一种去甲斑蝥素的精制纯化方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种去甲斑蝥素的精制纯化方法。

背景技术

去甲斑蝥素，化学名为外式-7-氧杂双环[2,2,1]庚烷-2,3-二甲酸酐，是我国自主研发的抗肿瘤药物，于1989年投入生产。去甲斑蝥素通过抑制蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)调节肿瘤细胞的生长，临床上主要用于治疗原发性肝癌，对胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、皮肤癌等亦有一定疗效；突出特点是在抑制癌细胞DNA合成的同时，对骨髓细胞无抑制作用，并使白细胞升高。去甲斑蝥素(化合物1)是以呋喃(化合物2)与马来酸酐(化合物3)为起始原料，经Diels-Alder加成反应制得去氢去甲斑蝥素(化合物4)，再经催化氢化而得，合成路线如下式所示。其中，呋喃(化合物2)与马来酸酐(化合物3)在不同反应条件下加成，能够分别得到外型和内型产物。

按照上述路线合成去甲斑蝥素(化合物1)时，因Diels-Alder加成反应是可逆反应，原料呋喃(化合物2)与马来酸酐(化合物3)的物质的量比影响反应进行的程度，这两种原料的残留将影响催化氢化反应和终产品去甲斑蝥素的质量。现行的按照上述路线开展的生产工艺，通常使用丙酮作为第二步反应(即催化氢化)的溶媒，并使用冷的丙酮对该反应结晶的终产物进行洗涤，马来酸酐可以被分离干净，但是呋喃不能得到有效去除，所获得的去甲斑蝥素粗品中杂质呋喃的含量仍较高，一般为100～10000ppm。而呋喃是一种基因毒性物质，残留在去甲斑蝥素中，会对甲斑蝥素的质量造成极大影响。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种去甲斑蝥素的精制纯化方法。本发明提供的精制纯化方法能够将去甲斑蝥素产品中杂质呋喃的含量降低至10ppm以下，显著提高甲斑蝥素产品的HPLC纯度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种去甲斑蝥素的精制纯化方法，包括以下步骤：

将去甲斑蝥素粗品与第一纯化溶剂混合进行第一溶解，得到第一混合液；所述第一纯化溶剂由乙酸乙酯与正庚烷按体积比1:0.8～1.2混合而得；

将所述第一混合液与第二纯化溶剂混合进行第二溶解，得到第二混合液；所述第二纯化溶剂为正庚烷；所述第一溶解和第二溶解的温度分别为65～70℃；

将所述第二混合液降温至10～15℃进行析晶，经固液分离后，将所得结晶物依次进行洗涤和干燥，得到去甲斑蝥素精品；所述洗涤采用的洗涤试剂为所述第二纯化溶剂。

优选地，所述去甲斑蝥素粗品中呋喃的含量为100～10000ppm。

优选地，所述第一纯化溶剂与去甲斑蝥素粗品的质量比为1：0.1～0.2。

优选地，所述第一溶解的保温时间为20～40min。

优选地，所述去甲斑蝥素粗品的质量与第二纯化溶剂的体积之比为1kg：(0.8～1.2)L。

优选地，所述第二溶解的保温时间为20～50min。

优选地，所述析晶的时间为3～5h。

优选地，所述第一溶解、第二溶解和析晶均在搅拌的条件下进行。

优选地，所述结晶物与洗涤试剂的质量比为1:0.5～1；所述干燥为真空干燥，所述干燥的温度为50～60℃，真空度为-0.08～-0.09MPa，时间为5～7h。

优选地，所述固液分离后，还包括将所得液相进行蒸馏，分离得到乙酸乙酯与正庚烷。

本发明提供了一种去甲斑蝥素的精制纯化方法，包括以下步骤：将去甲斑蝥素粗品与第一纯化溶剂混合进行第一溶解，得到第一混合液；所述第一纯化溶剂由乙酸乙酯与正庚烷按体积比1:0.8～1.2混合而得；将所述第一混合液与第二纯化溶剂混合进行第二溶解，得到第二混合液；所述第二纯化溶剂为正庚烷；所述第一溶解和第二溶解的温度分别为65～70℃；将所述第二混合液降温至10～15℃进行析晶，经固液分离后，将所得结晶物依次进行洗涤和干燥，得到去甲斑蝥素精品；所述洗涤采用的洗涤试剂为所述第二纯化溶剂。本发明在加热条件下将去甲斑蝥素粗品依次采用所述第一纯化溶剂和第二纯化溶剂进行溶解，其中第一纯化溶剂的加入有利于粗品溶解，第二纯化溶剂的加入提高了正庚烷比例，有利于后续析晶；再通过降温析晶，对去甲斑蝥素粗品进行精制纯化。采用本发明提供的精制纯化方法能够高效地去除去甲斑蝥素粗品中的杂质呋喃，得到的去甲斑蝥素精品中杂质呋喃的含量在10ppm以下，去甲斑蟊素产品的HPLC纯度进一步提高，能够使HPLC纯度在99.80％以上，完全符合ICH-Q3A和ICH-M7的指导原则。并且，本发明提供的精制纯化方法操作简单，采用常规的生产设备即可完成。进一步地，本发明精制纯化所采用的纯化溶剂经蒸馏分离后可以重新用于生产，节能环保。

附图说明

图1是去甲斑蝥素粗品的色谱图；

图2是实施例1得到的去甲斑蝥素精品的色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种去甲斑蝥素的精制纯化方法，包括以下步骤：

将去甲斑蝥素粗品与第一纯化溶剂混合进行第一溶解，得到第一混合液；所述第一纯化溶剂由乙酸乙酯与正庚烷按体积比1:0.8～1.2混合而得；

将所述第一混合液与第二纯化溶剂混合进行第二溶解，得到第二混合液；所述第二纯化溶剂为正庚烷；所述第一溶解和第二溶解的温度分别为65～70℃；

将所述第二混合液降温至10～15℃进行析晶，经固液分离后，将所得结晶物依次进行洗涤和干燥，得到去甲斑蝥素精品；所述洗涤采用的洗涤试剂为所述第二纯化溶剂。

本发明将去甲斑蝥素粗品与第一纯化溶剂混合进行第一溶解，得到第一混合液。本发明对所述去甲斑蝥素粗品的来源没有特别的要求，本领域技术人员熟知的去甲斑蝥素粗品均适用于本发明，如市售去甲斑蝥素粗品；所述去甲斑蝥素粗品中呋喃的含量优选为100～10000ppm。在本发明中，所述第一纯化溶剂由乙酸乙酯与正庚烷按体积比1:0.8～1.2混合而得，所述乙酸乙酯与正庚烷的体积比优选为1:0.9～1。在本发明中，所述第一纯化溶剂与去甲斑蝥素粗品的质量比优选为1：0.1～0.2，更优选为1：0.11～0.17。在本发明中，所述第一溶解的温度为65～70℃，所述第一溶解的保温时间优选为20～40min，更优选为30min；所述第一溶解优选在搅拌的条件下进行。本发明优选在反应釜中依次加入所述第一纯化溶剂和去甲斑蝥素粗品，在搅拌条件下将所得混合体系加热升温至65～70℃，进行所述第一溶解。

得到第一混合液后，本发明将所述第一混合液与第二纯化溶剂混合进行第二溶解，得到第二混合液。在本发明中，所述第二纯化溶剂为正庚烷；所述去甲斑蝥素粗品的质量与第二纯化溶剂的体积之比优选为1kg：(0.8～1.2)L，更优选为1kg：1L。在本发明中，所述第二溶解的温度为65～70℃，所述第二溶解的时间优选为20～50min，更优选为30min；所述第二溶解优选在搅拌的条件下进行。本发明优选在所述第一混合液中缓慢加入第二纯化溶剂，在65～70℃下进行所述第二溶解；所述第二纯化溶剂优选在5～10min内加入完毕，所述第二溶解的保温时间以第二纯化溶剂加入完毕开始计算。

得到第二混合液中，本发明将所述第二混合液降温至10～15℃进行析晶，经固液分离后，将所得结晶物依次进行洗涤和干燥，得到去甲斑蝥素精品。在本发明中，所述析晶的时间优选为3～5h，更优选为4h；所述析晶优选在搅拌的条件下进行。在本发明中，所述固液分离的方式优选为抽滤，抽滤所得滤饼即为所述结晶物。所述固液分离后，本发明还优选将所得液相进行蒸馏，分离得到乙酸乙酯与正庚烷；本发明通过所述蒸馏即可实现纯化溶剂的回收再利用，节能环保。在本发明中，所述洗涤采用的洗涤试剂为所述第二纯化溶剂；所述结晶物与洗涤试剂的质量比优选为1:0.5～1，更优选为1:0.8～1，所述洗涤的方式优选为淋洗。本发明通过所述洗涤进一步除去呋喃、丙酮等杂质。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥，所述干燥的温度优选为50～60℃，真空度优选为-0.08～-0.09MPa，时间优选为6h。所述干燥后，还可以按照实际粒度需求将所得去甲斑蝥素精品进行粉碎。在本发明中，所述去甲斑蝥素精品中杂质呋喃的含量在10ppm以下，HPLC纯度在99.80％以上。

下面结合实施例对本发明提供的去甲斑蝥素的精制纯化方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

对去甲斑蝥素进行精制纯化，采用的第一纯化溶剂为乙酸乙酯40L(36kg)与正庚烷40L(27.3kg)混合而得，第二纯化溶剂为正庚烷；具体精制纯化步骤如下：

将第一纯化溶剂加入反应釜中，然后加入10kg去甲斑蝥素粗品，搅拌加热至65～70℃，保温搅拌30min，得到第一混合液；

在所述第一混合液中缓慢加入10L(6.8kg)第二纯化溶剂，保温搅拌30min，得到第二混合液；

关闭加热，将所述第二混合液搅拌析晶降温至15℃，结晶3h；然后抽滤，所得滤饼用0.5倍质量的第二纯化溶剂淋洗，之后在温度50～60℃、真空度-0.08～-0.09MPa条件下干燥6h，粉碎，得到去甲斑蝥素精品。

实施例2

对去甲斑蝥素进行精制纯化，采用的第一纯化溶剂为乙酸乙酯40L(36kg)与正庚烷48L(32.8kg)混合而得，第二纯化溶剂为正庚烷；具体精制纯化步骤如下：

将第一纯化溶剂加入反应釜中，然后加入7kg去甲斑蝥素粗品，搅拌加热至65～70℃，保温搅拌30min，得到第一混合液；

在所述第一混合液中缓慢加入7L(4.8kg)第二纯化溶剂，保温搅拌30min，得到第二混合液；

关闭加热，将所述第二混合液搅拌析晶降温至10℃，结晶5h；然后抽滤，所得滤饼用0.5倍质量的第二纯化溶剂淋洗，之后在温度50～60℃，真空度-0.08～-0.09MPa条件下干燥6h，粉碎，得到去甲斑蝥素精品。

实施例3

对去甲斑蝥素进行精制纯化，采用的第一纯化溶剂为乙酸乙酯40L(36kg)与正庚烷36L(24.6kg)混合而得，第二纯化溶剂为正庚烷；具体精制纯化步骤如下：

将第一纯化溶剂加入反应釜中，然后加入7kg去甲斑蝥素粗品，搅拌加热至65～70℃，保温搅拌30min，得到第一混合液；

在所述第一混合液中缓慢加入5.6L(3.8kg)第二纯化溶剂，保温搅拌30min，得到第二混合液；

关闭加热，将所述第二混合液搅拌析晶降温至10℃，结晶5h；然后抽滤，所得滤饼用1倍质量的第二纯化溶剂淋洗，之后在温度50～60℃、真空度-0.08～-0.09MPa条件下干燥6h，粉碎，得到去甲斑蝥素精品。

实施例4

对去甲斑蝥素进行精制纯化，采用的第一纯化溶剂为乙酸乙酯40L(36kg)与正庚烷32L(21.9kg)混合而得，第二纯化溶剂为正庚烷；具体精制纯化步骤如下：

将第一纯化溶剂加入反应釜中，然后加入11.5kg去甲斑蝥素粗品，搅拌加热至65～70℃，保温搅拌30min，得到第一混合液；

在所述第一混合液中缓慢加入13.8L(9.4kg)第二纯化溶剂，保温搅拌30min，得到第二混合液；

关闭加热，将所述第二混合液搅拌析晶降温至10℃，结晶4h；然后抽滤，所得滤饼用1倍质量的第二纯化溶剂淋洗，之后在温度50～60℃、真空度-0.08～-0.09MPa条件下干燥6h，粉碎，得去甲斑蝥素精品。

实施例5

对去甲斑蝥素进行精制纯化，采用的第一纯化溶剂为乙酸乙酯40L(36kg)和正庚烷32L(21.9kg)混合而得，采用的第二纯化溶剂为正庚烷；具体精制纯化步骤如下：

将第一纯化溶剂加入反应釜中，然后加入10kg去甲斑蝥素粗品，搅拌加热至65～70℃，保温搅拌30min，得到第一混合液；

在所述第一混合液中缓慢加入8L(5.5kg)第二纯化溶剂，保温搅拌30min，得到第二混合液；

关闭加热，将所述第二混合液搅拌析晶降温至10℃，结晶4h；然后抽滤，所得滤饼用1倍质量的第二纯化溶剂淋洗，之后在温度50～60℃、真空度-0.08～-0.09MPa条件下干燥6h，粉碎，得到去甲斑蝥素精品。

实施例6

对去甲斑蝥素进行精制纯化，采用的第一纯化溶剂为乙酸乙酯40L(36kg)与正庚烷48L(32.8kg)混合而得，采用的第二纯化溶剂为正庚烷；具体精制纯化步骤如下：

将第一纯化溶剂加入反应釜中，然后加入10kg去甲斑蝥素粗品，搅拌加热至65～70℃，保温搅拌30min，得到第一混合液；

在所述第一混合液中缓慢加入12L(8.2kg)第二纯化溶剂，保温搅拌30min，得到第二混合液；

关闭加热，将所述第二混合液搅拌析晶降温至10℃，结晶4h；然后抽滤，所得滤饼用0.8倍质量的第二纯化溶剂淋洗，之后在温度50～60℃、真空度-0.08～-0.09MPa条件下干燥6h，粉碎，得到去甲斑蝥素精品。

对实施例1～6中去甲斑蝥素精品的残留杂质进行色谱检测，色谱条件如下：色谱柱：DB-624，30m×0.32mm，0.8mm；升温程序：起始温度40℃，维持7min，以10℃/min升温至150℃，维持3min；进样口温度：200℃；检测器温度：250℃；平衡温度：90℃；平衡时间：30min。溶液配置具体为：供试品溶液：取去甲斑蝥素约0.2g，置顶空瓶中，精密加入DMF2mL，使溶解，密封；对照品溶液：取丙酮、呋喃、乙酸乙酯、正庚烷适量，用DMF定量稀释成每1mL各约含丙酮0.5mg、呋喃0.001mg、四氢呋喃0.072mg、乙酸乙酯0.5mg、正庚烷0.5mg的溶液，精密量取2mL，置顶空瓶中，密封。计算：外标法计算，丙酮、正庚烷、乙酸乙酯不得过0.5％，呋喃不得过10ppm，四氢呋喃不得过0.072％。将测试得到的各个实施例去甲斑蝥素精品的残留杂质情况列于表1：

表1各个实施例中去甲斑蝥素粗品和去甲斑蝥素精品的残留杂质

图1是去甲斑蝥素粗品的色谱图，图2是实施例1得到的去甲斑蝥素精品的色谱图。图1中呋喃、丙酮含量较高，呋喃含量超出要求限度，图2中呋喃含量明显降低，符合要求。

由以上实施例可以看出，采用本发明提供的精制纯化方法能够高效地去除去甲斑蝥素粗品中的杂质呋喃，得到的去甲斑蝥素精品中杂质呋喃的含量在10ppm以下，甲斑蟊素产品的HPLC纯度在99.80％以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。