放在-20℃条件下贮存。

(2)试剂准备

①1x洗液：按照一定配比稀释20x浓缩洗液至1x，常温保存。

②1x检测缓冲液：按一定配比稀释10x浓缩缓冲液至1x，立即使用。

③检测抗体：充分混匀检测抗体，根据需求，用1x检测缓冲液稀释浓缩的检测抗体。

④用1x检测缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

⑤TNF-α，IL-1β，IL-6和MCP-1标准品的准备：根据使用要求使用一定体积蒸馏水重溶TNF-α，IL-1β，IL-6和MCP-1标准品，使重溶后的标准品浓度为20000pg/ml。

(3)制备细胞培养上清样本标准曲线：

分别取250μl稀释后的TNF-α，IL-1β，IL-6和MCP-1标准品，再加入相同体积的完全培养基，以最高浓度(10000pg/ml)作为标准曲线。在其他待稀释的EP管中均加入250μl培养基，取最高浓度标品，吹打后按照1:1系列稀释。

(4)检测步骤

①根据实验设计计算所需检测板条，将其从板条中拆卸下来。

②检测孔中加入250μl1×洗液，置检测板与摇床上转动(45转/分钟)2min，去除洗液，在吸水纸上将微孔板倒扣拍打数次以充分去除残留洗液。

③向复孔加入100μl稀释后的TNF-α，IL-1β，IL-6和MCP-1标准品。

④向样本孔中加入20μl细胞培养上清及80μl1x检测缓冲液。

⑤分别加入50μl稀释后的检测抗体。

⑥封板膜封板，置检测孔板于摇床，转速300rpm，避光孵育2h。

⑦重复步骤②。

⑧分别滴加100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

⑨使用封板膜封板，置检测孔板于摇床，转速300rpm，室温避光孵育30-60min。

⑩重复步骤②。

取显色底物TMB100μl于各孔，培养箱中孵育30min。

加入100μl终止液于各检测孔，30min内，使用酶标仪测定450nm吸收波长下的OD值。

Tunel染色

将ATDC5细胞接种于载玻片上，细胞培养24小时后使用LPS刺激细胞，随后进行细胞转染，经适当处理时间后，PBS水洗后使用4％多聚甲醛固定30min，0.2％Triton X-100进行通透处理。滴加Equilibration Buffer 50μl，孵育30min。随后滴加含FITC-12-dUTPLabling Mix的TdT缓冲液，37℃避光孵育60min。PBS清洗载玻片2遍，之后将玻片浸入0.3％DAPI溶液中，室温避光孵育5min，去离子水清洗玻片3遍，滴加10μl抗荧光衰减试剂后，盖玻片封片，随后置于荧光显微镜下观察细胞凋亡变化，拍照后使用Image J软件分析结果。

ATDC5细胞经LPS诱导后，促凋亡因子bax和cleaved caspase3的表达上调，抗凋亡因子bcl-2表达下调。LPS处理并转染miR-200c-3p后，ATDC5细胞促凋亡因子bax和cleavedcaspase3的表达水平较LPS组显著降低，抗凋亡因子bcl-2的表达则有所增加，表明过表达miR-200c-3p可在一定程度上抑制LPS诱导的细胞凋亡。加入Lipo-miR-200c-3p并转染miR-200c-3p后，与LPS+miR-200c-3p组相比，促凋亡因子bax和cleaved caspase3表达水平降低，提示经Lipo-miR-200c-3p传递miR-200c-3p可更有效的抑制LPS诱导的ATDC5细胞凋亡(图9)

Western blot

(1)蛋白提取与处理

取于对数生长期的ATDC5细胞，按照2×106密度每孔接种于6孔板中，48小时后提取包浆蛋白。取处理后的6孔板，去除培养基，清洗细胞，置6孔板于冰上，每孔加入200μlRIPA蛋白裂解液裂解细胞，收集蛋白裂解液于1.5mlEP管中，离心后去除管底的沉淀，小心吸取蛋白溶液。

每管加入5x lodding Buffer 50μl，反复吹打胞浆蛋白液，将充分混匀的蛋白液置于超声破碎仪，低温超声4次，电压220V，每次2秒。经超声后的蛋白样品加热5min后，置于冰上降温后上样或-80℃冰箱备用。

(2)SDS-PAGE胶制备

SDS-PAGE胶配方如下，胶体凝固后置于清水中，放于4℃冰箱保存备用。

成分12％分离胶(10ml)15％分离胶(10ml)5％浓缩胶(3ml)

蒸馏水2.0ml 1ml 2.1ml

30％丙烯酰胺4.0ml 5.0ml 0.5ml

Tris-HCL 3.8ml(1.5M pH8.8)3.8ml(1.5M pH8.8)0.38(1.0M pH6.8)

10％SDS 0.1ml 0.1ml 0.03ml

10％过硫酸铵0.1ml 0.1ml 0.03ml

TEMED 0.004ml 0.004ml 0.003ml

(3)电泳分离

取出备用SDS-PAGE胶，将胶架装入电泳槽，加入1x电泳缓冲液500ml。取出胞浆蛋白置于冰上融化，上样20μl胞浆蛋白于SDS-PAGE胶上样孔中，同时上样2μl蛋白Marker，接通电源，设置电压100V，待蛋白样品跑至浓缩胶与分离胶接触面时，调整电压为120V，待溴酚蓝迁移到接近玻璃板底边时，切断电源，卸下玻璃板，开始转膜。

(4)转膜

打开玻璃板，取出胞浆蛋白分离后的SDS-PAGE胶，去除浓缩胶。根据Marker分离条带确定所测蛋白的位置，去掉其他凝胶，将相应SDS-PAGE胶片段裁剪。裁剪PVDF膜，与所切凝胶大小一致的，用75％乙醇浸泡以激活PVDF膜，随后置PVDF、凝胶、滤纸于转膜缓冲液中；组装转模槽，夹心法装配组装转膜结构。转膜顺序依次为：电源负极→海绵层→滤纸→SDS-PAGE胶片段→硝酸纤维素膜→滤纸→海绵层→电源正极。将转膜结构浸于转膜液中，去除滤纸、SDS-PAGE胶及PVDF膜三者之间的气泡。将转膜槽置于冰中，加入适量转膜缓冲液，连接电源(电流250mA)，转膜结束关闭电源，取出杂交膜，回收转膜液。

(5)免疫杂交及显影

①将杂交膜置于10ml封闭液(5％脱脂牛奶)中，摇床上封闭1小时。

②按实验要求配置一抗稀释液1ml-3ml，一抗稀释倍数根据抗体说明书确定，将经脱脂牛奶封闭的杂交膜封于一次性塑料薄膜中，加入相应的一抗稀释液，去除塑料薄膜中的气泡，封闭塑料薄膜，将封闭后的杂交膜置于摇床晃动(转速25次/分钟)，4℃孵育过夜。

③取出孵育后的杂交膜，置于10mlTBST缓冲液中，摇床清洗3次，转速45转/分钟。

④将二抗(1:5000)稀释于5％脱脂牛奶中，杂交膜置于含二抗的脱脂牛奶中，摇床上室温孵育1小时。

⑤取出二抗孵育后的杂交膜，重复步骤③。

⑥显影：在暗室中将杂交膜置塑料薄膜中，滴加200μl配置好的ECL超敏显影液(solution1和solution2按比例混和)，将胶片置于塑料薄膜上，然后放入X-ray底片匣中。迅速地将曝光的胶片置于显影液中，显影液处理时依胶片条带亮度而定，随后将胶片置于定影液中迅速漂洗3分钟，水洗后室温晾干。

⑦电脑扫描胶片中蛋白条带，Image J软件定量，Graphpad Prism软件处理实验数据。

实验结果表明(图10)：ATDC5细胞经LPS诱导后，细胞中的MMP3，MMP13和ADAMTS-4的表达显著增加，Collagen II的表达显著降低。LPS处理并转染miR-200c-3p后，ATDC5细胞MMP3，MMP13和ADAMTS-4的表达降低，Collagen II的表达升高。加入Lipo-miR-200c-3p并转染miR-200c-3p后，与LPS+miR-200c-3p组相比，MMP3，MMP13和ADAMTS-4的表达有所降低，Collagen II的表达升高。

靶点基因分析

在LPS诱导的ATDC5细胞的基础上转染miR-200c-3p(转染过程同上)，检测ZEB2的表达情况，qRT-PCR结果显示：与对照组相比，在转染miR-200c-3p后，ZEB2的表达显著下调(图11)，为了进一步验证miR-200c-3p和ZEB2基因的结合，我们做了双荧光素酶报告基因实验，证实miR-200c-3p和ZEB2是可以结合的(图12)随后，为了研究ZEB2对炎症因子和软骨基质合成和分解代谢的影响，我们设计了ZEB2的siRNA，在LPS诱导的ATDC5细胞中特异性的敲低ZEB2。通过ELISA法检测促炎因子(TNF-α，IL-6，IL-1β和MCP-1)的表达水平以及通过western blot方法检测软骨分解代谢相关蛋白(MMP3，MMP13，ADAMTS-4)和软骨合成代谢相关蛋白Collagen II的表达水平。我们的研究表明，促炎因子(TNF-α，IL-6，IL-1β和MCP-1)(图13)和软骨分解代谢相关蛋白(MMP3，MMP13，ADAMTS-4)的表达水平显著下降，而软骨合成代谢相关蛋白Collagen II的表达水平显著上升(图14)。上述结果表明miR-200c-3p通过与ZEB2基因结合，提高LPS诱导后ATDC5细胞的增殖能力、细胞周期以及软骨合成代谢，抑制了细胞凋亡、炎症浸润和软骨分解代谢。

实施例3

不同脂质材料制备纳米微粒递送miR-200c-3p对ATDC5细胞炎症反应及凋亡等作用的研究

(1)采用实施例1中的涡流混合器制备脂质体，脂质材料采用((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)，封装包裹miR-200c-3p。

(2)将((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、胆固醇和二硬脂酰基基磷脂乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)按摩尔比为(80：10:10)溶解在5ml甲醇溶液中作为A溶液(甲醇相)。将500微克加工合成的miR-200c-3p溶液分散在5ml柠檬酸缓冲溶液(浓度为100微克/毫升)作为B溶液(水相)。然后将A溶液和B溶液按照不同流速比同时注入自制混合器中，从而形成荷载有miR-200c-3p脂质体纳米粒溶液(ALC-miR-200c-3p)。总流速与流速比采用实施例1中的优化条件。

(3)细胞炎症模型参考实施例2。

(4)RT-PCR过程参考实施例2，用新制备的脂质体包裹的miR-200c-3p进行转染实验，考察对LPS处理ATDC5细胞的炎症因子表达量的影响。结果显示(图16)，LPS处理ATDC5细胞后，TNF-α，IL-6，IL-1β及MCP-1等促炎因子的表达明显增加。LPS处理并用新制备的脂质体转染miR-200c-3p后，ATDC5细胞表达促炎因子含量较LPS组显著下降，表明不同的阳离子脂质材料都可以很好的转染miR-200c-3p，有效的抑制LPS诱导的ATDC5细胞炎症反应。