一种dsRNA对叶螨直接毒性影响的测定方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及基于RNAi技术防治农业害螨，具体为一种dsRNA对叶螨直接毒性影响的测定方法。

背景技术

在农业生产中，由于害虫造成的经济损失是十分巨大的，直接影响到人类的粮食安全和生态安全。虽然研究人员已经开发了多种害虫防治措施，但多数措施的适用范围较窄，生产上依旧普遍依赖化学农药。过多地施用化学农药不仅花费巨大，更重要的是产生抗药性、害虫再猖獗和农药残留等问题，对人类健康和生态环境造成了巨大危害。因此开发新型害虫防治策略是十分必要的。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。作为后基因组时代最重要的发现，RNAi技术因其特异性强，对人畜无害，对环境污染小等优点，展现了巨大的应用潜力。经过10多年的探索，植物保护领域已达成共识，RNAi技术在害虫防治中的应用具有可行性。RNAi技术应用于害虫防治的方法可归纳为两种：一是以昆虫取食为基础的植物转基因技术；二是以研制dsRNA杀虫剂为目标的喷洒技术。国际上首例表达昆虫dsRNA的转基因玉米MON87411已经于2017年6月获得了美国环境署（EPA）的种植许可。这是一个具有里程碑意义的重要事件，将RNAi技术应用于害虫防治，标志着第3代杀虫剂诞生（第1代化学农药，第2代Bt毒蛋白）。

刺吸式口器害虫的防治是植保领域的一大难题，研究人员针对RNAi技术在刺吸式口器害虫防治上的应用也开展了相关研究（Ghosh et al., 2017）。Hunter等（2012）分别通过根浸泡以及树干注射的方式使柑橘和葡萄的树苗吸收dsRNA，处理7周后在树苗内仍能检测到dsRNA，而且取食了植物的木虱和叶蝉体内也能检测到dsRNA的存在，他们的工作是第一次在农业生产上对dsRNA的递送方式和稳定性进行了研究。Li等（2015）通过根浸泡的方式在水稻和玉米植株内观察到了dsRNA吸收的现象，将吸收dsRNA的植株饲喂飞虱，观察到了幼虫死亡率增高的现象。Jiang（2018）通过RNAi的方式降低灰飞虱

以上研究结果均表明，利用RNAi抑制刺吸式口器害虫生长发育过程中重要基因的表达，可以引起害虫生长发育障碍或者死亡，说明RNAi能够作为新型防治方法应用于刺吸式口器害虫的防治。尤其是在二斑叶螨中的研究进展，更向我们展示了RNAi技术用于防治叶螨的巨大潜力。但是上述的现有测定方法有效性和灵敏性均存在缺陷，对于RNAi技术的有效性和灵敏性有待提高。

发明内容

本发明克服现有叶螨RNAi方法的复杂繁琐，提供一种简单方便的叶螨RNAi方法。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的。

一种dsRNA对叶螨直接毒性影响的测定方法，包括将针对相关靶基因的dsRNA与吐温溶液混合后浸泡叶螨卵，使dsRNA导入到叶螨体内，并测定外源dsRNA对叶螨的毒性。

优选的，所述吐温溶液混合了dsRNA的终浓度为0.0035％~0.01%。

更优的，所述吐温溶液混合了dsRNA的终浓度为0.005％。

优选的，所述的叶螨为二斑叶螨或山楂叶螨。

优选的，所述的dsRNA为体外合成的ds

优选的，所述浸泡的方法是将桃树叶片用打孔器打成叶盘；叶盘置于琼脂上保湿后，将雌成螨移至叶盘上，雌成螨产卵后，移除雌成螨，用dsRNA吐温溶液均匀打在所有叶螨卵上，使叶螨的卵完全浸泡在dsRNA吐温溶液中，待叶螨的卵孵化后，继续饲养在桃树叶盘上。

优选的，所述测定外源dsRNA对叶螨的毒性，是在dsRNA浸泡卵处理后，待叶螨卵孵化，取孵化4天后的样本应用RT-qPCR进行目标基因表达量变化的分析测定。

更优的，所述分析测定在26℃，50％的RH，光照16L: 8D的培养箱中进行。

本发明相对于现有技术所产生的有益效果为：

本发明通过把外源dsRNA均匀混入吐温溶液用于浸泡处理叶螨的卵；检测分析目标基因在卵孵化4天后叶螨中的表达量变化，并观察叶螨的生物学变化，用以研究基因功能和评价所述外源dsRNA对叶螨毒性。该方法能够有效测定外源dsRNA对叶螨的直接毒性影响，且方法简单可行，有效性和灵敏性好，对相关基因功能的研究和RNAi靶基因筛选具有重要的意义和应用前景。

附图说明

图1为实施例1dsRNA处理山楂叶螨的卵，卵孵化后第4天山楂叶螨体内

图2为实施例1 dsRNA处理卵后，卵孵化后第8天处理组和对照组的山楂叶螨死亡率；图中的值为平均值 ± 标准误差，不同的字母表示处理组和对照组之间的表达量具有显著差异。

图3为实施例1 dsRNA处理卵后对山楂叶螨繁殖力的影响，雌成螨产卵后第8天处理组和对照组的山楂叶螨产卵量，图中的值为平均值 ± 标准误差，不同的字母表示处理组和对照组之间的表达量具有显著差异。

图4为实施例2 dsRNA处理卵，卵孵化后第4天二斑叶螨体内

图5为实施例2 dsRNA处理卵后，卵孵化后第8天处理组和对照组的二斑叶螨死亡率；图中的值为平均值 ± 标准误差，不同的字母表示处理组和对照组之间的表达量具有显著差异。

图6为实施例2 dsRNA处理卵后对二斑叶螨繁殖力的影响，雌成螨产卵后第8天处理组和对照组的二斑叶螨产卵量，图中的值为平均值 ± 标准误差，不同的字母表示处理组和对照组之间的表达量具有显著差异。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合实施例及附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。

实施例1

本实施例以山楂叶螨为研究对象，以其

一种简单灵敏的检测外源dsRNA对山楂叶螨直接毒性影响的测定方法，通过把体外合成的ds

实施例2

本实施例以二斑叶螨为研究对象，研究本发明所述方法用于测定外源dsRNA对二斑叶螨直接毒性的影响。通过把体外合成的ds

具体的，上述实施例1和2的具体研究测定方法如下：

1、设计外源dsRNA：

（1）由表1中所示的引物（其中均含T7启动子＝TAATACGACTCACTATAGGG）的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的（ds

SEQ ID NO.1具体为：

TTTCTGCTAATCACCCTCTTCTTACTGGTCAAAGAGTACTTGACGCTTTGTTTCCTTGTGTTCAAGGAGGTACAACTGCCATTCCAGGAGCTTTTGGTTGCGGTAAAACTGTCATCTCACAAGCTCTTTCTAAATATTCCAACAGTGATGTTATTGTTTACGTTGGTTGCGGTGAGAGAGGTAATGAAATGGCTGAAGTACTTAGAGATTTCCCTGAGTTGACAGTTGAAATCAATGGAGTTACTGAATCAATTATGAGACGTACAACATTGGTAGCCAATACTTCAAACATGCCTGTCGCAGCTCGAGAGGCTTCTATCTATACTGGAATCACATTATCTGAATATTTCCGTGATATGGGTTACCATGTCTCTATGATGGCTGATTCAACCTCACGTTGGGCTGAAGCTTTGAGAGAAATTTCTGGTCG。

SEQ ID NO.2具体为：

TTTCCGCTAACCATCCTTTGCTTACGGGGCAAAGAGTACTTGACGCTTTGTTTCCTTGTGTTCAAGGTGGTACGACTGCCATTCCAGGAGCTTTCGGTTGTGGTAAAACTGTCATCTCACAAGCTCTTTCAAAATATTCCAACAGTGATGTTATTGTTTATGTTGGTTGTGGCGAGCGAGGTAATGAAATGGCTGAAGTACTTAGAGATTTCCCTGAATTGACAGTTGAGATAAATGGTGTCACAGAATCTATCATGAGACGTACAACATTAGTTGCTAACACTTCAAATATGCCTGTCGCTGCTAGAGAGGCTTCTATTTACACCGGTATCACACTGTCTGAATATTTCCGTGATATGGGATATCATGTTTCTATGATGGCAGATTCTACCTCACGTTGGGCTGAAGCTTTGAGAGAAATTTCCGGTCG。

（2）由表1中所示的引物的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的dsGUS作为对照。

2、RNAi体系的构建

建立RNAi系统，首先需要找到一个合适的方法，把dsRNA递送到靶标生物体内。基于叶螨卵的外壳较软易于渗透的特点，本实施例采用一种浸泡叶螨卵递送dsRNA的方法。在该体系中，将dsRNA均匀混在吐温溶液中，使吐温溶液的终浓度为0.005%。具体浸泡方法是：将桃树叶片用打孔器打成直径为17 mm的叶盘，叶盘置于2.5%的琼脂上保湿，将雌成螨移至叶盘上，雌成螨产卵后，移除雌成螨，用移液器将20 μL dsRNA吐温溶液均匀打在所有叶螨卵上，使叶螨的卵完全浸泡在dsRNA吐温溶液中。置于培养箱中，待溶液完全干燥后，继续饲养叶螨直至观察完生物学特征。

3、外源dsRNA对叶螨影响的测定体系

基于所建立的叶螨RNAi体系，建立了外源dsRNA对叶螨影响的测定体系，测定体系包括以下处理：1）阴性对照处理：混入dsGUS的吐温溶液作为阴性对照，dsRNA总量为5μg；2）混入dsAvV-ATPase A或dsTuV-ATPase A的吐温溶液，dsRNA总量为5μg。通过比较处理组和对照组叶螨中

对于每一种叶螨，每个处理测试了约100头叶螨用于基因表达水平试验，试验重复了3次。在叶螨卵孵化后第4天分别取样，100头作为一个样本，每个处理收集3个生物学重复样本，应用RT-qPCR进行

结论分析：

对于每一种叶螨，每个处理测试了约50头叶螨用于观察生物学特性变化试验，试验重复了3次。生物学参数指标包括死亡率和产卵量。卵孵化后第8天统计叶螨死亡率，雌成螨产卵8天后统计产卵量。试验在25℃，50％的RH，光照16L：8D的培养箱中进行。获得数据后，采用合适的生物统计方法分析比较处理组和阴性对照组叶螨不同生命参数的差异。

而同时，含有外源dsRNA（dsAvV-ATPase A或dsTuV-ATPase A）的吐温溶液的处理组与阴性对照（dsGUS）的结果分别如图1～6所示，结果表明：采用吐温溶液浸泡卵递送dsRNA的方法，可以抑制叶山楂叶螨和二斑叶螨体内

本发明所建立的RNAi系统，吐温溶液可以作为载体把外源dsRNA传递给二斑叶螨和山楂叶螨；有效提高了dsRNA对叶螨直接毒性影响测定的灵敏性。本发明提供了一种简单可行、可有效测定外源dsRNA对叶螨（二斑叶螨和山楂叶螨）毒性影响的试验方法。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。