一种同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针的合成与应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针及其制备方法、使用方法和应用。该探针以新颖的方式将两个荧光团结合起来并能从各种生物活性物质中快速选择性检测半胱氨酸和高半胱氨酸，绿色荧光通道选择性检测半胱氨酸，红外荧光通道选择性检测高半胱氨酸，具有大斯托克斯位移、高荧光量子产率，检测灵敏度高和可视化检测等优点。

背景技术

半胱氨酸（Cys）和高半胱氨酸（Hcy）等细胞内生物硫醇在蛋白质合成、细胞代谢、信号转导和氧化应激调节等各种生理活动中发挥关键作用，其异常细胞水平与许多人类疾病密切相关（Chem. Sci. 2021,12, 1220−1226；Chem. - Eur. J. 2020,26, 4172−4192；Angew. Chem., Int. Ed. 2017,56, 13188−13198）。Cys主要参与蛋白质合成，Cys异常水平与水肿、嗜睡、生长迟缓、肝损伤和心血管疾病等有关（Chem. Rev. 2013, 113, 4633−4679）。Hcy是细胞中含量最少的生物硫醇（微摩尔水平），Hcy 的浓度波动被证明是心血管疾病、阿尔茨海默病和骨质疏松症的危险因素（N. Engl. J. Med. 2002, 346, 476–483）。在生物体中，Cys 和 Hcy 密切相关，例如，Hcy来源于甲硫氨酸的代谢，通过转硫反应可分解为Cys，每种生物硫醇的浓度波动都会对其他生物硫醇产生显着影响（Chem. Sci. 2017,8, 6257–6265）。更具有挑战的是，Cys 和 Hcy具有相似化学结构（区别仅在于一个亚甲基）并且它们的化学性质同样相似（都具有一个巯基和氨基），因此要了解它们在生理过程中各自的功能和关系，需要同时区分Cys和Hcy。

在目前开发的方法中，荧光探针被认为是最有前途的技术生物分析物的监测和细胞内成像，由于其高分辨率和灵敏度、操作简单以及非侵入性。（Chem. Soc. Rev. 2011,40,79−93；Angew. Chem.,Int. Ed. 2021, 60, 26337−26341；Nat. Commun. 2018, 9,2698；Chem. Rev. 2022, 453, 214336）迄今为止，已经实现了一系列用于检测生物硫醇的荧光探针；然而，它们主要是检测 GSH、Cys /Hcy或 Cys 和 Hcy 的总和，而由于 Hcy 含量相对较低，并且结构和活性与Cys极其相似，因此无法特异性区分Cys和Hcy（J. Am. Chem.Soc. 2021, 143, 318−325；Chem. Sci. 2019, 10, 10065−10071；Chin. Chem.Lett.2021, 32, 1061−1065）。尽管最近报道了几个探针的例子，它们仍然受到不适合或不适合生理应用的限制，例如多重检测程序、长检测时间、干扰大、检测范围不够或需要两到三组激发光源。此外，当多响应时，单波长激发是荧光探针被用于定性分析的首选，因为它可以大大简化操作程序并避免数据失真。因此，开发新的有效的单激发双发射同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光探针仍然是一项紧迫而艰巨的任务。目前开发出一种同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针用于细胞中同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸，监测其异常水平波动仍然具有巨大挑战。

发明内容

鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针及其制备方法、使用方法和应用，以解决上述问题。

本发明解决问题采取的具体技术方案为，一种同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针及其制备方法、使用方法和应用，其探针的化学结构式如下：

。

同时区分半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针，其特征在于，所述的单激发双发射荧光探针的制备方法包括以下步骤：

步骤1. 合成4-(4-羟基-2-氧氧- 2h -铬-7-基乙基)氨基丁酸叔丁酯；

将4-(3-羟苯乙酯)氨基丁酸叔丁酯和二(2,4,6-三氯苯)丙二酸酯加入甲苯中，在110℃下搅拌过夜，反应完全后将溶剂蒸发旋干，柱层析分离纯化得到4-(4-羟基-2-氧氧-2h -铬-7-基乙基)氨基丁酸叔丁酯；

步骤2. 合成4-(4-氯-3-甲酰基-2-氧氧-2h-铬-7-基)(乙基)氨基丁酸；

在氮气保护条件下，将适量干燥重蒸的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)缓慢加入等体积的三氯氧磷(POCl

步骤3. 合成4-(4-(丁基硫基)-3-甲酰基-2-氧氧- 2h -铬-7-基)(乙基)氨基丁酸；

将4-(4-氯-3-甲酰基-2-氧氧- 2h -铬-7-基)(乙基)氨基丁酸和丁硫醇加入适量无水二氯甲烷中，再加入适量三乙胺，常温搅拌，反应完毕后柱层析分离纯化得4-(4-(丁基硫基)-3-甲酰基-2-氧氧- 2h -铬-7-基)(乙基)氨基丁酸；

步骤4. 合成10-(4-(4-((4-(丁硫基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-铬烯-7-基) (乙基)氨基)丁酰胺基)苯基)-5,5-二氟-1,3,7,9-四甲基-5H-5l4-二吡咯并[1,2-c:2'，1'-f][1,3,2]二氮杂硼-4-鎓；

将适量4-(4-(丁基硫基)-3-甲酰基-2-氧氧- 2h -铬-7-基)(乙基)氨基丁酸加入无水二氯甲烷中，再加入适量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，常温反应30 min，将适量的4-(5,5-二氟- 1,3,7,9-四甲基- 5h -4l4,5l4-二吡咯[1,2-c:2'，1'-f][1,3,2] 二氮杂硼啉-10-基)苯胺缓慢加入上述溶液，然后再加入适量1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺，常温搅拌，反应完全后，旋干，柱层析纯化得到10-(4-(4-((4-(丁硫基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-铬烯-7-基) (乙基)氨基)丁酰胺基)苯基)-5,5-二氟-1,3,7,9-四甲基-5H-5l4-二吡咯并[1,2-c:2'，1'-f][1,3,2]二氮杂硼-4-鎓；

步骤5. 合成所述的单激发双发射荧光探针；

将10-(4-(4-((4-(丁硫基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-铬烯-7-基) (乙基)氨基)丁酰胺基)苯基)-5,5-二氟-1,3,7,9-四甲基-5H-5l4-二吡咯并[1,2-c:2'，1'-f][1,3,2]二氮杂硼-4-鎓和4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1-甲基吡啶-1-碘化鎓加入适量乙醇，再加入适量乙酸铵和乙酸，常温搅拌，反应完全后，旋干，柱层析纯化得到所述的单激发双发射荧光探针。

本发明的单激发双发射荧光探针同时区分检测半胱氨酸和高半胱氨酸使用方法：无特殊说明，通常在室温下将所述的探针溶解在有机相和水相体积比为5:5的环境下用于分析检测，有机相为二甲基亚砜(DMSO)，水相为pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)和分析物的水溶液。

本发明的单激发双发射荧光探针同时区分半胱氨酸和高半胱氨酸具体特征如下：该荧光探针用二甲基亚砜(DMSO)溶解，探针溶解在有机相和水相(5:5,v/v)溶液中，探针与半胱氨酸反应后在480 nm激发波长下发射520 nm的绿光，与高半胱氨酸反应后在480 nm激发波长下发射620 nm的红光。因此实现单一波长激发，同时双发射检测半胱氨酸和高半胱氨酸。此外，所述的单激发双发射荧光探针实现了同时区分检测半胱氨酸和高半胱氨酸，对其他活性氧、活性硫、常见的氨基酸、金属离子和活性氮等均无明显响应。探针检测对半胱氨酸和高半胱氨酸的检测限分别低至62.6 nM和282.8 nM。因此，本发明公开的单激发双发射荧光探针能够实现双通道同时区分半胱氨酸和高半胱氨酸。

附图说明

图1同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针的核磁共振氢谱图。

图2同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针的紫外荧光图。

图3同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针的定量分析图。

图4同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针的细胞成像图。

实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

本发明所述的单激发双发射荧光探针的合成路线如下式所示：

。

实施例1. 合成4-(4-羟基-2-氧氧- 2h -铬-7-基乙基)氨基丁酸叔丁酯

将5.00 g (17.90 mmol) 4-(3-羟苯乙酯)氨基丁酸叔丁酯和9.11 g (19.69mmol)二(2,4,6-三氯苯)丙二酸酯加入60 mL甲苯中，在110℃下搅拌过夜，反应完全后，将体系蒸发旋干，进行柱层析纯化得到4-(4-羟基-2-氧氧- 2h -铬-7-基乙基)氨基丁酸叔丁酯2.50 g，产率40.21%。

实施例2. 合成4-(4-氯-3-甲酰基-2-氧氧-2h-铬-7-基)(乙基)氨基丁酸

在氮气保护条件下，将15 mL干燥重蒸的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)缓慢加入14 mL的三氯氧磷(POCl

实施例3. 合成4-(4-(丁基硫基)-3-甲酰基-2-氧氧- 2h -铬-7-基)(乙基)氨基丁酸

将1.00 g (2.96 mmol) 4-(4-氯-3-甲酰基-2-氧氧- 2h -铬-7-基)(乙基)氨基丁酸和320.41 mg (3.55 mmol)丁硫醇加入15 mL无水二氯甲烷中，再加入449.41 mg(4.44 mmol)三乙胺，常温搅拌过夜，反应完毕后柱层析纯化得4-(4-(丁基硫基)-3-甲酰基-2-氧氧- 2h -铬-7-基)(乙基)氨基丁酸1.10 g，产率为94.90%。

实施例4. 合成10-(4-(4-((4-(丁硫基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-铬烯-7-基) (乙基)氨基)丁酰胺基)苯基)-5,5-二氟-1,3,7,9-四甲基-5H-5l4-二吡咯并[1,2-c:2'，1'-f][1,3,2]二氮杂硼-4-鎓

将150.00 mg (383.16 μmol) 4-(4-(丁基硫基)-3-甲酰基-2-氧氧- 2h -铬-7-基)(乙基)氨基丁酸加入8 mL二氯甲烷中，加入20 mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，常温反应30 min，将129.97 mg (383.16 μmol)的4-(5,5-二氟- 1,3,7,9-四甲基- 5h -4l4,5l4-二吡咯[1,2-c:2'，1'-f][1,3,2] 二氮杂硼啉-10-基)苯胺缓慢加入上述溶液，然后再加入110.18 mg (574.74 μmol) 1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺，常温下反应24 h，旋干反应体系，柱层析纯化得到10-(4-(4-((4-(丁硫基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-铬烯-7-基) (乙基)氨基)丁酰胺基)苯基)-5,5-二氟-1,3,7,9-四甲基-5H-5l4-二吡咯并[1,2-c:2'，1'-f][1,3,2]二氮杂硼-4-鎓160.0 mg，产率为58.59%。

实施例5. 合成所述的单激发双发射荧光探针

将100.00 mg (140.32 μmol) 10-(4-(4-((4-(丁硫基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-铬烯-7-基) (乙基)氨基)丁酰胺基)苯基)-5,5-二氟-1,3,7,9-四甲基-5H-5l4-二吡咯并[1,2-c:2'，1'-f][1,3,2]二氮杂硼-4-鎓和51.72 mg (168.38 μmol) 4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1-甲基吡啶-1-碘化鎓加入6 mL乙醇，再加入5 mg乙酸铵和20 μL乙酸，常温反应过夜，旋干反应体系，柱层析纯化得到所述的单激发双发射荧光探针32.0 mg，产率为22.76%。

实施例6. 所述的单激发双发射荧光探针在体外环境中检测半胱氨酸和高半胱氨酸

单激发双发射荧光探针光谱性质实验：将探针溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配置成浓度为1 mM的探针溶液，分别配置浓度为10 mM的半胱氨酸和高半胱氨酸溶液。具体测试方式为：取20 μL 1 mM的探针溶液，再加入20 μL 10 mM的分析物溶液，最后加入的980 μL的分析纯DMSO和980 μL PBS，所有测试均保持有机相和水相的体积比为5:5 (每一个测试样品总体积为2 mL)。例如当要求测试探针与100 μM 半胱氨酸或高半胱氨酸溶液反应后的荧光强度，配制样品情况为：取20 μL的1 mM的探针溶液，20 μL的10 mM的半胱氨酸或高半胱氨酸溶液，再加入980 μL的分析纯DMSO和980 μL的PBS缓冲溶液于2 mL的样品管中，室温下震荡摇匀30分钟后即可用480 nm的激发波长测量在520 nm或620 nm处的荧光发射强度，其他测试操作与上述步骤类似。

实施例7. HepG2（肝癌细胞）细胞中内源性和外源性半胱氨酸或高半胱氨酸双通道荧光成像分析

将HepG2细胞传代至共聚焦皿细胞培养基中，在标准生长条件下培养24小时后，加入适量探针(5 μM)继续在标准生长条件下培养30分钟，然后在共聚焦荧光显微镜下照相，分别用绿色、红色荧光通道进行荧光成像HepG2细胞内源性和外源性的半胱氨酸或高半胱氨酸，本发明的荧光探针通过单一波长激发（480 nm）在细胞中能发射绿色荧光（520 nm）和红色荧光（620 nm），说明探针能够检测细胞中的半胱氨酸或高半胱氨酸。

本申请提供的一种同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸的单激发双发射荧光探针，能通过单一波长激发(480 nm)，在绿色通道(520 nm)检测半胱氨酸，在红色通道(620nm)检测高半胱氨酸。两发射之间相差100 nm，光谱互不干扰，可选择性同时区分成像半胱氨酸和高半胱氨酸。该探针检测半胱氨酸和高半胱氨酸溶液荧光明亮，具有高的灵敏度，非常适合活细胞内源性半胱氨酸和高半胱氨酸溶液的同时成像/定量分析，能够用于细胞中半胱氨酸和高半胱氨酸水平波动的成像研究。在生物化学、生命医疗等领域都具有较大的实际应用价值。尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。