一种达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测方法。

背景技术

达格列净是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)选择性抑制剂。SGLT2选择性表达在肾小球近端小管的第一节(S1)，调控大部分(90％)滤过液葡萄糖的重吸收。达格列净抑制SGLT2会导致多余的葡萄糖通过尿液排泄，从而在不增加胰岛素分泌的情况下改善血糖控制。体外研究表明，相对于密切相关的选择性1242-1600-折叠的hSGLT1，达格列净能有效选择性的抑制人体(h)SGLT2。达格列净同样被证实，相对于mGLT1和dSGLT1其可以选择性的抑制老鼠(m)和犬(d)的SGLT2。临床研究结果显示，达格列净单用或与二甲双胍、吡格列酮、格列美脲、胰岛素等药物联合使用，可以显著降低II型糖尿病患者的HbA1c和空腹血糖，不良反应发生率与安慰剂相似，低血糖风险低。

2-氯-4-溴苯甲酰氯是达格列净起始物料1(SM1)合成过程中产生的，为潜在的基因毒性杂质，为了更好地控制达格列净的质量，有必要提供一种测量方法，以检测达格列净SM1中是否含有2-氯-4-溴苯甲酰氯，从而保证用药的安全性，但是目前尚未见达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯检测方法的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测方法。本发明提供的检测方法可以有效检测出达格列净SM-1中是否含有残留的2-氯-4-溴苯甲酰氯及其含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测方法，包括以下步骤：

将2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品溶于甲醇中，得到对照品溶液；

将待测达格列净SM-1溶于甲醇中，得到供试品溶液；

将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，得到2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积和待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积；

基于所述2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积，得到待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量；

所述高效液相色谱检测的参数包括：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶反相色谱柱；

流动相体系包括流动相A和流动相B；

所述流动相A为水，所述流动相B为甲醇；

洗脱的方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如表1所示：

表1梯度洗脱的程序

检测波长：225nm。

优选地，所述高效液相色谱检测的参数还包括：检测器为二极管阵列检测器。

优选地，所述流动相体系的流速为0.9～1.1mL·min

优选地，所述高效液相色谱检测的参数还包括：柱温为25～35℃。

优选地，所述高效液相色谱检测的参数还包括：进样体积为10μL。

优选地，所述色谱柱的尺寸为4.6mm×250mm，5μm。

优选地，所述高效液相色谱检测的仪器为Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪。

优选地，所述对照品溶液的浓度为2.7～3.3μg/mL。

优选地，所述供试品溶液的浓度为18～22mg/mL。

优选地，所述基于2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积，得到待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量包括：

采用公式1计算得到待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量；

公式1中：

2-氯-4-溴苯甲酰氯含量的单位为ppm；

A

W

F

公式2中：

n为对照品溶液的进样次数；

F

公式3中，W

P

A

本发明提供了一种达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测方法，包括以下步骤：将2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品溶于甲醇中，得到对照品溶液；将待测达格列净SM-1溶于甲醇中，得到供试品溶液；将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，得到2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积和待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积；基于所述2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积，得到待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量；所述高效液相色谱检测的参数包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶反相色谱柱；流动相体系包括流动相A和流动相B；所述流动相A为水，所述流动相B为甲醇；洗脱的方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序如表1所示：检测波长：225nm。

本发明提供的检测方法具有较高的灵敏性和耐用性，可以有效检测出达格列净SM-1中是否含有残留的2-氯-4-溴苯甲酰氯及其含量，通过本发明方法能够有效地控制达格列净产品的质量，提高了药品的用药安全。

附图说明

图1为专属性验证例中溶剂的典型HPLC色谱图；

图2为专属性验证例中对照品溶液的典型HPLC色谱图；

图3为专属性验证例中供试品溶液的典型HPLC色谱图；

图4为专属性验证例中加标供试品溶液的典型HPLC色谱图；

图5为专属性验证例中专属性溶液(溶剂、对照品溶液和加标供试品溶液)的典型HPLC色谱图；

图6为定量限溶液的典型HPLC色谱图；

图7为检测限溶液的典型HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测方法，包括以下步骤：

将2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品溶于甲醇中，得到对照品溶液；

将待测达格列净SM-1溶于甲醇中，得到供试品溶液；

将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，得到2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积和待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积；

基于所述2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积，得到待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量；

所述高效液相色谱检测的参数包括：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶反相色谱柱；

流动相体系包括流动相A和流动相B；

所述流动相A为水，所述流动相B为甲醇；

洗脱的方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如表1所示：

检测波长：225nm。

在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。

将2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品溶于甲醇中，得到对照品溶液。

在本发明中，所述2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品的纯度优选≥95wt％。在本发明中，所述对照品溶液的浓度优选为2.7～3.3μg/mL，进一步优选为3.0μg/mL。

本发明将待测达格列净SM-1溶于甲醇中，得到供试品溶液。

在本发明中，所述供试品溶液的浓度优选为18～22mg/mL，进一步优选为20mg/mL。

得到对照品溶液和供试品溶液后，本发明将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，得到2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积和待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的参数包括：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶反相色谱柱，优选为月旭Xtimate C18；

所述色谱柱的尺寸优选为4.6mm×250mm，5μm；

柱温优选为25～35℃，进一步优选为30℃；

流动相体系包括流动相A和流动相B；

所述流动相体系的流速优选为0.9～1.1mL·min

所述流动相A为水，所述流动相B为甲醇；

洗脱的方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如表1所示：

进样体积优选为10μL；

检测波长为225nm；

检测器优选为二极管阵列检测器。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的仪器优选为Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪。在本发明中，所述Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪优选包括四元泵、脱气单元、二极管阵列检测器、柱温箱、自动进样器、系统监测器和Chromeleon7工作站。

得到2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积和待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积后，本发明基于所述2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积，得到待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量。

在本发明中，所述基于2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品中2-氯-4-溴苯甲酰氯的峰面积，得到待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量优选包括：

采用公式1计算得到待测达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量；

公式1中：

2-氯-4-溴苯甲酰氯含量的单位为ppm；

A

W

F

公式2中：

n为对照品溶液的进样次数；

F

公式3中，W

P

A

下面结合实施例对本发明提供的达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例与验证例中所采用的的材料、试剂、仪器与HPLC色谱条件为：

1.仪器与HPLC色谱条件：

Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪(四元泵、脱气单元、二极管阵列检测器、柱温箱、自动进样器、系统监测器和Chromeleon7工作站)(美国Thermo Fisher公司)；MSA6.6S-0CE型百万分之一天平(德国Sartorius公司)；AB265-S型十万分之一分析天平(美国METTLERTOLEDO公司)。

高效液相色谱检测的条件：色谱柱：月旭Xtimate C18，尺寸为4.6mm×250mm，5μm，柱温为30℃，流动相A为水，流动相B为甲醇，按表1的梯度洗脱的程序进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min，进样体积10μL，检测波长为225nm。

2.材料：

2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品(来源：博洛德，批号：DGLJ20200701)；达格列净SM-1(来源：山东鲁抗医药股份有限公司、济南三元化工，批号：C274-股Z2006001、20200303、20200401)；甲醇(来源：新蓝景，批号：A2219041000)。

实施例1

对照品溶液制备：精密称取2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品适量，加甲醇溶解并稀释成每1mL含3.0μg的2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液制备：取达格列净SM-1适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1mL含达格列净SM-120mg的溶液，作为供试品溶液。

分别精密量取上述溶液各10μL，注入Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪，记录峰面积，采用公式1～3法计算达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的含量，结果见表2。

表2达格列净SM-1中2-氯-4-溴苯甲酰氯的测定结果

验证例方法学验证

1、专属性

溶剂：甲醇。

对照品贮备溶液：取2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品约3mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取达格列净SM-1200mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

加标供试品溶液：取达格列净SM-1200mg，精密称定，精密量取对照品贮备溶液1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

精密量取溶剂、对照品溶液、供试品溶液和加标供试品溶液各10μL，注入ThermoUltimate 3000高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1～4。

图1为专属性验证例中溶剂的典型HPLC色谱图，图2为专属性验证例中对照品溶液的典型HPLC色谱图，图3为专属性验证例中供试品溶液的典型HPLC色谱图，图4为专属性验证例中加标供试品溶液的典型HPLC色谱图，图5为专属性验证例中专属性溶液(溶剂、对照品溶液和加标供试品溶液)的典型HPLC色谱图；由图1～5可以看出：溶剂对2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测无干扰，加标供试品溶液色谱图中2-氯-4-溴苯甲酰氯峰与主峰分离度符合要求。

2、定量限、检测限

检测限(LOD)和定量限(LOQ)是根据信噪比法来确定的。已知浓度的2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品贮备液稀释，S/N≈10时的浓度作为定量限浓度，S/N≈3时的浓度作为检测限浓度。

照上述高效液相色谱检测的条件，精密量取各定量限溶液和检测限溶液各10μL，分别注入Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3，图谱见图6～7，图6为定量限溶液的典型HPLC色谱图，图7为检测限溶液的典型HPLC色谱图。

表3检测方法的定量限、检测限结果

由表3可以看出，检测限S/N＝6.8>3，检测限浓度为0.18μg/mL小于限度浓度的20％；六针定量限中最小S/N＝11.3，均大于10，定量限浓度为0.6μg/mL，小于浓度限度的30％，定量限连续六针RSD＝3.25％，小于6.0％，符合规定。说明书，本发明提供的检测方法灵敏度较高。

3、耐用性

溶剂：甲醇。

对照品贮备溶液：取2-氯-4-溴苯甲酰氯对照品3mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

加标供试品溶液：取达格列净SM-1200mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加所述对照品溶液溶解并定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液。

分别改变流速(±0.1mL/min)、流动相初始比例(±2％)、更换不同批次色谱柱。精密量取溶剂、对照品溶液和加标供试品溶液各10μL，注入Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见表4。

表4检测方法的耐用性结果

由表4可以看出，各耐用性条件下溶剂和供试品溶液不干扰2-氯-4-溴苯甲酰氯的检测；与正常条件下测得的2-氯-4-溴苯甲酰氯含量相比相对偏差均小于±5％，说明本发明提供的检测方法耐用性良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。