检测ctDNA EGFR L858R的电化学生物传感器及制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测ctDNA EGFR L858R的电化学生物传感器及制备方法。

背景技术

液体活检作为非侵入的体外诊断测试，是检测肿瘤和癌症、辅助治疗的突破性技术。作为液体活检发展最为迅猛的标志物，ctDNA是肿瘤组织释放到人体血液系统中，携带自身基因的DNA片段。这些肿瘤DNA往往含有肿瘤基因组所特有的基因突变，能够真实反映实体瘤组织中的基因突发图谱频率，是治疗效果评价与治疗后临床随访的重要监测指标。目前大多数基因突变标准检测技术主要有：下一代测序(NGS)、带有识别特定癌症相关突变的探针的定量聚合酶链式反应(qPCR)和液滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)等。然而，这些传统技术存在着操作繁琐，成本高昂，处理时间长，灵敏度低、易受生物环境干扰等弊端，使其检测应用受到限制。因此，迫切需要构建简单、高效、高灵敏度、高选择性的检测方法来满足对ctDNA的检测要求，为将来现场检测提供可能。

表皮生长因子受体(EGFR)的突变是一种主要的ctDNA基因突变形式。超过80％的EGFR突变发生在外显子19-21，外显子21氨基酸替换(EGFR L858R)又占其中的41％。EGFR的表达突变常见于肝癌、非小细胞肺癌、胰腺癌，肠癌等，并与这些肿瘤的发生及发展相关，是临床诊断非小细胞肺癌等疾病有价值的生物标志物。检测EGFR缺失突变有助于直观了解非小细胞肺癌肿瘤基因突变状态，利于靶向治疗和疗效评估。目前EGFR基因突变检测常使用人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)和测序法。这些方法成本高昂，费事费力，灵敏度不高，不能做到即时检测。

为了解决以上问题，近年来逐渐发展出一些新兴技术，其中电化学生物传感器格外引人注意。电化学生物传感器是一种具有低成本，高灵敏度，快速信号读出和大浓度响应范围的生物传感器，作为一种有利的技术，电化学检测技术已用于检测和定量不同的分析物，成为生物传感器中应用最广泛的技术之一。

等温扩增技术可以提高电化学生物传感器检测的灵敏度，且由于是等温扩增、反应条件温和、仪器依赖性低，所以更适合即时检测。引物交换反应(PER)是2018年首次提出的一种稳健的扩增机制，即在Bst DNA聚合酶的作用下，单链引物在发夹模板上实现自主延伸，从而形成长的包含无数重复序列的单链DNA。由于只涉及一条单链引物和一个发夹，该反应具有设计简单，高特异性，反应条件温和的特点。

簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关核酸酶(Cas)起源于天然古菌和细菌的适应性免疫系统。CRISPR Cas14a系统可作为一种内切核酸酶，其在tracrRNA:crRNA的引导下，特异结合靶标单链DNA，并切割外源ssDNA，具有很高的特异性、敏感性和切割效率。Cas14a蛋白的分子量更小(62kDa)，对ssDNA序列具有更高的识别性和保真度，且不受靶序列中含有PAM位点的限制，这些有助于高保真分子检测平台的建立及拓展应用。我们选择ssDNA-MB作为电化学信号，通过Cas14a系统对电化学生物传感平台表面核酸的界面切割实现信号输出。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全可靠、实现对ctDNA EGFR L858R的快速、特异且高灵敏检测的检测ctDNA EGFR L858R的电化学生物传感器及制备方法。

本发明的技术解决方案是：

一种检测ctDNA EGFR L858R的电化学生物传感器，该传感器包括：基于PER-CRISPR Cas14a的信号放大体系，生物信号向电信号转化部分和电极部分。信号放大体系包括：靶标，发夹H1，发夹H2，清洁序列，Bst聚合酶，tracrRNA，crRNA，Cas14a蛋白；生物信号向电信号转化部分包括tracrRNA，crRNA，Cas14a蛋白；电极部分：金电极，ssDNA-MB，MCH。当测试溶液中存在单链靶标(ctDNA EGFR L858R)，发夹H1会被打开，靶标会与H1的环链相结合从而使H1的茎链暴露出来。H1的茎链与发夹H2的突出茎链互补结合。在Bst聚合酶的作用下，互补链发生延伸反应，当延伸到H2茎链末端时，在H2茎链末端处存在一个碱基对终止点(C-G)，会阻断延伸反应的继续。因为H2茎链之间的碱基结合力高于新合成的延伸链与H2茎链间的碱基结合力，延伸的引物可以自发地从H2上解离。而延伸引物因为序列的设计，与H2突出茎链是互补的，因此又可以继续与H2的突出茎链相互补结合，从而继续上述延伸反应和解离反应，从而使PER反应循环继续，只有当溶液中反应原料耗尽，PER反应才能停止。最终生成包含无数重复序列即激活剂(ATCTCTTATT)的反应产物。激活剂(ATCTCTTATT)存在时会与crRNA结合，激活Cas14a的反式切割活性。ssDNA-MB通过Au-S键固定修饰在金电极表面，MCH用于封闭金电极表面的非特异性位点。CRISPR Cas14a的反式切割活性被激活后，切割电极表面的ssDNA-MB，导致了电化学标签电子转移的发生，因此通过检测电极表面修饰的ssDNA-MB的电化学信号的变化情况达到对ctDNA EGFR L858R进行定量检测的目的。

进一步，所述靶标的核苷酸序列为：

5’-GATTTTGGGCGGGCCAAACTG-3’。

进一步，所述发夹H1的核苷酸序列为：

5’-AATAAGAGATCAGTTTGGCCCGCCCAAAATCATCTCTTAT T-3’。

进一步，所述发夹H2的核苷酸序列为：

5’-ATCTCTTATTGGGCCTTTTGGCCCAATAAGAGATAATAAG AGAT-3’。

进一步，所述清洁序列的核苷酸序列为：

5’-CCCCGAAAGTGGCCTCGGGCCTTTTGGCCCGAGGCCAC TTTCG-3’。

进一步，所述tracrRNA的核苷酸序列为：

5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGC UGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCU UGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGGAAUGCAAC-3’。

进一步，所述crRNA的核苷酸序列为：

5’-GAAUGAAGGAAUGCAACUAATAAGAGAT-3’。

进一步，所述荧光报告探针的核苷酸序列为：

5’-FAM-TTATTTTATT-BHQ1-3’。

进一步，所述ssDNA-MB的核苷酸序列为：

5’-SH-(CH

进一步，所述crRNA-激活剂的核苷酸序列为：

5’-ATCTCTTATT-3’。

进一步，工作电极为金电极。

进一步，还包括将银/氯化银电极作为参比电极和将铂丝作为对电极。

2.为实现上述目的，本发明第二方面提供一种制备第一方面所述的检测ctDNAEGFR L858R的电化学生物传感器的制备方法。

PER反应：实验前，发夹H1和发夹H2在DNA杂交缓冲液中，分别加热到95℃下退火5min，然后冷却到室温，稀释到1μM，备用作为传感的组装探针。随后，将靶标，H1(1μM)，H2(1μM)，清洁序列(1μM)，dNTP(1mM,N＝A,T,C)，Bst聚合酶(0.1U)，MgSO

CRISPR Cas14a反应：1μM Cas14a与1μM(tracrRNA:crRNA混合物)在DNA杂交缓冲液中37℃预孵育半小时，然后与激活剂溶剂或者PER最终反应物混合，反应溶液的总体积为20μL，反应在37℃连续振荡1h。

电极修饰及电化学测量：金圆盘电极(Φ＝2mm)是用0.3μm和0.05μm氧化铝悬浮液抛光，然后通过多步电化学清洗步骤(在0.5M氢氧化钠、0.5M H

PER反应和Cas14a的反式切割活性都有助于信号放大，两者相结合大大增强了所建立的电化学传感器的检测性能。可实现0.34fM的检测下限，动态检测范围可达到1fM-1μM。与现有技术相比，该反应的实现无需昂贵的仪器，灵敏度高，反应条件温和。

本发明将PER与CRISPR Cas14a结合构建电化学生物传感器平台，用于ctDNA EGFRL858R检测。当靶标存在的时候，可以打开发夹H1，进而打开发夹H2，在Bst聚合酶的作用下，PER在引物(H1的茎链)和发夹H2之间发生，从而产生含有激活剂(重复序列)的长链产物。激活剂进而通过与crRNA结合，激活Cas14a蛋白的核酸内切酶活性，非特异性的切割金电极表面修饰的ssDNA-MB，通过电化学物质在电极表面氧化还原信号的改变实现对靶标的定量分析。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是本发明用于ctDNA EGFR L858R检测的PER-CRISPR Cas14a电化学传感器的原理图。

图2是聚丙烯酰胺电泳(PAGE)证实了PER的可行性示意图。

图3是激活剂介导的CRISPR Cas14a反应的可行性验证示意图。

图中：(A)荧光光谱。(裂解时间:1h)(B)ACV反应。(C)CV反应。(D)EIS响应。

图4是PER介导CRISPR Cas14a反应的可行性验证示意图。

其中：(A)荧光光谱。(裂解时间:1h)(B)ACV反应。

图5是PER-CRISPR Cas14a电化学生物传感器的CV(A)和EIS(B)表征示意图。

表1PER反应,荧光实验和CRISPR Cas14a反应涉及到的序列。

表1

具体实施方式

1.PER反应：

实验前，发夹H1和发夹H2在DNA杂交缓冲液中，分别加热到95℃下退火5min，然后冷却到室温，稀释到1μM，备用作为传感的组装探针。随后，将靶标，H1(1μM)，H2(1μM)，清洁序列(1μM)，dNTP(1mM,N＝A,T,C)，Bst聚合酶(0.1U)，MgSO

2.CRISPR Cas14a反应：

1μM Cas14a与1μM(tracrRNA:crRNA混合物)在DNA杂交缓冲液中37℃预孵育半小时，然后与激活剂溶剂或者PER最终反应物混合，反应溶液的总体积为20μL，反应在37℃连续振荡1h。

3.电极修饰：

金圆盘电极(Φ＝2mm)是用0.3μm和0.05μm氧化铝悬浮液抛光，然后通过多步电化学清洗步骤(在0.5M氢氧化钠、0.5M H

清洗干净的金电极修饰上6μL 1μM ssDNA-MB，室温孵育1h。ssDNA-MB通过DNA固定缓冲液稀释，并且需要经过TCEP处理30min。随后，用缓冲液冲洗改性表面，然后用1mM MCH钝化20min。再用缓冲溶液冲洗电极。接着修饰6μL激活剂与CRISPR Cas14a的反应物或者6μL PER最终反应物与CRISPR Cas14a的反应物，在37℃下反应1h，反应结束后进行电化学测量。

4.验证靶序列触发PER的产生：

15％PAGE进行分析，每个样品5μL与6×上样缓冲液(1μL)混合。然后，将不同的混合物(6μL)注入到天然的聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(PAGE)中。使用上述制备的样品，在15％凝胶(30％聚丙烯酰胺，5×三硼酸盐缓冲液(TBE)，10％过硫酸铵(APS)，TEMED)中，在100V恒压下进行40min。凝胶用银染法染色20min，然后在凝胶成像系统上可视化。如图2所示。条带1，2，3，4分别对应于参加PER反应的4种成分(靶标，发夹H1，发夹H2，清洁序列)。因为各自的碱基数不同，他们的迁移速率各不相同。当靶标和H1共存时，靶标可以打开H1形成一条新的条带，碱基数高于靶标和H1，迁移速率慢于靶标和H1，溶液中还剩未反应的靶标和H1(条带5)。而当溶液中只存在H1和H2，靶标不存在时，PER反应不会产生，H1和H2可以稳定的共存在溶液中，不会互相发生反应而呈现出两个清晰分明的条带(条带6)。当靶标，H1和H2都存在时，PER反应可以发生，一条高相对分子质量的产物产生，溶液中还剩未反应的H1和H2(条带7)(图2)。因此，通过PAGE电泳证实PER反应的可行性。

5.验证CRISPR Cas14a反应的可行性：

荧光实验进行分析，将反应溶液(激活剂与CRISPR Cas14a的反应物或者PER最终反应物与CRISPR Cas14a的反应物)中加入5μL 1μM荧光报告探针(FAM-ssDNA)，加入DEPC水使最终体积为200μL。在激发波长为490nm的情况下，记录了510-600nm的发射光谱。此外，固定激发和发射荧光光谱的狭缝宽度为3nm。电化学测量：以crRNA-激活剂为启动子。在所有分子同时存在的情况下，激活剂的加入激活了Cas14a的侧枝切割活性，这反映在强荧光特征峰(图中的e曲线)上。如果缺少任何元素，Cas14a的反式切割活性就会被沉默，荧光报告探针不会被切割，均没有荧光信号(图中的a,b,c,d曲线)(Fig.3A)。接着使用电化学测量技术验证CRISPR Cas14a作用的可行性。使用ACV电流信号来估计MB的电流信号。修饰有MCH的金电极的ACV响应没有任何峰值(a曲线)，当ssDNA-MB修饰后，明显呈现一个尖锐的MB高氧化特色峰(-0.3到-0.2V)(b曲线)，但当激活剂介导CRISPR Cas14a的作用后，导致电极上ssDNA-MB的降解和电流信号的显著下降(c曲线)(Fig.3B)。经CRISPR Cas14a反应处理得到的峰的强度值比未经CRISPR Cas14a反应处理的结果降低，证实了CRISPR Cas14a反应的可行性。

6.验证电极修饰成功

使用CV和EIS对激活剂介导CRISPR Cas14a的作用的电化学过程进行了表征。电化学测量使用三电极体系，以金电极为工作电极，以Ag/AgCl(3M KCl)为参比电极，以铂丝为对电极。CV在1M KCl+10mM K

如图3C所示，裸露的金电极呈现出尖锐的对称氧化还原峰(a曲线)，反映了良好的电化学导电性。将ssDNA-MB固定在裸露的金电极表面后，电流显著降低(b曲线)。这一现象可以解释为DNA有一个带负电荷的骨架，与带负电荷的氧化还原探针相互排斥，从而增加了探针在电化学反应中的电子转移距离。MCH的修饰进一步降低了电流，因为致密的自组装层阻碍了表面的电子转移(c曲线)。在激活剂介导CRISPR Cas14a的作用的存在下，Cas14a单链DNA酶活性被激活，将ssDNA-MB从金电极表面切割下来。因此，电流增加(d曲线)。这些结果与EIS获得的结果一致。(Fig.3D)这证明ssDNA-MB在传感器表面的成功组装和激活剂诱导的成功切割作用。

7.验证PER介导CRISPR Cas14a的切割作用：

当引入靶标(ctDNA EGFR L858R)诱导产生的PER产物后，CRISPR Cas14a的侧链切割活性被启动，可以切割溶液中的外源链荧光报告探针，从而产生高强度的荧光(e曲线)。但当靶标不存在时，CRISPR Cas14a的侧链切割活性被抑制，没有荧光产生(b曲线)。缺失其他的成分(荧光报告探针，tracrRNA:crRNA，Cas14a)，结果也是一样(a,c,d曲线)。结果显示，每一种组成部分对于PER-CRISPR Cas14a作用成功产生的重要作用(Fig.4A)。这些结果与ACV响应获得的结果一致(Fig.4B)。只有当靶标诱导PER成功发生，才会介导CRISPRCas14a切割电极表面修饰的ssDNA-MB。电流的显著下降证实了PER-CRISPR Cas14a电化学生物传感器的成功构建(e曲线)，而当反应成分缺少时，电流不会下降。这证明靶向诱导的成功切割作用。

8.电化学检测：

CV和EIS被用来同时监测PER-CRISPR Cas14a电化学生物传感器的构建。如图5A所示，裸金电极呈现出一个尖锐的对称氧化还原峰，显示出裸金电极的优异导电性(a曲线)。当ssDNA-MB修饰上电极后，电流降低，这是因为ssDNA-MB中带负电荷的磷酸骨架促进了K