OsFT4基因在调控籼稻或粳稻花时差异上的应用

技术领域

本发明涉及OsFT4基因的新用途，尤其涉及OsFT4基因在调控籼稻或粳稻花时差异上的应用，属于OsFT4基因的新用途领域。

背景技术

水稻是中国最主要的粮食作物，不断提高水稻产量对于解决中国粮食安全问题意义重大。籼稻(indica)和粳稻(japonica)是亚洲栽培稻驯化过程中产生的明显分化的两个亚种，亚种间杂交具有强大的杂种优势，是杂交稻育种进一步发展的主要方向，但是籼粳杂种优势的利用受到很多因素的限制，包括籼粳杂种不育、杂种F

水稻花时通常是指一天中大田群体颖花盛花的时间。一般而言，籼稻开花早且集中，粳稻开花晚且分散，导致杂交制种过程中籼粳亲本花时不遇，严重影响制种产量。但由于水稻花时性状考察难度大且易受外界环境的影响，目前尚未克隆出调控籼粳稻花时差异的相关基因，籼粳稻花时不遇的遗传基础基本不清楚。

浆片是控制水稻颖花开闭最关键的结构。水稻的内外稃通过相互嵌合的钩合槽把花内器官封闭起来，浆片吸水膨胀后将外稃向外推开，同时将内稃向内压挤，使内外稃的钩合槽松开，外稃和内稃相互分开，颖花开放。开完花之后，浆片细胞液泡膜破裂，发生细胞自溶，浆片中的水分和解体物经导管向小穗轴运输后失水，外稃在小穗轴的弹力下与内稃重逢，使得颖花重新闭合。因此，通过比较不同时间点籼粳浆片转录组数据，分析差异表达基因，即有可能找出调控籼粳稻花时差异的关键因子。

发明内容

本发明的目的之一是提供调控籼稻或粳稻花时差异的OsFT4基因；

本发明的目的之二是提供调控籼稻或粳稻花时差异OsFT4基因表达的启动子；

本发明的目的之三是提供一种解决籼稻或者粳稻杂交制种中亲本花时不遇的方法。

本发明的目的之四是提供一种培育早开花水稻品种的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：

本发明利用籼粳浆片转录组比较分析发现一个在水稻开花前1h左右特异高表达的基因OsFT4，进一步发现OsFT4基因的启动子在水稻籼粳亚种中存在6个SNP的差异，使得该基因在籼粳浆片中表达量有差异，进而导致了籼粳花时的差异；其中，所述的OsFT4基因是籼稻的OsFT4基因，或者是粳稻的OsFT4基因；籼稻的OsFT4基因的CDS序列为SEQ ID No.1所示，该基因的启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述粳稻的OsFT4基因的CDS序列为SEQ ID No.3所示，该基因的启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

进一步的，含有所述SEQ ID No.2所述的启动子或SEQ ID No.4所示的启动子的表达盒、含有该表达盒的重组植物表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明进一步分别敲除了籼稻或粳稻中的OsFT4基因并获得了籼稻突变体和粳稻突变体，结果发现籼稻突变体开花紊乱，粳稻突变体开花延迟。此外，本发明将籼稻的OsFT4等位基因转到粳稻中，结果发现转化体粳稻开花提前；由此，本发明提供了OsFT4基因在调控水稻花时中的应用以及其启动子差异在调控籼粳花时差异中的应用。

作为本发明的一种具体的实施方案，所述的OsFT4基因或其启动子在调控籼稻或粳稻花时差异上的应用包括：

将粳稻中的OsFT4基因敲除延迟粳稻的开花时间；

或者将籼稻中的OsFT4基因敲除使籼稻开花紊乱；

或者将籼稻的OsFT4基因导入到粳稻中，使粳稻开花提前。

本发明更进一步提供了一种使籼稻或粳稻杂交制种过程中父母本花时相遇的方法，包括：(1)将粳稻中的SEQ ID No.4所示启动子替换成SEQ ID No.2所示的籼稻启动子；或者将籼稻中的SEQ ID No.2所示启动子替换成SEQ ID No.4所示的粳稻启动子；(2)将OsFT4基因在粳稻浆片中进行过表达；或者降低OsFT4基因在籼稻浆片中的表达量。

优选的，所述方法包括：(1)将粳稻中的SEQ ID No.4所示启动子替换成SEQ IDNo.2所示的籼稻启动子；(2)将OsFT4基因在粳稻浆片中进行过表达。

为了实施本发明，制备和使用植物表达载体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员所熟知，见例如Sambrook等。

作为参考，将所述OsFT4基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、SEQ IDNo.1或SEQ ID No.3所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明中所述的转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的表达盒提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.Plant CellReports.1986.5:81-84)。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸进行优化以增强在水稻中的表达效率。

本发明为籼粳稻杂交制种奠定理论基础和提供优良基因资源。

本发明整体技术方案详述

为了比较籼粳稻开花过程中转录组的差别，选取不同时间点籼稻天丰B(TFB)及对应时间点的粳稻中花11(ZH11)的浆片组织进行转录组测序。通过比较籼粳不同时间点浆片的转录组数据，在其中发现一个转录因子OsFT4(Os01g0637800)，OsFT4在籼粳花前1h的浆片中表达量达到最高，且在籼稻花前1h的浆片中表达量明显高于粳稻。通过定量PCR实验进一步发现OsFT4在TFB浆片中的表达量高于ZH11，该结果与转录组数据一致，推测可能由于OsFT4在籼稻中提前高表达，使得籼稻开花早于粳稻。

本发明将ZH11和TFB基因组中OsFT4基因的CDS序列和ATG上游2kb的启动子序列用PCR的方法克隆出来并进行测序，其中，TFB的OsFT4基因的CDS序列为SEQ ID No.1所示，TFB的OsFT4基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；ZH11的OsFT4基因的CDS序列为SEQID No.3所示，ZH11的OsFT4基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；本发明通过分析发现ZH11和TFB的OsFT4编码区只存在一个同义SNP，籼稻和粳稻的OsFT4蛋白序列一致。而ZH11和TFB的OsFT4启动子区域存在6个SNP，且对生产上常用的46份粳稻和67份籼稻材料的OsFT4启动子进行重测序，发现这6个SNP在籼粳稻中非常保守，说明OsFT4的启动子存在6个SNP的籼粳分化。

本发明进一步利用CRISPR/Cas9转基因技术将ZH11中的OsFT4基因敲除后，突变体每日开花时间延迟约30min；将TFB中的OsFT4基因敲除后，突变体每日开花时间延迟约1h；将TFB的OsFT4等位基因转到ZH11以后，转基因株系每日开花时间提前。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“启动子”指多核苷酸分子，所述多核苷酸分子在其天然状态位于可读框(或蛋白质编码区)的翻译起始密码子上游或5’，并参与RNA聚合酶II及其它蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合以启动转录。

术语“植物启动子”是在植物细胞中有功能的天然或非天然启动子。组成型植物启动子在植物发育始终的大部分或所有组织中发挥功能。可以将任何植物启动子用作5’调节元件以用于调节与其可操作地连接的一种或多种特定基因的表达。当与可转录的多核苷酸分子可操作地连接时，启动子一般引起该可转录的多核苷酸分子的转录，其转录方式与该启动子通常连接的可转录的多核苷酸分子的转录方式类似。植物启动子可以包括通过操作已知启动子以产生人工、嵌合或杂合启动子而产生的启动子。这类启动子也可以通过例如向具有其自身部分或全部调节元件的活性启动子加入异源调节元件而组合了来自一个或多个启动子的顺式元件。

术语“可操作地连接”指第一个多核苷酸分子(例如启动子)与第二个可转录的多核苷酸分子(例如目的基因)连接，其中多核苷酸分子如此排列，从而第一个多核苷酸分子影响第二个多核苷酸分子的功能。优选地，两个多核苷酸分子是单个连续多核苷酸分子的部分，且更优选是临近的。例如，如果启动子在细胞内调节或介导目的基因的转录，则该启动子与目的基因可操作地连接。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

附图说明

图1为OsFT4的籼粳浆片转录组数据及定量验证；A,OsFT4在不同时间点的籼稻(TFB)和粳稻(ZH11)浆片中的表达量变化，B1d-籼粳稻开颖前一天下午18:00，9:00-开颖当天9:00，10:00-开颖当天10:00，即TFB盛花时，11:00-开颖当天11:00，12:00-开颖当天12:00，即ZH11盛花时；B,2020早晚季TFB花前1h左右及对应时间的ZH11浆片中OsFT4的表达量检测。

图2为籼粳OsFT4序列比较分析；A，ZH11和TFB的OsFT4基因编码区核苷酸序列比对；B，籼粳稻OsFT4基因2kb启动子区域核苷酸序列的6个SNP位点。

图3为ZH11背景ft4突变体表型；A,OsFT4敲除靶点示意图及突变体测序峰图，灰色表示外显子，黑色表示内含子；B,ZH11盛花及对应时间的ft4表型对比，bar＝1cm；C,ZH11和ft4的一日开花动态，纵坐标表示统计时正在开放的颖花数目，n＝8；D,ZH11和ft4的逐日开花动态，横坐标表示穗子从剑叶中抽出的天数，纵坐标表示统计当天一穗的开花总数，n＝10。

图4为TFB背景ft4突变体表型；A,OsFT4敲除靶点示意图及突变体测序峰图，灰色表示外显子，黑色表示内含子；B,TFB盛花及对应时间的ft4表型对比，bar＝1cm；C,TFB和ft4的一日开花动态，n＝8；D,TFB和ft4的逐日开花动态，n＝10。

图5为OsFT4

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

试验例1籼粳浆片转录组比较分析及定量验证OsFT4表达量试验

为了比较籼粳稻开花过程中转录组的差别，选取开颖前一天18:00，开颖前1h，正开颖三个时间点的籼稻天丰B(TFB)和对应时间点的粳稻中花11(ZH11)浆片组织，以及ZH11开颖前1h的浆片组织。由于TFB比ZH11早开颖2h，TFB开颖前的1h的取样时间点则对应ZH11的花前3h，TFB正开花时间点对应ZH11开颖前2h。通过比较籼粳不同时间点转录组数据，在其中发现一个转录因子OsFT4(Os01g0637800)在籼粳花前1h的浆片中表达量达到最高，且在籼稻花前1h表达量明显高于对应时间的粳稻(图1A)。分别于2020年早晚季上午取TFB花前1h及对应时间的ZH11浆片提取RNA，反转录成cDNA，利用特异引物qFT4-F和qFT4-R进行定量验证，发现OsFT4在TFB浆片中的表达量均高于ZH11(图1B)，与转录组数据一致。推测可能由于OsFT4在籼稻中提前高表达，使得籼稻开花早于粳稻。

表1引物序列

试验例2籼粳OsFT4基因的序列比对试验

将ZH11和TFB基因组中OsFT4基因的CDS序列和ATG上游2kb的启动子序列用PCR的方法克隆出来并进行测序，其中，TFB的OsFT4基因的CDS序列为SEQ ID No.1所示，OsFT4基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；ZH11的OsFT4基因的CDS序列为SEQ ID No.3所示，OsFT4基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；通过分析发现TFB和ZH11的OsFT4编码区只存在一个同义SNP(图2A)，籼稻和粳稻的OsFT4蛋白序列一致。而ZH11和TFB的OsFT4启动子区域存在6个SNP，且对生产上常用的47份粳稻和76份籼稻材料的OsFT4启动子进行重测序，发现这6个SNP在籼粳稻中非常保守(图2B)，说明OsFT4的启动子存在6个SNP的籼稻和粳稻分化。

试验例3OsFT4基因ZH11背景敲除材料创制及表型分析试验

为了验证OsFT4的功能，筛选和设计OsFT4基因特异的靶标序列CACGGGCCCTTGCGCACCGC(SEQ ID No.5)，之后将这些靶标序列引入到sgRNA表达盒中，靶位点序列由图3A所示。最终构建成的CRISPR/Cas9基因编辑载体经过PCR测序验证无误后，通过农杆菌介导的方法分别转化ZH11和TFB。

经过基因型鉴定，在ZH11背景下获得两个不同的突变事件，如图3A所示。通过对ZH11和ft4材料的每日开花时间进行调查和统计，发现ft4开颖延迟(图3B&C)，但是突变体的每日开花总数与ZH11无明显差异(图3D)。

试验例4OsFT4基因TFB背景敲除材料创制及表型分析

利用CRISPR/Cas9的方法构建了TFB背景的ft4材料，并获得了两个不同的突变事件(图4A)。通过对TFB和ft4材料的每日开花时间进行调查和统计，发现TFB一般在上午开放，在10:00～11:00左右盛花，而ft4材料盛花时间延迟1h左右(图4B&C)。突变体的每日开花总数与TFB无明显差异(图4D)。说明OsFT4只影响水稻的每日开花时间，但是不影响每日开花数量。

试验例5籼型OsFT4等位基因互补材料创制及表型分析

扩增TFB的OsFT4等位基因的基因组序列，含ATG上游2kb启动子及TGA下游1.5kb3’UTR区域(图5A)，用EcoRI和KpnI酶切pCAMBIA1300载体，利用同源重组的方法将OsFT4

重组载体经过PCR测序验证无误后，通过农杆菌介导的方法转化粳稻ZH11构建遗传互补材料，水稻的遗传转化委托百格公司完成。为了排除基因的剂量效应，利用数字PCR(Digital PCR，ddPCR)在T