金纳米颗粒联合石墨烯超材料芯片在制备检测ctDNA的试剂盒中的应用及方法和产品

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及金纳米颗粒联合石墨烯超材料芯片在制备检测ctDNA的试剂盒中的应用，还涉及检测ctD的方法和产品。

背景技术

循环肿瘤DNA(ctDNA)是一种从凋亡或坏死的肿瘤细胞中释放出来的特殊DNA片段。其在血浆中检测到的基因组改变，如碱基突变和异常的DNA甲基化，显示出与实体瘤的高度一致性，提示它可能作为一种非侵入性生物标志物在肿瘤早期诊断和进展监测中发挥作用。然而，外周血中ctDNA的低浓度和短半衰期为其精确检测带来了巨大的挑战。目前的ctDNA检测方法一般基于二代测序和基于PCR的检测方法，这些方法需要繁琐的流程、复杂的温度、控制和训练有素的操作人员。因此，亟待提出一种新的省时且易于操作的ctDNA检测方法。

太赫兹(THz)波是指频率在0.1和10THz之间的电磁波，核酸分子骨架之间的激发性内在共振正好位于这个范围内。基于这一特性，太赫兹光谱已被用来揭示DNA的分子构象信息，并实现了DNA定量及突变检测。由于核酸分子尺寸和太赫兹波长之间的尺寸不匹配，核酸的吸收截面非常小。因此，使用自由空间太赫兹光谱的核酸检测极限只能达到0.1纳克/微升，这很难满足其临床应用的要求。最近，太赫兹超材料在提高灵敏度方面受到了极大的关注，利用其对电磁场的局部增强和超材料表面的介电特性的超级敏感性，实现了核酸、农药和微生物的检测。

为了进一步提高太赫兹超材料的传感性能，最近已经探索了一些新的功能材料，如纳米材料、石墨烯和碳纳米管与太赫兹超材料的整合，以提高检测灵敏度。像金纳米粒子(AuNPs)这样折射率较大的物质可以比生物分子引起更大的太赫兹超材料的共振频率偏移。基于这一机制，AuNPs被用作信号放大器，与太赫兹超材料相结合，实现对蛋白质、DNA和细菌的高灵敏度检测。这种传感方法的特点是由一定量的沉积分析物引起的共振频率偏移，然而这一原理受限于太赫兹光谱仪的频率分辨率。一些研究将石墨烯与超材料结合起来，实现了对太赫兹波的调制，这使得石墨烯辅助的超材料有可能被用于传感。与传统的通过确定频率偏移的太赫兹超材料传感不同，石墨烯太赫兹超材料的共振透射率更容易受到其表面微量物质的掺杂影响，使其可以通过分析吸收变化而适用于超敏感的生物传感。到目前为止，纳米材料和石墨烯都被用来提高太赫兹超材料的检测灵敏度，但它们的组合使用还没有被研究过。研究它们对太赫兹超材料传感的协同效应并确定其基本机制是有意义的。

除了材料的改进，目标的放大也是提高检测灵敏度的另一种方式。在传统的扩增反应中，通过额外扩增目标的物理拷贝提高了灵敏度，但这种策略需要复杂的扩增反应系统，包含酶和盐离子，这可能不可避免地增加非特异性和假阳性信号。此外，酶驱动的扩增对实验条件提出了严格的要求，以保持最佳的酶活性。为了规避这些问题，本工作中采用了杂交链式反应(HCR)，因为它具有独特的优点，包括等温、无酶扩增、经济成本和操作简便。此外，HCR中的特异性发夹探针减少了复杂生物基质中成分的非特异性吸附，进一步确保了太赫兹反应对目标的特异性。

在此，本发明的目的在于提供一种用于外周血ctDNA检测的石墨烯增强型太赫兹超材料纳米生物传感器及其检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供金纳米颗粒联合石墨烯超材料芯片在制备检测ctDNA的试剂盒中的应用；本发明的目的之二在于提供利用金纳米颗粒联合石墨烯超材料芯片制备得试剂盒检测ctDNA的方法；本发明的目的之三在于提供基于利用金纳米颗粒联合石墨烯超材料芯片制备的检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、金纳米颗粒联合石墨烯超材料芯片在制备检测ctDNA的试剂盒中的应用，所述芯片由单层石墨烯转移至具有金属开口谐振环的基片结构上。

本发明优选的，所述具有金属开口谐振环的基片结构是以高阻硅为基片，采用光刻技术将金沉积在基片表面，形成中心呈“十”字开口的“田”字型金属开口谐振环，并且“十”字开口与田字中心角度交叉形成对称结构。

本发明优选的，所述金属开口谐振环的金属层厚度为100nm、区域面积为1×1cm。

本发明优选的，所述单层石墨烯是以铜箔为基底使用气相沉积法制备，在丙酮溶液中转移制备的单层石墨烯至金沉积的基片结构表面。

本发明优选的，所述金属开口谐振环呈阵列排布。

2、利用金纳米颗粒联合石墨烯超材料芯片制备得试剂盒检测ctDNA的方法，包括如下步骤：

(1)将待测样中加入可特异性捕获目标ctDNA的探针，然后加入触发杂交链式反应的发夹DNA，形成探针-ctDNA-HCR复合物反应液；所述探针一端修饰有活化后能与羧基磁珠相连氨基；发夹DNA为2个，且发夹上均修饰有生物素；

(2)向步骤(1)反应液中加入链霉亲和素修饰的金纳米颗粒，使链霉亲和素修饰的金纳米颗粒与探针-ctDNA-HCR复合物上生物素位点结合，反应后将反应产物清洗并重悬于去离子水中，加热使产物解链，磁珠分离保留上清；

(3)将步骤(2)的上清加入滴加在芯片检测区域上，烘干至除去样品中的水分，然后检测芯片THz透射谱，比较其谐振点透过率的相对变化值。

本发明优选的，所述目标ctDNA为KRAS G12D ctDNA。

本发明优选的，所述探针序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明优选的，所述发夹DNA的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3、基于利用金纳米颗粒联合石墨烯超材料芯片制备的检测试剂盒，所述试剂盒包括石墨烯联合太赫兹超材料制备的芯片，所述芯片由单层石墨烯转移至具有金属开口谐振环的基片结构上；

特异性捕获目标ctDNA的探针，所述探针一端修饰有活化后能与羧基磁珠相连氨基；

触发杂交链式反应的发夹DNA，所述发夹DNA为2个，且发夹上均修饰有生物素；

链霉亲和素修饰的金纳米颗粒；

和磁珠。

本发明的有益效果在于：本发明公开了石墨烯联合太赫兹超材料作为检测外周血ctDNA的芯片中的应用，由于ctDNA存在于外周血中，丰度低，半衰期短，可作为灵敏度高、特异性强的生物标志物，现有检测技术操作繁琐，价格昂贵，不易普及应用。本发明利用石墨烯费米能级可调谐和超材料局域电场增强的特性，通过将超材料技术、石墨烯技术及纳米材料技术整合。在传统超材料传感中，金纳米颗粒通过改变超材料表面介电常数引起太赫兹透射谱的谐振峰频移；而在石墨烯超材料中，金纳米颗粒与石墨烯作用使石墨烯费米能级发生改变，对谐振透过率的改变更为显著，这一改变与金纳米颗粒的沉积量相关。通过磁珠表面构建的杂交链式反应对目标ctDNA信号放大，同时加入链霉亲和素修饰的金纳米颗粒结合扩增产物上的生物素位点，最终通过磁分离去除磁珠和杂质，将最终得到的含扩增产物和金纳米颗粒的样本用于石墨烯超材料传感分析，通过谐振透过率的变化可以计算起始ctDNA的浓度。石墨烯超材料的测量值在1fM到10pM之间测结果与浓度的对数(lgC/fM)有良好的线性关系，y＝3.3096x+11.504，R

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为阵列式THz石墨烯超材料芯片实物图和结构图(A：实物图；B：结构图)；

图2为石墨烯增强型THz超材料生物传感器用于ctDNA检测原理图；

图3为ctDNA的THz光谱检测图(其中，Bare为空白石墨烯超材料芯片的THz光谱曲线；blank control为空白对照样本在石墨烯超材料芯片上的THz光谱曲线；HCR products为仅HCR产物样本在石墨烯超材料芯片上的THz光谱曲线；HCR-AuNP为HCR产物连接金纳米颗粒在石墨烯超材料芯片上的THz光谱曲线)。

图4为ctDNA在石墨烯超材料和无石墨烯超材料上的灵敏度检测柱状图。

图5为分别在普通超材料和石墨烯超材料表面沉积1ng至50ng金纳米颗粒的THz透射光谱。

图6为普通超材料和石墨烯超材料谐振点透过率与表面沉积金纳米质量的关系示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、一种阵列式石墨烯太赫兹超材料纳米生物传感器的构建

本实施例使用的THz石墨烯超材料芯片是采用高阻硅为基片，采用光刻技术将金沉积在基片表面，形成金属层厚度为100nm、区域面积为1×1cm呈中心呈“十”字开口的“田”字型金属开口谐振环，并且“十”字开口方向与田字中心十字等距交叉，形成对称结构，具体如图1所示。完全对称结构的金属开口谐振环具有的高介电敏感和局部等离子增强等电磁特性可以提高THz生物样本检测的灵敏度。

石墨烯采用以铜箔为基底的标准化学气相沉积法制备，在丙酮溶液中转移制备的单层石墨烯至金沉积的基片结构表面。石墨烯的质量通过拉曼光谱进行表征。

本研究所述THz石墨烯超材料芯片共包含了9个独立的阵列式方形检测区域，可同时实现9个样本的THz光谱检测。

实施例2、利用石墨烯增强型太赫兹超材料纳米生物传感装置检测外周血ctDNA

利用石墨烯增强型太赫兹超材料纳米生物传感装置检测外周血ctDNA，检测原理如图2所示，包括如下步骤：

(1)设计可特异性捕获目标ctDNA的探针，该探针一端修饰氨基，可与活化后的羧基磁珠相连，并与目标ctDNA一端互补。目标ctDNA的另一端可以与2个发夹DNA触发杂交链式反应(Hybridization chain reaction，HCR)，发夹上均修饰有生物素。以特异性检测KRAS G12D ctDNA为例，使用NUPACK在线软件设计上述探针，探针序列如表1所示：

表1、检测KRAS G12D ctDNA探针序列

(2)在目标ctDNA存在的条件下，可在磁珠表面形成“探针-ctDNA-HCR”复合物。加入链霉亲和素修饰的金纳米颗粒与HCR上的生物素位点结合。随后将反应产物清洗并重悬于去离子水中，于95℃加热15min，HCR产物解链，立即磁分离保留上清。

(3)将步骤(2)反应后的样品滴加在THz石墨烯超材料芯片检测区域上，50℃烘干样品5-10min，除去样品中的水分；

(4)获取滴加降本前石墨烯超材料芯片的THz透射谱，比较其谐振点透过率的相对变化值。

ctDNA的THz光谱检测结果如图3所示。结果显示，单纯HCR产物也引起石墨烯超材料谐振点的透过率减小，但是HCR-AuNP引起的透过率减小更为明显，这说明金纳米颗粒在石墨烯超材料上产生更显著的效应。

按照相同的方法，使用石墨烯超材料芯片检测不同浓度ctDNA(10aM–100pM)，结果如图4所示。结果显示，石墨烯超材料的测量值在1fM到10pM之间，测得结果与浓度的对数(lgC/fM)有良好的线性关系，y＝3.3096x+11.504，R

本发明中，待测生物样品包括患者外周血液ctDNA提取样本、健康血液ctDNA提取样本、人工合成ctDNA靶序列中的至少一种。

实施例3、金纳米颗粒对检测的影响

对两种超材料在梯度质量金纳米颗粒沉积下的透射光谱谐振峰对应的频率和透过率进行了比较分析，如图5。

为了有效地表示被测样品的信号响应，消除背景信号差异。我们使用谐振点透过率变化率来作为检测指标，如下：

其中，T

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。