人BUB1基因在制备抗肿瘤药物中的用途
文献发布时间:2024-04-18 19:54:45
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及人BUB1基因在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
胆管癌(CCA)属于胆管上皮的高浸润癌,死亡率高,因缺乏临床症,CCA在早期阶段不容易诊断。CCA患者占肝胆癌的10-20%,近年来,CCA的发病率和死亡率正在迅速增加。目前,CCA尚无临床治疗方法,切除术是长期生存的唯一可能性。但CCA患者的5年生存率仅为10%,因此迫切需要确定CCA的新疗法。
BUB1属于丝氨酸/苏氨酸激酶,在染色体分离、KT-MT相互作用和SAC功能方面中具有多种功能。
目前,未见关于BUB1基因在制备抗胆管癌药物中的用途的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供人BUB1基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:(论述独权及从权技术方案)
抑制人BUB1基因的shRNA在制备抗肿瘤药物中的用途。
抑制人BUB1基因的shRNA在制备抗胆管癌药物中的用途。
以上用途中,所述shRNA序列为:
ShRNA1-F:5’-GATCCGTCCTTCAGATGCTTGAAGCCTTCAAGAGAGGCTTCAAGCATCTGAAGGACTTTTTG-3’;
ShRNA1-R:5’-AATTCAAAAAGTCCTTCAGATGCTTGAAGCCTCTCTTGAAGGCTTCAAGCATCTGAAGGACG-3’;
或
ShRNA2-F:5’-GATCCGATGCTTGAAGCCCACATGCATTCAAGAGATGCATGTGGGCTTCAAGCATCTTTTTG-3’;
ShRNA2-R:5’-AATTCAAAAAGATGCTTGAAGCCCACATGCATCTCTTGAATGCATGTGGGCTTCAAGCATCG-3’;
或
ShRNA3-F:5’-GATCCGCAGAGCTACAAGGGCAATGATTCAAGAGATCATTGCCCTTGTAGCTCTGCTTTTTG-3’;
ShRNA3-R:5’-AATTCAAAAAGCAGAGCTACAAGGGCAATGATCTCTTGAATCATTGCCCTTGTAGCTCTGCG-3’。
本发明还涉及抗胆管癌药物的制备方法,包括以下步骤,从Genbank中调取人BUB1基因序列;预测多个shRNA靶点;
筛选shRNA靶点,在所选shRNA靶点序列中添加环状序列,得到针对BUB1基因的有效的shRNA序列;
根据shRNA序列,设计并合成两端含酶切位点的双链DNA寡核苷酸序列;
慢病毒载体双酶切后与双链DNA双链DNA寡核苷酸序列连接,构建表达BUB1基因shRNA序列的RNAi穿梭质粒;
将RNAi穿梭质粒转化至感受态细胞,进行克隆;
将RNAi穿梭质粒和慢病毒包装需要的辅助载体共转染人胚肾细胞293T,产生重组慢病毒颗粒。
以上抗胆管癌药物的制备方法中,所述慢病毒载体选自pLVX-shRNA2-Puro。
本发明的有益效果在于:本发明通过构建了人BUB1基因小分子干扰RNA、人BUB1基因干扰核酸构建体、人BUB1基因干扰慢病毒并公开了它们在制备抗肿瘤药物的用途。提供shRNA或者包含该shRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人基因的表达,尤其是慢病毒,能够高效侵染靶细胞,高效率地抑制靶细胞中基因的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞凋亡,在肿瘤治疗中具有重要意义。
附图说明
图1为人胆管癌细胞RBE在制得的慢病毒感染下BUB1表达水平变化图;
图2为人胆管癌细胞HuCC-T1在制得的慢病毒感染下BUB1表达水平变化图;
图3为人胆管癌细胞RBE在制得的慢病毒感染下的细胞增殖能力变化图;
图4为人胆管癌细胞HuCC-T1在制得的慢病毒感染下的细胞增殖能力变化图;
图5为人胆管癌细胞RBE在制得的慢病毒感染下的细胞凋亡水平变化图;
图6为人胆管癌细胞HuCC-T1在制得的慢病毒感染下的细胞凋亡水平变化图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式并配合附图予以说明。
研究发现BUB1可磷酸化Cdc20和组蛋白H2A,导致人细胞中的活性转录;BUB1突变可导致小鼠染色体分离错误和非整倍性增加;BUB1过表达可驱动转基因小鼠自发性肿瘤发生并加速Myc诱导的淋巴瘤发展。BUB1的过表达与几种人类癌症的发生和进展密切相关,包括乳腺癌、前列腺癌和肝细胞癌,以及淋巴瘤和卵巢癌,这是因为BUB1过表达导致Aurora-B过度激活可使得染色体错编,从而诱导肿瘤形成。并且BUB1在基底样乳腺癌中表达上调,是维持乳腺癌细胞系中癌症干细胞更新所必需的。BUB1已成为肿瘤治疗靶点,但是关于BUB1在胆管癌中的效果尚不清楚。
慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种,采用慢病毒介导的shRNA能够整合基因组,当发生转录之后,shRNA被输出到细胞质中并被内源性酶Dicer识别,shRNA加工成双链siRNA,然后siRNA与目的基因mRNAs结合,与RNA诱导沉默复合物形成,从而降解目的基因mRNAs发挥RNA干扰效应。与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比,Lentivirus-shRNA一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。
本发明揭示了人BUB1基因的用途及其相关药物,为人BUB1基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中提供新用途。同时通过构建了人BUB1基因小分子干扰RNA、人BUB1基因干扰核酸构建体、人BUB1基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的shRNA或者包含该shRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人BUB1基因的表达,尤其是慢病毒,能够高效侵染靶细胞,高效率地抑制靶细胞中BUB1基因的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞凋亡,在肿瘤治疗中具有重要意义。
本发明以RNA干扰为手段,研究了BUB1基因在肿瘤发生和发展中的作用,公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法,该方法包括:向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制BUB1基因的转录或翻译,或能够特异性抑制BUB1蛋白的表达或活性的分子,以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。所述肿瘤细胞选自胆管癌之任一。
实施例1
抗胆管癌药物的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:从Genbank中调取人BUB1基因序列;预测多个shRNA靶点;
登录美国国立生物信息中心(NCBI)查询人BUB1(NM_004336.5)的碱基序列,利用BLOCK-iT
表1
步骤2:筛选shRNA靶点,在所选shRNA靶点序列中添加环状序列,TTTTT+酶切位点等,得到针对BUB1基因的有效的shRNA序列;
步骤3:根据shRNA序列,设计并合成两端含酶切位点的双链DNA寡核苷酸序列;
具体的,从表1中筛选3条Rank分值较大(NO.1、NO.2、NO.3)的序列进行shRNA序列设计,添加TTCAAGAGA(环状结构)、TTTTT+酶切位点,并且设计互补的反义寡核苷酸链,退火合成两端含酶切位点的双链DNA寡核苷酸序列,如表2所示:
表2
其中,合成两端含酶切位点的双链DNA寡核苷酸序列包括将单链的shRNA上下游片段进行退火,形成双链DNA片段。
退火反应体系如表3所示:
表3
步骤4:慢病毒载体双酶切后与双链DNA寡核苷酸序列连接,构建表达BUB1基因shRNA序列的RNAi穿梭质粒;
具体的,慢病毒载体选自pLVX-shRNA2-Puro载体,pLVX-shRNA2-Puro载体的酶切体系如表4所示:
表4
pLVX-shRNA2-Puro载体酶切条件:37℃,2-3h;通过琼脂糖凝胶鉴定,切胶回收;
将pLVX-shRNA2-Puro载体与上述双链DNA寡核苷酸序列通过酶切位点相连,由于shRNA片段已带有酶切后的粘性末端,故可直接与酶切后的载体进行连接。
酶切后的载体和基因连接体系如表5所示。
表5
步骤5:将RNAi穿梭质粒转化至感受态细胞,进行克隆;
具体的,将连接的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞Stbl3中。
具体操作如下:
1)将感受态细胞Stbl3(100μL)从-80℃冰箱取出,迅速放入冰上,静置5min融化,分装成2管,各50μL;
2)加入1μL重组质粒(DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng的cccDNA即可使50μL的感受态细胞达到饱和),轻轻震荡混匀,再置于冰上冰浴30min;
3)将上述混合物置42℃水浴锅内水浴90s进行热休克,迅速转移到冰上,开始计时放置3min;
4)加入无抗性LB液体培养基900μL,恒温摇床温度设定37℃,转速200r/min,培养1h;
5)取5块已铺好固体LB-AMP的培养皿,取100μL悬浮的菌液用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀涂布,37℃,恒温培养箱内倒置培养15h,40μl;
6)挑取单个菌落接种于15mL(小提)含氨苄抗性LB液体培养基,恒温摇床温度设定37℃,转速180r/min,培养过夜;
7)菌液测序:测序结果采用DNAMAN进行比对。
8)质粒小抽:将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃培养过夜,用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提,抽提合格的质粒进入下游流程。
步骤6:将RNAi穿梭质粒和慢病毒包装需要的辅助载体共转染人胚肾细胞293T,产生重组慢病毒颗粒。
具体的,BUB1-shRNA干扰慢病毒包装程序如下:
293T细胞种于10cm-dish中,种板密度为第二天转染前细胞密度达到80%左右,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养。采用第三代慢病毒包装系统(辅助质粒:MDLg/pRRE,pRSV-Rev,pMD2.G)进行慢病毒包装,按照Lipofectamine3000说明书进行操作将下述质粒混合液加入293T细胞培养皿中,分别于48小时和72小时收集含慢病毒的细胞上清。质粒共转体系如表6所示:
混合两次次收集的细胞上清液于4℃,3000g条件下离心25min,使细胞碎屑沉淀,0.45μm微孔滤膜过滤上清液于超速离心管中,100000g离心120min。倒掉上清液,用1mlPBS溶液充分溶解管底病毒,枪头吹打数次,分装后迅速放置于-80℃冰箱长期保存,以此作为制备抗肿瘤药物的用途,特别是作为制备抗胆管癌药物中的用途。
实验例1
Q-PCR检测人胆管癌细胞BUB1基因干扰效率;
稳定低表达的细胞株建立:RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞接种于6孔板中。待细胞密度达到60%时,使用预实验确定的慢病毒感染MOI及最佳感染条件进行正式感染实验,细胞感染3-4天后,使用NucleoZol试剂提取细胞总RNA,使用Promega反转录试剂盒将1μgRNA反转录为cDNA,按GoTaq
以上涉及的反转录体系如下:
第一阶段:将总RNA变性解链;体系如表7所示:
表7
按上面所写添加试剂,微离心10s混匀,70℃水浴5min后立即冰浴5min;
第二阶段:逆转录反应;体系如表8所示;
表8
按上面所写添加试剂,微离心10s混匀,25℃5min,42℃60min;70℃15min。
real-timePCR反应体系如表9所示;
表9
qPCR程序设置如表10所示;
表10
参照图1以及图2,实验结果表明,与阴性干扰组对比,RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞中BUB1表达水平分别下调了。
实验例2
CCK-8法检测对照组和sh-BUB1干扰组人胆管癌细胞的增殖情况;
不同组的RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞培养24h后经胰酶消化收获细胞,以4*10
,参照图3以及图4,实验结果显示,与对照组相比,干扰组的RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞的增殖能力减弱。
实验例3
流式细胞术检测对照组和sh-BUB1干扰组人胆管癌细胞的凋亡情况;
不同组的RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞经胰酶消化后收集细胞,用4℃预冷的PBS洗细胞两次,用250μL结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为1×10
参照图5至图6,实验结果显示,干扰组的RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞的凋亡水平显著高于对照组。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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