一种栎树猝死病菌的特异性检测靶标Pr52094及其应用

技术领域

本发明属于栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)检测技术领域，具体一种栎树猝死病菌(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr52094及应用。

背景技术

栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)，病害主要导致枝干患病，因此也称枝干疫霉，是导致栎树猝死病的罪魁祸首。作为一种危害性极大的森林和观赏性植物卵菌病害的病原，只要该病菌入侵并定殖，截止目前国际上没有有效的根除方法。栎树猝死病菌具有在不同的寄主植物上也会表现出不一样的病症的特点，常见患病植株特点是叶片枯死和枝干溃疡。该病菌能够产生不同类型的游动孢子，其孢子抗性强，存活时间长，可以在寄主植物或是土壤中存活。具有这一特性，让其传播方式的多样。近距离主要是通过雨、水、灌溉等方式传播感染寄主植物；而远距离最普遍的就是由口岸患病苗木运输入侵感染健康寄主植物。

该病原菌是一种非常危险的检疫性菌物，欧洲植物保护组织EPPO已经将其列为A2名单。据数据统计，加利福尼亚州因该病菌损失惨重，金额高达百亿美元。2009年，该病害入侵英格兰西南部、北爱尔兰及威尔士地区落叶松，结果导致约两百万株落叶松病死，不得不砍伐掉，给当地的经济及生态系统造成巨大的损害。诸如此类的案例数不胜数。该病害一旦入侵，后果不可估量。寄主植物分布也非常广泛，多为阔叶树种。主要涉及有松科(Pinaceae)、壳斗科(Fagaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、报春花科(Primulaceae)忍冬科(Caprifoliaceae)、杉科(Taxodiaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、木犀科(Oleaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、红豆杉科(Taxaceae)及樟科(Lauraceae)等50多科，110属，150多种。目前，该病害在北美洲及欧洲国家等地区广泛分布，我国尚未有分布记录。该病原菌的研究处于起步阶段，为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低橡树疫病引起的损失。

目前栎树猝死病菌(P.ramorum)检测的主要方法有：形态学鉴定、普通PCR检测法、Real-time PCR检测法、杂交阵列技术(DNA microarra y and macro array)和环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal am plification，LAMP)。但这些诊断方法或程序繁琐、周期长，或成本高，或需要使用昂贵的仪器和试剂等。同时，不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。发掘特异性好的靶基因是目前所有检测技术的核心。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确、高通量的RPA-LFD检测技术体系对提升对栎树猝死病菌的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

发明内容

针对现有技术中栎树猝死病菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种新的栎树猝死病菌的检测靶标Pr52094及其靶标建立的RPA-LFD检测引物组合物。本发明另一目的是提供上述栎树猝死病菌菌的RPA-LFD检测方法。本发明建立的快速检测栎树猝死病菌的方法，通过特异性和灵敏度评价，可用于实际样品的检测，为栎树猝死病菌的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

第一方面，本发明提供了栎树猝死病菌(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr52094，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

TTCAAACTGACAACCGATGCTTCGAAGGTTGGACTTGGTGCTGTGCTTTCGCAAGACCAAGGTGGTGGCGATCAACCAGTTGCGTACGCCTCAAAAGTGAACAGTCCGACAGTGAGCAACTATAGTATCTCCGAGCTCGAGTGTCTCGCGGTCGTGTGGGCCGTACGACTCTTTCGACCGCATCTCTATGGGCGTAAATTCACCATTGTGACTGATCACATAGCCTTAAAGTGGCTGATGACAGCCAAGGAGCCTGCAGGACGTTTGCACAGATGGGCCTTGACTCTCCAAGAGTACGATTTTGATATCCAGTACAGGCCTGGTAGAGAAAACTATGTGGCGGATGCCTTGTCGCGA(SEQ ID NO:1)

第二方面，本发明提供了栎树猝死病菌(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr52094，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。

FKLTTDASKVGLGAVLSQDQGGGDQPVAYASKVNSPTVSNYSISELE CLAVVWAVRLFRPHLYGRKFTIVTDHIALKWLMTAKEPAGRLHRWALTL QEYDFDIQYRPGRENYVADALSR(SEQ ID NO:2)

第三方面，本发明提供了检测靶标Pr52094在检测栎树猝死病菌(P.ramorum)中的应用。

第四方面，本发明提供了栎树猝死病菌(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr52094的检测引物及探针组合，所述检测引物中，正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述探针序列如SEQ ID NO：5所示。

第五方面，本发明提供了检测引物和探针组合在检测栎树猝死病菌(P.ramorum)中的应用。

第六方面，本发明提供了一种检测栎树猝死病菌(P.ramorum)的试剂盒，至少包括1次用量以上的所述的检测引物(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)和探针(SEQ ID NO:5)组合。

进一步地，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的反应单元管、缓冲液Buffer、启动剂、去离子水、侧流层析试纸条。

第七方面，本发明提供了所述试剂盒在检测栎树猝死病菌(P.ramorum)中的应用。

第八方面，本发明提供了一种检测栎树猝死病菌(P.ramorum)的方法，包括以下步骤

1)提取待测样本DNA；

2)以DNA为模板，利用所述的引物(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)和探针(SEQ IDNO:5)组合或所述的检测栎树猝死病菌(P.ramorum)的试剂盒进行RPA扩增；

其中，所述RPA扩增：向装有冻干酶粉的0.2mL乐尚生物(Lesunbio)反应单元管中加入25μL缓冲液Buffer，10μM的正向引物(SEQ ID NO:3)2.1μL，10μM的反向引物(SEQ IDNO:4)2.1μL，，10μM的探针(SEQ ID NO:5)0.6μL，模板DNA2.0μL，在反应管盖上加入3μL启动剂，无菌ddH

3)应用侧流层析试纸条进行RPA扩增产物检测；

在准备好相应数量的1.5mL EP管，取10μL扩增后的产物并加入190μL的无菌ddH

当试纸条出现两条带，一条蓝色位于质控区内，一条红色位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有栎树猝死病菌(P.ramorum)；当试纸条只有质控区出现一条蓝色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有栎树猝死病菌(P.ramorum)。

与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时要避免引物内部自连形成的发夹、引物之间及其与探针之间高度错配形成的二聚体，引物的设计对RPA的结果至关重要。但是核苷酸长度的增加会发夹和二聚体的产生，进而增加了引物设计的难度。而RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物，采用普通PCR进行筛选才能得到最佳引物。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)本发明提供了一个新的栎树猝死病菌(P.ramorum)高信赖度特异性分子检测靶标Pr52094并基于新靶标建立特异、灵敏、准确的RPA-LFD检测技术体系，为栎树猝死病菌的检测提供了新的检测靶标的发掘方法和技术平台，可用于栎树猝死病菌的高灵敏度快速检测。

2)特异性好且灵敏度高：本发明的方法与常规PCR相比，栎树猝死病菌(P.ramorum)通过与其他卵菌和病原真菌做特异性分析，均没有发生交叉反应，说明了建立的RPA-LFD体系特异性良好。RPA-LFD检测体系的最低检测浓度为10pg/μL，而普通PCR只能检测到100pg/μL的DNA浓度，由此可看出RPA检测方法灵敏度高于普通PCR。

3)操作简便、耗时短：本发明检测速度快，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的最适温度在25℃-40℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。这样就实现了恒温扩增，只要有稳定的热源RPA反应就可以发生，极大的扩展了RPA使用的范围，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。同时，本发明可以用于带菌植株组织中栎树猝死病菌(P.ramorum)的快速检测，反应时间仅需20min，总耗时只需约0.5h即可检测到结果，是一种快速检测栎树猝死病菌的有效手段。

综上所述，本发明一种基于RPA-LFD的栎树猝死病菌(P.ramorum)的新靶标Pr52094检测方法，本发明检测方法在25℃-40℃恒温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到栎树猝死病菌，不需要复杂仪器，能较好满足对栎树猝死病菌的现场检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr45082的普通P CR琼脂凝胶电泳特异性检测结果图。

图2是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr45082的普通P CR琼脂凝胶电泳灵敏度检测结果图。

图3是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的普通P CR琼脂凝胶电泳特异性检测结果图。图A基于栎树猝死病菌检测靶标Pr52094在不同疫霉种间特异性检测结果图；B:基于栎树猝死病菌检测靶标Pr52094在另外6种不同疫霉种间特异性检测结果图。

图4是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的普通P CR琼脂凝胶电泳灵敏度检测结果图。

图5是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)部分非特异靶标的普通PCR琼脂凝胶电泳特异性检测结果图。图5A基于栎树猝死病菌检测靶标Pr42863特异性检测结果图；图5B基于栎树猝死病菌检测靶标Pr45451特异性检测结果图；图5C基于栎树猝死病菌检测靶标Pr46611特异性检测结果图；

图5D基于栎树猝死病菌检测靶标Pr47411特异性检测结果图；图5E基于栎树猝死病菌检测靶标Pr48826特异性检测结果图；图5F基于栎树猝死病菌检测靶标Pr52452特异性检测结果图。

图6是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的RPA-LFD侧流层析试纸条最佳反应时间检测结果图。

图7是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的RPA-LFD侧流层析试纸条最佳反应温度检测结果图。

图8是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的RPA-LFD侧流层析试纸条种间特异性检测结果图

图9是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的RPA-LFD的侧流层析试纸条在属间特异性检测结果。

图10是基于栎树猝死病菌新检测靶标Pr52094的RPA-LFD侧流层析试纸条检测栎树猝死病菌(P.ramorum)灵敏度试验结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

通过全基因组序列比对获得了1000多个栎树猝死病菌(P.ramorum)特异性基因中随机挑选20个靶标且每个靶标设计2对正反向引物，靶标基因及引物序列见表1。通过普通PCR检测方法发掘出高信赖度特异性和灵敏性分子检测靶标Pr52094，其DNA序列如SEQ IDNO：1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

表1引物序列

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并基于该新靶标建立特异、灵敏、准确的RPA-LFD检测技术体系。该RPA-LFD检测技术体系所使用的RPA-LFD检测引物组合物：由正向引物PrRPA-F(SEQ ID NO：3)、反向引物PrRPA-R(SEQ ID NO:4)和探针PrRPA-Probe(SEQ ID NO：5)组成；各引物及探针序列具体如下：

PrRPA-F：5'-CAGTCCGACAGTGAGCAACTATAGTATCTCCGAG-3'(SEQ ID NO：3)；

PrRPA-R：5'-CGTACTCTTGGAGAGTCAAGGCCCATCTGTG-3'(SEQ ID NO：4)，5’端连接Biotin修饰；

PrRPA-Probe：5'-CTTTCGACCGCATCTCTATGGGCGTAAATTCCCATTGTGACTGATC-3'(SEQID NO：5)，5’端连接FAM修饰，3’端连接C3spcer修饰，其中31位碱基进行THF修饰。

采用该引物组合物检测栎树猝死病菌(P.ramorum)的方法：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的RPA-LFD引物组合物进行RPA-LFD；

样品检测：向装有冻干酶粉的0.2mL乐尚生物(Lesunbio)反应单元管中加入25μL缓冲液Buffer，10μM的正向引物(SEQ ID NO:3)2.1μL，10μM的反向引物(SEQ ID NO:4)2.1μL，10μM的探针(SEQ ID NO:5)0.6μL，模板DNA2.0μL，在反应管盖上加入3μL启动剂，无菌ddH

其中，所述RPA引物长度一般为30至35个核苷酸。引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而会增加形成二级结构的可能性。此外，引物设计时应尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。扩增产物大小在200-300bp较好，不超过500bp。

空白对照：操作步骤同样品检测，将2.0μL模板DNA改为加入2.0μL灭菌ddH

以靶标Pr45082为例。正向引物序列Pr45082F1：CTCAACAGTCCAC TGCGAGA(SEQ IDNO:6)，反向引物序列Pr45082R1：GTCGCACCG CACAGCTTGAT(SEQ ID NO:7)。以表2中供试菌株的基因组DNA为模板，选取栗黑水疫霉Phytophthora cambivora、樟疫霉Phytophthoracinn amomi、烟草疫霉Phytophthora nicotianae、柑橘褐腐疫霉Phytophthora citrophthora、冬生疫霉Phytophthora hibernalis、荔枝疫霉Phytophthora litchi i、疫霉Phytophthora pini、Phytophthora hydrogena、寄生疫霉Phytophthor a parasitica掘氏疫霉Phytophthora drechsleri、隐地疫霉Phytophthora cryp togea、丁香疫霉Phytophthora syringae作为阴性对照，ddH

以靶标Pr52094为例。正向引物序列Pr52094F2：AGTGAACAGTCC GACAGTGA(SEQ IDNO:8)，反向引物序列Pr52094R2：AGGCATCC GCCACATAGTTT(SEQ ID NO:9)。以表2中供试菌株的基因组DNA为模板，选取栗黑水疫霉Phytophthora cambivora、樟疫霉Phytophthoracinn amomi、烟草疫霉Phytophthora nicotianae、柑橘褐腐疫霉Phytophthora citrophthora、冬生疫霉Phytophthora hibernalis、荔枝疫霉Phytophthora litchi i、疫霉Phytophthora pini、Phytophthora hydrogena、寄生疫霉Phytophthor a parasitica掘氏疫霉Phytophthora drechsleri、隐地疫霉Phytophthora cryp togea、丁香疫霉Phytophthora syringae作为阴性对照，ddH

上述结果表明，通过普通PCR检测方法共筛选出两个具有高度特异性新标靶Pr45082和Pr52094，其中新标靶Pr45082的灵敏度只有10ng/μL，而新靶标Pr52094的灵敏度可达到100pg/μL。基于分子标靶的高度特异性及灵敏度的考虑最终确定Pr52094作为栎树猝死病菌的新靶标，设计RPA引物、探针组合建立RPA-LFD检测技术。其正向引物序列如SEQID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，探针序列如SEQ ID NO：5所示。

实施例2

为了探索RPA-LFD检测体系的最佳反应条件，以100ng/μL的栎树猝死病菌基因组DNA为模板，反应体系同实施案例1。反应时间的优化：在反应温度39℃条件下，将孵育时间设置为10min、15min、20min、25mi n、30min。反应温度的优化：在上述确定的最佳反应时间条件下，孵育温度分别设置为31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃。上述反应需要有ddH

实施例3

为了验证RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性，以栎树猝死病菌(P.ramorum)菌株和其它疫霉以及病原菌为供试材料(表2)，RPA侧流层析试纸条检测方法的结果显示栎树猝死病菌(P.ramorum)的试纸条出现一条红色条带位于检测区，一条蓝色位于质控区，则结果为阳性，表明样本中含有栎树猝死病菌(P.ramorum)；当试纸条质控区有一条蓝色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有栎树猝死病菌(P.ra morum)。

选取栗黑水疫霉P.cambivora、疫霉P.pini、樟疫霉P.cinnamomi、柑橘褐腐疫霉P.citrophthora、P.hydrogena、隐地疫霉P.cryptogea作为阴性对照；瓜果腐霉Phytopythium aphanidermatum、终极腐霉Phytopythium ult imum、刺腐霉Phytopythiumspinosum、轮枝镰刀菌F.verticillioides、层出镰刀菌F.proliferatum、尖孢镰刀菌F.oxysporum作为属间阴性对照，ddH

表2用于栎树猝死病菌RPA-LFD检测体系的真菌和卵菌及扩增结果

注：B.Tyler表示Brett Tyler教授；+表示发生了RPA-LFD扩增,呈阳性；-表示无扩增，呈阴性。

按照实施例2-3的方法进行检测，检测结果如图6和图7所示。

图6基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的RPA-LF D侧流层析试纸条最佳反应时间检测结果图。结果表明：当反应时间为10min的扩增产物在试纸条上已经有明显的条带，随着孵育时间的增加，检测线与质控线条带颜色也在变深且20min之后条带颜色无明显变化了，基本保持一致(图6)。表明20min为RPA-LFD检测的最佳反应时间。

图7基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的RPA-LF D侧流层析试纸条最佳反应温度检测结果图。结果表明：当反应温度是31℃时的扩增产物其对应的试纸条有很淡的条带，随着孵育温度的提高，试纸条呈现的条带颜色也在逐渐加深39℃时质控线和检测线条带颜色最深，而后温度越高，条带颜色在逐渐变淡(图7)。因此，确定39℃为RPA-LF D检测体系的最佳反应温度。

按照实施例2-3的方法进行检测，检测结果如图8和图9所示。

图8基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的RPA-LF D侧流层析试纸条种间特异性检测结果图；图中从左至右分别表示：栎树猝死病菌(Phytophthoraramorum)、栗黑水疫霉P.cambivora；、疫霉P.pini、樟疫霉P.cinnamomi、柑橘褐腐疫霉P.citrophthora、P.hydrogena、隐地疫霉P.cryptogea、ddH

图9是基于栎树猝死病菌(P.ramorum)新检测靶标Pr52094的RPA-LFD的侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图。图中从左至右分别表示：栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)、瓜果腐霉Phyto pythium aphanidermatum、终极腐霉Phytopythium ultimum、刺腐霉Phytop ythium spinosum、轮枝镰刀菌F.verticillioides、尖孢镰刀菌F.oxysporum、层出镰刀菌F.proliferatum、ddH

综上所述，以实施例1设计的引物、探针和栎树猝死病菌(P.ramoru m)DNA进行RPA扩增反应后，LFD侧流层析试纸条检测结果显示2条带(图8，图9且目标条带清析，能有效检测出栎树猝死病菌(P.ramorum)，而其它卵菌和真菌只有一条蓝色质控线，ddH

实施例4

使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取DNA的浓度为100ng/μL。将100ng/μL浓度的栎树猝死病菌DNA按照10倍梯度进行稀释的得到10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL。用稀释后不同浓度的DNA作为模板、ddH

结果如图10所示，50μL的反应体系中栎树猝死病菌(P.ramorum)D NA浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL的试纸条出现两条带，呈阳性反应；50μL的反应体系中栎树猝死病菌(P.ramorum)D NA浓度为1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL的纸条出现一条带，呈阴性反应。试纸条显色结果表明：RPA-LFD侧流层析试纸条技术的灵敏度达到10pg/μL且随着DNA浓度降低，试纸条条带的颜色也逐渐变淡(图10)。因此，本实验RPA-LFD检测技术的最低检测限度为10pg/μL高于普通PCR检测方法10倍

综上，本发明建立一种基于RPA-LFD的栎树猝死病菌快速检测方法。该方法在39℃条件下反应20min，即可通过试纸条测定扩增产物，总耗时约30min，具有高特异性和灵敏性，操作简单且反应时间短，不需要昂贵实验仪器，即使在偏远地区也可以实现该检测方法的应用。由于栎树猝死病菌具有多种传播方式且会对生态和经济造成损失，但是当前并无根除的方法。目前在我国未曾分布，一旦侵入将会造成经济损失，破坏生态平衡。因此，RPA-LFD检测方法为口岸检疫工作提供了一个有利工具就显得尤为重要。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。