用于检测真菌的引物对及其应用和检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测真菌的引物对及其应用和检测方法。

背景技术

微生物检验是细胞制剂等生物制品质量控制的重要内容，其内容主要包括以培养方法检测是否有菌体、病毒等微生物的污染。常规检测方法通常有形态学检查、培养法、药敏试验和免疫学检测等，生物制品较常用的方法是培养法，但培养法耗时长，一般需要14天，个别生长缓慢的均则需要更长时间，对于阳性结果不能快速做出判断，而且培养法阳性检出率不高。

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)实现了对单一微生物的检测，相比于传统培养方法虽然具有特异、灵敏、耗时短等优点，但是传统PCR只能检测单个物种，对于可能存在多种微生物污染的样本的检测，则需要重复操作，且存在容易漏检的风险。因此如何改进利用PCR原理检测真菌的手段是目前有待解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低并适用于多种真菌污染的样本的快速且高灵敏度地检测产品和方法。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测真菌的引物对，包括正向引物和反向引物；

正向引物为：F：5'-CCTTRCGAGAAATCAAAGTCTTTGG-3'(SEQ ID NO.1)；

反向引物为：R：5'-CCTTMTTGTGTCTGGAMMTGGYGAGT-3'(SEQ ID NO.2)；

其中R表示A或G，Y表示C或T，M表示A或C。

本发明提供的引物对以真菌的18SrRNA基因保守区为结合位点，能够扩增如下种类的真菌：白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌。

可选的实施方式中，所述正向引物和所述反向引物的工作浓度分别独立的为8～12μM，例如可以为但不限于为8、9、10、11或12μM，或上述任意两点之间的范围值。所述正向引物和所述反向引物的工作浓度分别独立的优选为10μM。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测真菌的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含上述引物对。

可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒还包括PCR扩增酶、缓冲组分、金属离子、盐、荧光染料、表面活性剂、dNTP、阳性对照和阴性对照中的至少一种。

根据本发明的另一个方面，还提供了上述引物对，或上述试剂或试剂盒在检测真菌中的应用，上述试剂或试剂盒可用于检测如下真菌中的至少一种：白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌。需要说明的是，本发明提供的应用是非诊断和治疗目的的。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种检测真菌的方法，该方法包括使用上述引物对，或上述试剂或试剂盒扩增待测样本。需要说明的是，本发明提供的方法是非诊断和治疗目的的。

可选的实施方式中，所述待测样本包括食品样本、药品样本和试剂样本中的至少一种。

可选的实施方式中，所述方法为荧光定量PCR，包括如下步骤：将从待测样本中提取的总DNA为模板，使所述试剂或试剂盒，进行荧光定量PCR反应；收集所述荧光定量PCR反应的荧光信号，所述荧光信号用于结果分析。所述结果分析包括但不限于定性、半定量或定量分析。可选的实施方式，根据待测样本是否出现扩增曲线，定性的判断待测样本中是否存在真菌菌体；可选的实施方式，根据待测样本的Ct值，依据本领域已知的、常规的相对荧光定量的计算方法半定量待测样本中的菌体数量；可选的实施方式，通过构建标准曲线，并根据所述荧光信号计算所述待测样本中所含有的菌体数量。

可选的实施方式中，所述荧光定量PCR为通过在反应体系中添加荧光染料，例如添加SYBR

可选的实施方式中，当所述待测样本的Ct值为小于40，有明显的扩增曲线，且空白对照的Ct值大于40时，无明显的扩增曲线时，所述荧光信号用于结果分析。

可选的实施方式中，所述方法还包括制备梯度浓度的若干标准菌体悬液，建立菌体梯度浓度的对数值与Ct值的标准曲线；所述标准菌体包括如下菌体的标准菌体：白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌中的至少一种。

可选的实施方式中，所述若干标准菌体悬液中各菌体的浓度范围分别独立的为10至10

可选的实施方式中，所述方法还包括将获取的待测样本的Ct值带入标准曲线，获取待测样本中对应真菌的菌体数量。

可选的实施方式中，所述方法还包括将获取判断为存在感染真菌感染的样本的菌落数，根据Ct值和菌落数的对应关系与标准曲线匹配，以判断感染的真菌的类别。

可选的实施方式中，所述扩增的反应程序为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性30s，60℃退火延伸1min，循环数为40；在每个循环延伸后收集荧光信号。(3)熔解曲线分析。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的用于检测真菌的引物对以真菌菌体来源的18SrRNA基因为靶点，具有以下优点：特异性较强，仅对于真菌菌体基因组DNA能进行特异性扩增，对无真菌细胞制剂DNA无法进行扩增；检测灵敏度较高，对白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、克柔假丝酵母、都柏林假丝酵母、热带假丝酵母、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌的检测下限均10CFU/mL。由此，本发明实现了对可能存在真菌污染的样本的高灵敏度地检测，对比传统的培养法，本发明提供的引物对和建立的检测方法具有很高的灵敏度和时效性，为细胞制剂无菌快检领域提供了一种有效的检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的引物对对15种真菌菌种的PCR扩增曲线图；

图2为本发明实施例1提供的引物对对15种真菌菌种的PCR熔解曲线图；

图3为白色念珠菌的标准曲线；

图4为光滑假丝酵母菌的标准曲线；

图5为近平滑假丝酵母菌的标准曲线；

图6为克柔假丝酵母菌的标准曲线；

图7为都柏林假丝酵母菌的标准曲线；

图8为热带假丝酵母菌的标准曲线；

图9为卡氏枝孢霉的标准曲线；

图10为须毛癣菌的标准曲线；

图11为黑曲霉的标准曲线；

图12为烟曲霉的标准曲线；

图13为黄曲霉的标准曲线；

图14为土曲霉的标准曲线；

图15为新生隐球菌的标准曲线；

图16为肺囊菌的标准曲线；

图17为紫色毛癣菌的标准曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中，PCR扩增酶反应混合液PowerUp

白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌均购自ATCC。

实施例1

提供了一对用于检测真菌的引物，该对引物以真菌18SrRNA基因保守区域为靶基因，包括如SEQ ID NO.1所示的18SrRNA基因正向引物和SEQ ID NO.2所示的18SrRNA基因反向引物：

F：5'-CCTTRCGAGAAATCAAAGTCTTTGG-3'SEQ ID NO.1；

R：5'-CCTTMTTGTGTCTGGAMMTGGYGAGT-3'SEQ ID NO.2；

其中，R表示A或G，Y表示C或T，M表示A或C。

实施例2

样品DNA制备：

(一)制备浓度范围为10

(1)样品前处理：

取甘油保存的白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌，接种至相应培养基中，20～25℃培养24～48h。吸取不同真菌菌种的菌悬液，当可见分光光度计波长600nm时OD值在0.8时，进行平板计数。

(2)平板计数：

将培养获得的菌悬液100μL加入到无菌固体培养基中，小心旋转平板，使菌液均匀地分布在平板表面，将固体培养皿置于35℃培养箱中培养48h，记录下各平板上的菌落数。

(3)梯度稀释菌液：

调整各真菌菌体浓度为10

(二)菌体数量18SrRNA基因的荧光定量PCR检测前的样本准备。

(1)提取待测样本基因组DNA：在生物安全柜中分别取上述各浓度的白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌菌液，以17000g，离心5min去上清，加入80μL裂解液，100煮沸15min，离心，转速为12000rpm/min，3min得上清液，即为真菌菌体DNA。

将抽提好的DNA样本，用可见分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的得量要求为10～30μg，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间，于-20℃保存。

(2)空白对照品为：无菌双蒸水。

实施例3

真菌菌体18SrRNA基因基因的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

以实施例1所设计合成的18SrRNA引物SEQ ID NO.1和2为扩增引物，引物用无菌双蒸水缓冲液稀释成10μM。PCR扩增酶为PowerUp

扩增体系如下：10μL的2×PCR扩增酶反应混合液，正向引物和反向引物各1μL，1μL待测样品基因组DNA，反应总体系为20μL。

反应程序为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性30s，60℃退火延伸1min，循环数为40；在每个循环延伸后收集荧光信号。(3)熔解曲线分析。

取白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌的基因组DNA，用无菌双蒸水稀释至约100ng/μL作为模板。按照上述方法进行PCR扩增。图1和图2所示为扩增效果，可见本发明所设计合成的引物能有效扩增出各菌种的18SrRNA基因，且熔解曲线分析结果表明条带单一。

实施例4

(1)特异性和灵敏度实验：

取无菌细胞制剂，分别和浓度为10

使用实施例3的检测方法进行PCR扩增，检测结果如表1所示，结果显示白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌基因组DNA模板18SrRNA基因检测的Ct值均小于40，而无菌细胞制剂未检测到18SrRNA基因的荧光信号，其Ct值大于40，所得荧光信号可以用于判断待测样品中的菌体种类及含量。上述结果表明，实施例1所设计的18SrRNA基因引物对在实时荧光PCR检测真菌菌体样本时具有特异性，即该引物对只能扩增真菌菌体基因组DNA，且15种真菌在该体系的检测下限均为10CFU/ml，具有较高的灵敏度。

表1优化引物菌落检测的Ct值

(2)标准曲线的建立：：

将实施例2所得的梯度系列标准菌体悬液的DNA样本按实施例3中进行PCR扩增。建立15种真菌的菌体浓度的对数(log CFU/mL)与Ct值的标准曲线，分析不同菌体标准曲线，如图3～17所示。

标准曲线的曲线拟合度、检测下限见表2，结果表明各菌种PCR的线性拟合程度均表现良好，表明结果可信。

表2

实施例5

准备2份细胞制剂A和B，经过提取细胞制剂中的DNA，进行PCR鉴定，判断2份细胞制剂染菌情况。具体操作如下：

(1)无菌直接接种法：各吸取细胞制剂A和B溶液各5ml接种到无菌液体培养基中，于30～35℃培养箱中培养14天，观察培养基状态。

(2)细胞制剂DNA提取：在生物安全柜中取100μL细胞样品，以17000g，离心5min去上清，加入80μL裂解液，100℃煮沸15min，离心，转速为12000rpm/min，3min得上清液，即为样品DNA。

(3)PCR扩增：

设置无菌双蒸水为空白对照组，细胞制剂A和B的DNA为待测样品，白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌基因组DNA为阳性对照组。使用实施例3检测方法检测。

PCR扩增结果显示，无菌双蒸水和细胞制剂A的Ct值大于40，细胞制剂B的Ct值为26.27±0.27。平板涂布结果显示，涂布有细胞制剂A的平板未长出单菌落，而涂布有细胞制剂B的平板，平板上的菌落数约为10

对比例1

与实施例检测相同的真菌数量，与实施例不同的是对比例使用18SrRNA多条引物：

18SrRNA引物F1序列：5`-ACTTTYAACAAYGGATCTCTTGGYTC-3`(SEQ IDNO.3)；

18SrRNA引物F2序列：5`-TGACRCTSRRACAGGCATG-3`(SEQ ID NO.4)；

18SrRNA引物F3序列：5`-TGATACTGAARCAGGCGTRCTC-3`(SEQ ID NO.5)。

其中，R表示A或G，Y表示C或T，S表示C或G。

结果显示，对比例最低可检1×10

与对照引物对相比，本发明优化后的引物只需要两条就可检测出同样水平数量的真菌；

与对照引物对相比，本发明优化后的引物对可提高对18SrRNA基因的检测灵敏度(提升100倍)，表明用本发明所用的引物对进行荧光定量PCR检测18SrRNA基因时，具有很高的灵敏度。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。