2-磷酸甘油酸或其盐在制备用于缺氧缺血性脑损伤治疗的试剂/药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，公开了2-磷酸甘油酸或其盐在制备用于缺氧缺血性脑损伤治疗的试剂/药物中的应用。

背景技术

新生儿缺氧缺血性脑病是指新生儿由于围产期窒息缺氧而导致的脑缺氧缺血性损伤，易遗留神经损伤后遗症，比如：癫痫、智力障碍、运动障碍等。其中我国足月儿中缺氧缺血性脑病发生率约为千分之三，而其中的20％在新生儿期死亡，存活者中约有30％患儿遗留不同程度的神经系统后遗症。大量证据表明，中枢神经系统的神经损伤是长期神经功能障碍的根本原因。因此，减少神经损伤或促进损伤后神经恢复是改善缺氧缺血性脑病神经损伤的有效治疗方法。到目前为止，报道称亚低温治疗是新生儿中重度缺氧缺血性脑病的有效治疗方法。然而，亚低温治疗必须在出生后6小时内进行，即使如此，也仅只有不到50％的新生儿在亚低温治疗后神经损伤得到改善。而针对神经损伤修复的药物，如EPO、鼠神经生长因子、胞磷胆碱等仍面临着神经功能改善作用有限、远期保护效应不明等争议。因此，积极寻找安全有效的可补充或替代现有干预措施的治疗方式，降低缺氧缺血导致的神经损伤至关重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种化合物2-磷酸甘油酸及其在制备神经损伤试剂或药物中的用途，所述的2-磷酸甘油酸可显著降低氧糖剥夺/再氧合(OGD/R)海马神经元细胞铁死亡，降低OGD/R引起的氧化应激，改善线粒体损伤，促进神经细胞活力；显著降低脑梗死面积，明显促进皮层区及海马区神经元细胞存活，可以作为潜在的神经损伤修复药物，具有良好的应用前景。

本发明包括以下技术方案：

2-磷酸甘油酸或其盐在制备用于缺氧缺血性脑损伤治疗的试剂/药物中的用途。

所述2-磷酸甘油酸具有如以下式1的结构：

进一步的，上述2-磷酸甘油酸或其盐可以是商业购得，或者自己生产所得。

进一步的，所述试剂/药物为促进氧糖剥夺OGD/R海马神经元细胞活力和或抑制氧糖剥夺OGD/R海马神经元细胞死亡的药物。在一些实施例中，细胞培养液中加入2-磷酸甘油酸，有促进OGD/R海马神经元细胞活力的作用；在一些实施例中，细胞培养液中加入2-磷酸甘油酸，有抑制氧糖剥夺(OGD/R)海马神经元细胞死亡的作用。

进一步的，所述的海马神经元细胞属于HT-22细胞系。在某些实施例中，所述的海马神经元细胞为HT-22细胞系，所述的OGD/R氧糖剥夺模型为常规氧糖剥夺模型，其中细胞培养在无糖DMEM的培养基中，在5％CO

进一步的，所述试剂/药物为治疗新生儿缺氧缺血引起的神经损伤或缺血再灌注神经损伤的试剂/药物。

进一步的，所述试剂/药物制备成用于侧脑室注射的剂型。

进一步的，本发明公开了2-磷酸甘油酸或其盐在制备促进缺氧缺血性脑损伤神经元存活的试剂/药物中的用途

进一步的，本发明公开了2-磷酸甘油酸或其盐在制备抑制海马神经元细胞铁死亡的试剂/药物中的用途；在一些实施例中，所述的海马神经元细胞铁死亡，为25nM RSL3诱导的海马神经元细胞铁死亡模型；在一些实施例中，细胞培养液中加入2-磷酸甘油酸，有促进RSL3诱导的海马神经元细胞活力的作用。

另一方面，本发明公开了2-磷酸甘油酸或其盐在制备抑制氧糖剥夺(OGD/R)海马神经元细胞铁死亡的试剂/药物中的用途。在一些实施例中，细胞培养液中加入2-磷酸甘油酸，有抑制氧化应激，降低细胞内Fe

进一步的，本发明公开了2-磷酸甘油酸或其盐在制备抑制缺氧缺血性脑损伤神经元铁死亡的试剂/药物中的用途。

另一方面，本发明公开了2-磷酸甘油酸或其盐在制备降低缺氧缺血性脑损伤脑梗死中的用途。

进一步的，所述的缺氧缺血性脑损伤为新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型。

进一步的，降低缺氧缺血性脑损伤脑梗死，在一些实施例中，通过侧脑室注射2-磷酸甘油酸，有降低缺氧缺血性脑损伤脑梗死的作用。

另一方面，本发明公开了2-磷酸甘油酸或其盐在制备促进缺氧缺血性脑损伤神经元存活的用途。

进一步的，促进缺氧缺血性脑损伤神经元存活，在一些实施例中，通过侧脑室注射2-磷酸甘油酸，有促进缺氧缺血性脑损伤皮层及海马区神经元存活作用。

另一方面，本发明公开了2-磷酸甘油酸或其盐在制备抑制缺氧缺血性脑损伤神经元铁死亡的用途。

进一步的，抑制缺氧缺血性脑损伤神经元铁死亡，在一些实施例中，通过侧脑室注射2-磷酸甘油酸，有促进缺氧缺血性脑损伤皮层及海马区GPX4表达的作用。

另一方面，本发明公开了一种用于治疗缺氧缺血性脑损伤的试剂、药物或药物组合物，其特征在于，含有治疗量的2-磷酸甘油酸或其盐。

进一步的，所述试剂、药物或药物组合物的制剂为药学上可接受的形式，包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、滴丸、栓剂、锭剂、喷雾、乳膏、贴剂中的一种或者多种。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现2-磷酸甘油酸作为细胞溶液添加剂可显著促进OGD/R引起的海马神经元降低，促进OGD/R诱导的海马神经元细胞存活，降低OGD/R诱导的海马神经元导致的铁死亡。本发明构建缺氧缺血性脑病损伤新生大鼠模型，通过侧脑室给药2-磷酸甘油酸，可显著降低缺氧缺血引起的脑梗死面积，促进大脑皮层及海马区神经元细胞存活，降低神经元细胞铁死亡。

进一步的，本发明公开了一种化合物2-磷酸甘油酸及其在制备神经损伤修复试剂或药物中的用途，所述2-磷酸甘油酸可显著提高OGD/R诱导的海马神经元细胞活力，抑制OGD/R导致的海马神经元细胞死亡；机制解析发现2-磷酸甘油酸通过调控ACSL4/GPX4轴，抑制OGD/R诱导的海马神经元细胞铁死亡，发挥神经保护作用，具体表现在2-磷酸甘油酸可显著降低OGD/R导致的Fe

附图说明

图1为实施例中2-磷酸甘油酸处理OGD/R海马神经元细胞，促进海马神经元细胞活力，抑制神经细胞死亡；A为2-磷酸甘油酸促进海马神经元细胞活力；B为2-磷酸甘油酸显著抑制OGD/R海马神经元细胞死亡；C为B图中细胞死亡比例统计；

图2为实施例中2-磷酸甘油酸抑制氧糖剥夺(OGD/R)诱导的海马神经元细胞铁死亡；A为2-磷酸甘油酸降低OGD/R引起的Fe

图3为实施例中2-磷酸甘油酸通过调控ACSL4/GPX4轴抑制神经细胞铁死亡；A为2-磷酸甘油酸降低OGD/R引起的ACSL4高表达，B为统计的A图中ACSL4的荧光强度；C为2-磷酸甘油酸显著增加GD/R引起的GPX4低表达，D为统计的C图中GPX4的荧光强度；

图4为实施例中2-磷酸甘油酸显著增加RSL3诱导的海马神经元细胞活力；

图5为实施例中2-磷酸甘油酸显著降低缺氧缺血性脑损伤脑梗死面积；A为TTC染色显示脑梗死情况；B为脑梗死面积统计结果；

图6为实施例中2-磷酸甘油酸显著促进缺氧缺血性脑损伤大脑神经元存活；A为HE染色结果显示2-磷酸甘油酸促进缺氧缺血性脑损伤神经元细胞存活；B为Nissl染色结果显示2-磷酸甘油酸显著促进缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织神经元细胞存活；

图7为实施例中2-磷酸甘油酸显著抑制缺氧缺血性脑损伤导致的神经元细胞铁死亡。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

1.1CCK-8法检测2-磷酸甘油酸对OGD/R海马神经元细胞活力的影响。

将海马神经元细胞系HT-22培养于37℃、5％CO

如图1A所示，200μM的2-磷酸甘油酸可显著改善OGD/R导致的神经细胞损伤，促进OGD/R诱导的HT-22活力。

1.2Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22海马神经元细胞死亡的影响。

以50μM、100μM和200μM的2-磷酸甘油酸处理的OGD/R HT-22，利用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22细胞死亡的影响。

如图1B，1C所示，2-磷酸甘油酸显著降低OGD/R导致的海马神经元死亡，促进海马神经元细胞存活。

实施例2

2.1FerrOrange染色检测2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22海马神经元细胞Fe2+聚集的影响

200μM的2-磷酸甘油酸处理的OGD/R HT-22，利用FerrOrange染色检测2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22细胞Fe2+聚集的影响。

如图2A所示，2-磷酸甘油酸显著降低OGD/R导致的海马神经元Fe2+聚集。

2.2ROS染色检测2-磷酸甘油酸对OGD/RHT-22海马神经元细胞ROS产生的影响

200μM的2-磷酸甘油酸处理的OGD/R HT-22，利用ROS检测试剂盒检测2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22细胞ROS产生的影响。

如图2B-C所示，2-磷酸甘油酸显著降低OGD/R导致的海马神经元ROS积聚，提示，2-磷酸甘油酸显著降低OGD/R引起的氧化应激。

2.3JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22海马神经元细胞线粒体膜电位的影响

200μM的2-磷酸甘油酸处理的OGD/R HT-22，利用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22细胞线粒体膜电位产生的影响。

如图2D-E所示，2-磷酸甘油酸显著促进OGD/R导致的海马神经元线粒体膜电位，提示，2-磷酸甘油酸显著促进线粒体活性。

2.4透射扫描电镜观察2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22海马神经元细胞线粒体表型的影响

200μM的2-磷酸甘油酸处理的OGD/RHT-22，利用透射扫描电镜观察2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22细胞线粒体产生的影响。

如图2F所示，2-磷酸甘油酸显著改善OGD/R导致的海马神经元铁死亡导致的线粒体嵴减少，提示，2-磷酸甘油酸具有抑制铁死亡，增加线粒体活性的作用。

实施例3

免疫荧光检测2-磷酸甘油酸对OGD/R HT-22海马神经元细胞铁死亡相关标记基因ACSL4和GPX4的影响。

200μM的2-磷酸甘油酸处理的OGD/R HT-22，利用免疫荧光观察2-磷酸甘油酸对OGD/RHT-22细胞铁死亡相关基因的影响。

如图3A-B所示，2-磷酸甘油酸显著降低OGD/R导致的海马神经元ACSL4的高表达；此外，如图3C-D所示，2-磷酸甘油酸显著增加OGD/R导致的海马神经元GPX4的低表达；提示，2-磷酸甘油酸具有抑制OGD/R导致的海马神经元铁死亡的作用。

实施例4

CCK-8法检测2-磷酸甘油酸对RSL3诱导的海马神经元细胞活力的影响

以50μM、100μM和200μM的2-磷酸甘油酸干预25nM RSL3处理HT-2224小时、48小时及72小时后，利用CCK8细胞活力检测试剂盒检测2-磷酸甘油酸对RSL处理的HT-22细胞活力的影响。

如图4所示，25nM RSL3处理HT-2272小时后，可显著降低HT-22细胞活力，而200μM的2-磷酸甘油酸干预RSL3处理HT-2272小时后，可显著促进HT-22细胞活力，提示2-磷酸甘油酸可以作为铁死亡抑制剂，显著降低RSL3诱导的细胞铁死亡。

实施例5

TTC染色检测2-磷酸甘油酸对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑梗死的影响

利用新生7天的大鼠，构建缺氧缺血性脑损伤模型，按照改良的Rice-Vannucci方法，将左侧颈总动脉的上侧及下侧进行双次结扎后，剪短结扎后的颈总动脉，确保左侧颈总动脉缺血后，将术后的幼鼠放回母鼠身边2小时后，置于8％O2，92％N2的缺氧盒中缺氧处理2小时即为构建缺氧缺血性脑损伤组；其中2-磷酸甘油酸干预组在结扎并剪短左侧颈总动脉后，利用立体定位仪向缺氧缺血性脑损伤组大鼠侧脑室注射2-磷酸甘油酸(注射浓度为100μM和200μM)；而对照组采用假手术组，只暴露左侧颈总动脉；将其处理完毕后放回母鼠身边，24小时后，取幼鼠大脑，切片并行TTC染色实验。

如图5所示，TTC染色结果显示，颅内注射100μM和200μM的2-磷酸甘油酸可显著降低缺氧缺血性脑损伤组脑梗死面积，表明2-磷酸甘油酸可显著降低缺氧缺血性脑损伤大鼠的神经损伤。

实施例6

6.1HE染色检测2-磷酸甘油酸对缺氧缺血性脑损伤大脑神经元存活的影响。

将假手术组、构建的缺氧缺血性脑损伤模型及颅内注射2-磷酸甘油酸，分别命名为假手术组(Sham组)、损伤组(HIBD组)，损伤组+颅内注射100μM 2-磷酸甘油酸组(HIBD+100μM PA组)，损伤组+颅内注射200μM 2-磷酸甘油酸组(HIBD+200μM PA组)，利用HE染色观察2-磷酸甘油酸对缺氧缺血性脑损伤大脑神经元存活的影响。

如图6A所示，HE染色结果显示，颅内注射100μM和200μM的2-磷酸甘油酸可显著改善皮层及海马区神经元损伤，表明2-磷酸甘油酸可显著促进缺氧缺血性脑损伤大鼠的神经元存活。

6.2Nissl染色检测2-磷酸甘油酸对缺氧缺血性脑损伤大脑神经元存活的影响。

将假手术组、构建的缺氧缺血性脑损伤模型及颅内注射2-磷酸甘油酸，分别命名为假手术组(Sham组)、损伤组(HIBD组)，损伤组+颅内注射100μM 2-磷酸甘油酸组(HIBD+100μM PA组)，损伤组+颅内注射200μM 2-磷酸甘油酸组(HIBD+200μM PA组)，利用Nissl染色观察2-磷酸甘油酸对缺氧缺血性脑损伤大脑神经元存活的影响。

如图6B所示，Nissl染色结果显示，颅内注射100μM和200μM的2-磷酸甘油酸可显著增加皮层及海马区神经元数量，表明2-磷酸甘油酸可显著促进缺氧缺血性脑损伤大鼠的神经元存活。

实施例7

免疫荧光结果检测2-磷酸甘油酸对缺氧缺血性脑损伤皮层及海马区神经元及GPX4表达的影响

将假手术组、构建的缺氧缺血性脑损伤模型及颅内注射2-磷酸甘油酸，分别命名为假手术组(Sham组)、损伤组(HIBD组)，损伤组+颅内注射100μM 2-磷酸甘油酸组(HIBD+100μM PA组)，损伤组+颅内注射200μM 2-磷酸甘油酸组(HIBD+200μM PA组)，利用免疫荧光染色观察2-磷酸甘油酸对缺氧缺血性脑损伤大脑神经元中GPX4的影响。

如图7所示，免疫荧光结果显示，颅内注射100μM和200μM的2-磷酸甘油酸可显著增加皮层及海马区神经元数量(NeuN+)，其次，100μM和200μM的2-磷酸甘油酸可显著促进大脑皮层及海马区GPX4的表达。提示，2-磷酸甘油酸通过抑制缺氧缺血导致的神经细胞铁死亡促进神经细胞存活。

综合以上实施例1-7可见，本发明公开了一种化合物2-磷酸甘油酸及其在制备神经损伤修复试剂或药物中的用途，所述2-磷酸甘油酸可显著提高OGD/R诱导的海马神经元细胞活力，抑制OGD/R导致的海马神经元细胞死亡；机制解析发现2-磷酸甘油酸通过调控ACSL4/GPX4轴，抑制OGD/R诱导的海马神经元细胞铁死亡，发挥神经保护作用，具体表现在2-磷酸甘油酸可显著降低OGD/R导致的Fe

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。