一种二甲戊灵半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种二甲戊灵半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用。

背景技术

二甲戊灵是由美国氰胺公司开发的一种苯胺类除草剂，用于防除一年生禾本科杂草和一些阔叶杂草，适用于水稻、棉花、玉米、烟草、花生、蔬菜及果园作物，由于除草效果好，安全性高，被广泛推广应用。但是，二甲戊灵是一种低毒化合物，皮肤接触可能引起溃烂，人体吸收后，可能引起发绀恶心，头晕头痛等症状，因此，农产品中残留的二甲戊灵对身体的危害不可忽视，开发一种用于二甲戊灵的快速检测方法十分必要。

目前，检测食品和农产品中二甲戊灵的常用方法有液相色谱法、液质联用法以及免疫分析法等。液相色谱法和液质联用法虽然检测结果准确，但是需要昂贵的仪器设备，并且操作复杂，对操作人员的要求较高，多限于专业实验室内使用。免疫分析法主要包括竞争酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金法，与以上两种方法相比免疫分析法操作简便、快速，无需专业人员操作，仅需配备基础仪器设备即可，同时由于其适合大批量样本筛选，可广泛应用于食品加工企业原料安全把关以及工商执法部门的现场监管，是非常具有推广价值的食品安全快速筛查方法。

但是，目前对于二甲戊灵的免疫分析法普遍存在抗体检测灵敏度不足，效价低的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种二甲戊灵半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用。本发明提供的二甲戊灵半抗原和载体蛋白偶联后所得抗原经宿主动物免疫后，能够产生效价高、灵敏度高的抗体，有利于提高免疫分析法检测二甲戊灵的准确性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种二甲戊灵半抗原，具有式I所示结构：

本发明还提供了上述方案所述二甲戊灵半抗原的制备方法，包括以下步骤：

将2-甲基-4-氯卞氨、硫酸和硝酸混合进行硝化反应，得到二硝基-2-甲基-4-氯卞氨；所述二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的结构如式B所示；

将所述二硝基-2-甲基-4-氯卞氨、3-氨基戊烷、碱性试剂和有机溶剂混合进行取代反应，得到半抗原前体；所述半抗原前体的结构如式C所示；

将所述半抗原前体、吡啶和丁二酸酐混合进行缩合反应，得到具有式I所示结构的二甲戊灵半抗原；

优选的，所述硝化反应包括依次进行第一阶段和第二阶段，所述第一阶段的温度为45～48℃，时间为2～2.5h，所述第二阶段的温度为60～65℃，时间为4～4.5h；

所述取代反应的温度为80～85℃，时间为4～4.5h；

所述缩合反应的温度为75～80℃，时间为12～24h。

优选的，所述硝酸和2-甲基-4-氯卞氨的摩尔比为(2～2.2):1；

所述3-氨基戊烷和二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的摩尔比为(1～1.2):1；

所述丁二酸酐和半抗原前体的摩尔比为(1～1.2):1。

本发明还提供了一种二甲戊灵抗原，由上述方案所述的二甲戊灵半抗原或上述方案所述的制备方法制备得到的二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到。

优选的，所述载体蛋白为卵清蛋白或牛血清蛋白；所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述二甲戊灵抗原的结构式如式II所示：

当所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述二甲戊灵抗原的结构式如式III所示：

本发明还提供了上述方案所述二甲戊灵抗原的制备方法，包括以下步骤：

将上述方案所述的二甲戊灵半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到半抗原活化液；

将所述半抗原活化液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述二甲戊灵抗原。

本发明还提供了一种二甲戊灵抗体，由上述方案所述的二甲戊灵抗原免疫宿主动物得到。

本发明还提供了一种检测二甲戊灵的试纸或试剂盒，含有上述方案所述的二甲戊灵抗体。

本发明还提供了上述方案所述二甲戊灵抗体或上述方案所述的试纸或试剂盒在检测二甲戊灵中的应用。

本发明提供了一种二甲戊灵半抗原，结构式如式I所示。本发明在二甲戊灵的2位甲基上引入活性基团，所得二甲戊灵半抗原和载体蛋白偶联后，所得抗原的免疫原性高，经宿主动物免疫后，能够产生效价高、灵敏度高的抗体，从而提高免疫分析法检测二甲戊灵的准确性。

本发明还提供了上述方案所述二甲戊灵半抗原的制备方法，本发明以对5-氯-2-甲基苯甲氨为原料，经硝化反应、取代反应和缩合反应三步得到二甲戊灵半抗原，本发明提供的制备方法操作简单，条件温和，原料易得，且产物收率高、纯度高。实施例结果表明，采用本发明的方法制备二甲戊灵半抗原，产物的收率达到95％，纯度达到95％。

本发明还提供了二甲戊灵抗原，由上述方案所述的二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到。本发明提供的二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联后，所得抗原免疫原性强。实施例结果表明，本发明的二甲戊灵抗原经小鼠注射免疫后，产生的抗体效价为1.0×10

附图说明

图1为本发明实施例1制备的二甲戊灵半抗原的核磁共振氢谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种二甲戊灵半抗原，具有式I所示结构：

本发明还提供了上述方案所述二甲戊灵半抗原的制备方法，包括以下步骤：

将2-甲基-4-氯卞氨、硫酸和硝酸混合进行硝化反应，得到二硝基-2-甲基-4-氯卞氨；所述二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的结构如式B所示；

将所述二硝基-2-甲基-4-氯卞氨、3-氨基戊烷、碱性试剂和有机溶剂混合进行取代反应，得到半抗原前体；所述半抗原前体的结构如式C所示；

将所述半抗原前体、吡啶和丁二酸酐混合进行缩合反应，得到具有式I所示结构的二甲戊灵半抗原；

在本发明中，所述二甲戊灵半抗原的合成路线如Chem1所示：

下面结合Chem1对二甲戊灵半抗原的制备方法进行详细说明。

本发明将2-甲基-4-氯卞氨(结构式如Chem1中的式A所示)、硫酸和硝酸混合进行硝化反应，得到二硝基-2-甲基-4-氯卞氨；所述二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的结构如式B所示；所述2-甲基-4-氯卞氨的结构如Chem1中的式A所示；在本发明中，所述硝化反应优选包括依次进行第一阶段和第二阶段，所述第一阶段的温度优选为45～48℃，时间优选为2～2.5h，所述第二阶段的温度优选为60～65℃，时间优选为4～4.5h。

在本发明中，所述硝酸和2-甲基-4-氯卞氨的摩尔比优选为(2～2.2):1；所述硝酸优选为发烟硝酸，所述硫酸优选为浓硫酸；本发明对所述浓硫酸和浓硝酸没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的浓硫酸和发烟硝酸即可，具体为98wt％的浓硫酸和90wt％～97.5wt％的发烟硝酸。

本发明优选先将2-甲基-4-氯卞氨溶解于浓硫酸中，室温搅拌30min后，再向所得溶液中滴加浓硫酸和发烟硝酸的混合溶液，滴加完毕后，在油浴条件下依次进行第一阶段和第二阶段的硝化反应，反应过程中优选采用TLC法监测反应进程；所述2-甲基-4-氯卞氨和溶解用浓硫酸的用量比优选为1g:30～50mL；所述浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中浓硫酸和发烟硝酸的体积比优选为1:1。

硝化反应结束后，本发明优选将所得反应液倒入冰块中，析出固体产物后过滤，并采用氢氧化钠溶液洗涤滤饼至洗涤液呈中性，将洗涤后的滤饼干燥，得到二硝基-2-甲基-4-氯卞氨。

得到二硝基-2-甲基-4-氯卞氨后，本发明将所述二硝基-2-甲基-4-氯卞氨、3-氨基戊烷、碱性试剂和有机溶剂混合进行取代反应，得到半抗原前体；所述半抗原前体的结构如式C所示。在本发明中，所述3-氨基戊烷和二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的摩尔比优选为(1～1.2):1；所述碱性试剂优选为氢氧化钠，所述氢氧化钠优选为氢氧化钠水溶液的形式使用，所述氢氧化钠水溶液的浓度优选为2mol/L；所述二硝基-2-甲基-4-氯卞氨和氢氧化钠的摩尔比优选为(2～2.5):1；所述有机溶剂优选为四氢呋喃，本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊要求，能够使取代反应顺利进行即可。

在本发明中，所述取代反应的温度优选为80～85℃，时间优选为4～4.5h；在本发明的具体实施例中，所述取代反应优选在回流条件下进行。

在本发明的具体实施例中，优选先将二硝基-2-甲基-4-氯卞氨溶于有机溶剂中，得到二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的溶液，将3-氨基戊烷溶于氢氧化钠水溶液中，得到3-氨基戊烷-氢氧化钠混合溶液，之后将二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的溶液滴加到3-氨基戊烷-氢氧化钠混合溶液中，在油浴回流条件下进行取代反应，反应过程中采用TLC监测反应进程。

取代反应结束后，本发明优选将所得反应液减压蒸馏，去除有机溶剂，将所得剩余物用水溶解，将所得溶解液用石油醚萃取，得到水相；将所述水相的pH值调节至6.5～7后，用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；将所述乙酸乙酯相浓缩，所得浓缩物进行柱层析提纯，得到所述半抗原前体；所述石油醚萃取的次数优选为4次，将4次萃取所得水相合并；所述乙酸乙酯萃取的次数优选为4次，将4次萃取所得乙酸乙酯相合并；所述柱层析提纯采用的洗脱剂优选为乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂，所述混合溶剂中乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:1。

得到半抗原前体后，本发明将所述半抗原前体、吡啶和丁二酸酐混合进行缩合反应，得到具有式I所示结构的二甲戊灵半抗原。在本发明中，所述丁二酸酐和半抗原前体的摩尔比优选为(1～1.2):1；本发明对所述吡啶的用量没有特殊要求，能够将半抗原前体溶解，并使缩合反应顺利进行即可。

在本发明中，所述缩合反应的温度优选为75～80℃，时间优选为12～24h，反应过程中优选采用TLC法监测反应进程。

缩合反应完成后，本发明优选将所得反应液减压蒸馏至干，将所得第一剩余物和甲苯混合后再次减压蒸馏至干，将所得第二剩余物溶于乙酸乙酯中后进行柱层析提纯，得到所述二甲戊灵半抗原；所述柱层析提纯采用的洗脱剂优选为乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂，所述混合溶剂中乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为2:1。

本发明还提供了一种二甲戊灵抗原，由上述方案所述的二甲戊灵半抗原或上述方案所述的制备方法制备得到的二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到。

在本发明中，所述载体蛋白优选为卵清蛋白或牛血清蛋白；所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述二甲戊灵抗原的结构式如式II所示：

当所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述二甲戊灵抗原的结构式如式III所示：

在本发明的具体实施例中，式II所示结构的二甲戊灵抗原为二甲戊灵包被原，式III所示结构的二甲戊灵抗原为二甲戊灵免疫原。

本发明还提供了上述方案所述二甲戊灵抗原的制备方法，包括以下步骤：

将上述方案所述的二甲戊灵半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到半抗原活化液；

将所述半抗原活化液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述二甲戊灵抗原。

本发明将上述方案所述的二甲戊灵半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到半抗原活化液。在本发明中，所述极性溶剂优选为DMF，所述二甲戊灵半抗原和所述极性溶液的用量比优选为10mg：200μL；所述偶联剂优选为二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，或为(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；所述活化的温度优选为25～30℃，时间优选为12～24h。

在本发明中，制备所述二甲戊灵包被原(式II)时，采用的偶联剂优选为DCC和NHS；所述DCC和二甲戊灵半抗原的摩尔比优选为(2～2.5):1，所述NHS和二甲戊灵半抗原的摩尔比优选为(1～1.2):1；在本发明的具体实施例中，优选先将二甲戊灵半抗原溶于DMF中，然后加入NHS和DCC进行活化，活化完成后，优选将所得活化产物离心，所得上清液为所述半抗原活化液。

在本发明中，制备所述二甲戊灵免疫原(式III)时，采用的偶联剂优选为EDC和NHS；所述EDC和二甲戊灵半抗原的摩尔比优选为(2～2.5):1；所述NHS和二甲戊灵半抗原的摩尔比优选为(1～1.2):1；在本发明的具体实施例中，优选先将二甲戊灵半抗原溶于DMF中，然后加入NHS和EDC进行活化，活化完成后，优选将所得活化产物离心，所得上清液为所述半抗原活化液。

得到半抗原活化液后，本发明将所述半抗原活化液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述二甲戊灵抗原。在本发明中，当制备所述二甲戊灵包被原时，采用的载体蛋白优选为OVA，制备所述二甲戊灵免疫原时，采用的载体蛋白优选为BSA；所述载体蛋白和所述二甲戊灵半抗原的摩尔比优选为(40～50):1；所述载体蛋白的缓冲溶液优选由载体蛋白溶解于缓冲溶液中得到，当所述载体蛋白为OVA时，所述缓冲溶液优选为PB缓冲液，所述PB缓冲液的浓度优选为0.02mol/L，当所述载体蛋白为BSA时，所述缓冲溶液优选为PB缓冲液，所述PB缓冲液的浓度优选为0.02mol/L。本发明优选将半抗原活化液逐滴加入所述载体蛋白的缓冲溶液中，加入完毕后在室温下进行反应。

在本发明中，所述偶联反应的温度优选为25～30℃，时间优选为4～6h。

在本发明中，所述二甲戊灵包被原(式II)的合成过程如Chem2所示：

在本发明中，所述二甲戊灵免疫原(式III)的合成过程如Chem3所示：

偶联反应完成后，本发明优选将所得反应液离心，吸取上清液，将所述上清液透析，得到所述二甲戊灵抗原。在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子量优选为8000～14000，所述透析袋优选采用EDTA溶液处理，并用蒸馏水洗净后使用；所述EDTA溶液的浓度优选为0.2mol/L；当制备所述二甲戊灵包被原时，透析用透析液优选为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度优选为0.02mol/L；当制备所述二甲戊灵免疫原时，透析用透析液优选为PB缓冲液，所述PB缓冲液的浓度优选为0.02mol/L；所述透析的时间优选为3天，每8h更换一次透析液。透析结束后，优选将透析袋中的溶液析出，低温冻存备用。

本发明还提供了一种二甲戊灵抗体，由上述方案所述的二甲戊灵抗原免疫宿主动物得到；所述宿主动物优选为小鼠；本发明对所述免疫的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可；在本发明的具体实施例中，优选使用不完全弗氏佐剂将二甲戊灵免疫原稀释液乳化后再对宿主动物进行免疫；所述二甲戊灵免疫原稀释液采用的稀释剂优选为灭菌后的1％氯化钠溶液。

在本发明的具体实施例中，制备二甲戊灵抗体的过程优选如下：

采用乳化后的二甲戊灵抗体对宿主动物进行免疫，得到免疫动物，利用ELISA方法对免疫动物进行血清测试，当血清参数达到需求后按单抗制备方法进行单抗制备；

提取所述免疫动物的脾细胞并和同系骨髓瘤细胞进行融合，得到融合细胞；

对所述融合细胞进行杂交瘤筛选；

采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，采用免疫学方法筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。

本发明还提供了一种检测二甲戊灵的试纸或试剂盒，含有上述方案所述的二甲戊灵抗体。

本发明还提供了上述方案所述二甲戊灵抗体或上述方案所述的试纸或试剂盒在检测二甲戊灵中的应用；所述检测二甲戊灵的方法优选为ELLSA试剂盒法或胶体金法。采用本发明的二甲戊灵抗原免疫小鼠，所得抗体效价高、灵敏度高，将其应用于二甲戊灵的检测中，能够提高检测方法的准确度和灵敏度。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

二甲戊灵半抗原的合成：

将100mL浓硫酸分批缓慢加入5.29g 2-甲基-4-氯卞氨中，加毕，室温搅拌30min，缓慢滴加30mL浓硫酸和发烟硝酸的混合物，混合物中浓硫酸和发烟硝酸的体积比为1:1，加毕后油浴45℃反应2h，然后升温至60℃反应4h，TLC法检测反应完全后，将反应液倒入冰块中，析出大量固体，抽滤，用1wt％的NaOH溶液洗涤滤饼，直到洗出液pH值为中性，将滤饼放置于空气中干燥，得到白色固体5.33g，即为二硝基-2-甲基-4-氯卞氨(式B)。

将二硝基-2-甲基-4-氯卞氨5.33g溶于200mL干燥的四氢呋喃中，另将2.54g 3-氨基戊烷溶于2mol/L的NaOH溶液中，然后将2-甲基-4-氯卞氨的四氢呋喃溶液缓慢滴加入3-氨基戊烷的氢氧化钠溶液中，加毕，油浴85℃回流反应4h，TLC法检测，反应完全后，将反应液减压蒸馏，去除四氢呋喃，往剩余物中加入100mL水，用石油醚提取4次(每次使用石油醚200mL)，取水相，用2mol/L的盐酸将水相的pH值调到6.5，再用乙酸乙酯提取4次(每次使用乙酸乙酯200mL)，合并有机相，浓缩至溶液体积至200mL左右，加入硅胶，拌样，干法上样过柱，用乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)冲出产品，脱溶得黄褐色油状液体4.2g，即为半抗原前体(式C)。

将半抗原前体4.2g溶于吡啶中，加入2.82g丁二酸酐，75℃反应过夜，TLC法检测，反应完全后，减压蒸馏，蒸干后，剩余物中加入甲苯，再次蒸干，充分去除吡啶，将剩余物溶于乙酸乙酯，湿法上样过柱，采用乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚＝2:1)冲出主要紫外点的组分，得淡黄色油装液体3.1g，即为二甲戊灵半抗原。经高效液相色谱测定，半抗原的纯度为92.1％，图1为所得二甲戊灵半抗原的核磁共振氢谱图，根据图1可以确定，产物具有目标结构。

二甲戊灵包被原的合成：

将12mg二甲戊灵半抗原溶于200μL DMF中，加入5mg NHS以及15mg DCC，25℃反应过夜，次日，将反应液离心，取上清液(即半抗原活化液)备用。另将30mg OVA溶于2mL、0.02mol/L的PBS缓冲液中，澄清后，缓慢滴加半抗原活化液，加毕，25℃反应4h，然后将反应液离心，取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PBS缓冲液，每8h更换一次透析液，透析结束后，将产物收集，低温冻存备用。

二甲戊灵免疫原的合成：

将12mg半抗原溶200μL DMF中，加入5mg NHS以及15mg EDC，25℃反应过夜，次日，将反应液离心，取上清液(即半抗原活化液)备用。另将44mg BSA溶于2mL、0.02mol/L的PB缓冲液中，澄清后，缓慢滴加半抗原活化液，加毕，25℃反应4h，然后将反应液离心，取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PB缓冲液，每8h更换一次透析液，透析结束后，将产物收集，低温冻存备用。

实施例2

二甲戊灵半抗原的合成：

将100mL浓硫酸分批缓慢加入6.21g 2-甲基-4-氯卞氨中，加毕，室温搅拌30min，缓慢滴加36mL浓硫酸和发烟硝酸的混合物，混合物中浓硫酸和发烟硝酸的体积比为1:1，加毕后油浴45℃反应2h，然后升温至60℃反应4h，TLC法检测反应完全后，将反应液倒入冰块中，析出大量固体，抽滤，用1wt％的NaOH溶液洗涤滤饼，直到洗出液PH为中性，将滤饼放置于空气中干燥，得到白色固体6.19g，即为二硝基-2-甲基-4-氯卞氨(式B)。

将二硝基-2-甲基-4-氯卞氨6.19g溶于200mL干燥的四氢呋喃中，另将3.62g 3-氨基戊烷溶于2mol/L的NaOH溶液中，然后将二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的四氢呋喃溶液缓慢滴加入3-氨基戊烷的氢氧化钠溶液中，加毕，油浴85℃回流反应4h，TLC法检测，反应完全后，将反应液减压蒸馏，去除四氢呋喃，往剩余物中加入100mL水，用石油醚提取4次(每次使用石油醚200mL)，取水相，用2mol/L的盐酸将水相的pH调到6.5，再用乙酸乙酯提取4次(每次使用乙酸乙酯200mL)，合并有机相，浓缩至溶液还剩200mL左右，加入硅胶，拌样，干法上样过柱，用乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)冲出产品，脱溶得黄褐色油状液体5.42g，即为半抗原前体(式C)。

将半抗原前体4.2g溶于吡啶中，加入2.82g丁二酸酐，75℃反应过夜，TLC法检测，反应完全后，减压蒸馏，蒸干后，剩余物中加入甲苯，再次蒸干，充分去除吡啶，将剩余物溶于乙酸乙酯，湿法上样过柱，乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚＝2:1)冲出主要紫外点的组分，得淡黄色油装液体4.36g，即为二甲戊灵半抗原，经高效液相色谱测定，二甲戊灵半抗原的纯度为94.8％。

二甲戊灵包被原的合成：

将15mg二甲戊灵半抗原溶于220μL DMF中，加入5mg NHS以及15mg DCC，25℃反应过夜，次日，将反应液离心，取上清液(即半抗原活化液)备用。另将37.5mg OVA溶于2mL、0.02mol/L的PBS缓冲液中，澄清后，缓慢滴加即半抗原活化液，加毕，25℃反应4h，然后将反应液离心，取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PBS溶液，每8h更换一次透析液，透析结束后，将产品收集，低温冻存备用。

5：免疫原的合成

将15mg二甲戊灵半抗原溶于220μL DMF中，加入5mg NHS以及14.5mg EDC，25℃反应过夜，次日，将反应液离心，取上清液(即半抗原活化液)备用。另将56mg BSA溶于2mL、0.02mol/L的PB缓冲液中，澄清后，缓慢滴加半抗原活化液，加毕，25℃反应4h，然后将反应液离心，取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PB缓冲液，每8h更换一次透析液，透析结束后，将抗原收集，低温冻存备用。

实施例3

二甲戊灵半抗原的合成：

将100mL浓硫酸分批缓慢加入5.09g 2-甲基-4-氯卞氨中，加毕，室温搅拌30min，缓慢滴加36mL浓硫酸和发烟硝酸的混合物，混合物中浓硫酸和发烟硝酸的体积比为1:1，加毕后油浴45℃反应2h，然后升温至60℃反应4h，TLC法检测反应完全后，将反应液倒入冰块中，析出大量固体，抽滤，用1wt％的NaOH溶液洗涤滤饼，直到洗出液pH为中性，将滤饼放置于空气中干燥，得到白色固体5.02g，即为二硝基-2-甲基-4-氯卞氨(式B)。

将二硝基-2-甲基-4-氯卞氨5.02g溶于200mL干燥的四氢呋喃中，另将2.73g 3-氨基戊烷溶于2mol/L的NaOH溶液中，然后将二硝基-2-甲基-4-氯卞氨的四氢呋喃溶液缓慢滴加入3-氨基戊烷的氢氧化钠溶液中，加毕，油浴85℃回流反应4h，TLC法检测，反应完全后，将反应液减压蒸馏，去除四氢呋喃，往剩余物中加入100mL水，用石油醚提取4次(每次使用石油醚200mL)，取水相，用2mol/L的盐酸将水相的pH调到6.5，再用乙酸乙酯提取4次(每次使用乙酸乙酯200mL)，合并有机相，浓缩至溶液还剩200mL左右，加入硅胶，拌样，干法上样过柱，用乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)冲出产品，脱溶得黄褐色油状液体2.24g，即为半抗原前体(式C)。

将半抗原前体2.24g溶于吡啶中，加入1.62g丁二酸酐，75℃反应过夜，TLC法检测，反应完全后，减压蒸馏，蒸干后，剩余物中加入甲苯，再次蒸干，充分去除吡啶，将剩余物溶于乙酸乙酯，湿法上样过柱，用乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚＝2:1)冲出主要紫外点的组分，得淡黄色油装液体1.89g，即为二甲戊灵半抗原，经高效液相色谱测定，二甲戊灵半抗原的纯度为96.3％。

二甲戊灵包被原的合成：

将11mg二甲戊灵半抗原溶于200μL DMF中，加入3.83mgNHS以及11.5mg DCC，25℃反应过夜，次日，将反应液离心，取上清液(即半抗原活化液)备用。另将27.7mg OVA溶于2mL、0.02mol/L的PBS缓冲液中，澄清后，缓慢滴加半抗原活化液，加毕，25℃反应4h，然后将反应液离心，取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PBS溶液，每8h更换一次透析液，透析结束后，将产物收集，低温冻存备用。

二甲戊灵免疫原的合成：

将11mg二甲戊灵半抗原溶于200μL DMF中，加入3.83mg NHS以及10.7mg EDC，25℃反应过夜，次日，将反应液离心，取上清液(即半抗原活化液)备用。另将30mg BSA溶于2mL、0.02mol/L的PB缓冲液中，澄清后，缓慢滴加半抗原活化液，加毕，25℃反应4h，然后将反应液离心，取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/lPB，每8h更换一次透析液，透析结束后，将产物收集，低温冻存备用。

测试例1ELISA测试

对小鼠进行免疫：

选择纯种BALB/c小鼠15只，年龄4-6周，分别用不同颜色标注1-5号，取6只2mL体积注射器，3支吸取不完全弗氏佐剂0.5mL，另3只分别吸取含有二甲戊灵免疫原50μg、100μg、200μg的二甲戊灵免疫原溶液0.5mL(用灭菌后1％氯化钠溶液稀释)，分别标注好号后一支不完全弗氏佐剂注射器和一支免疫原注射器的注射头用输液管连接一起(长度以把两个注射器头连接对在一起为宜)，然后两只手分别来回推注射器直至完全乳化(乳化标注为内部液体为白色乳状，推动过程中能感觉稍微阻力，滴水中成小滴不扩散)，乳化过程中直至乳化好中途不能停止，否则无法乳化好。乳化完成后，对小鼠进行皮下(背部和腹部)多点注射，每只小鼠大概注射0.2mL左右。同样方法每间隔2周重复一次，完成3次后开始进行采血测试；

采血方法：左手拇指、食指和中指抓取小鼠的颈部头皮，小指和无名指固定尾巴；轻压需要摘取的眼部皮肤，使眼球充血突出；用玻璃毛细管从小鼠眼球突出处垂直插入，轻轻左右转动，直至毛细管中流入血(大概毛细管2/3处)，取出用洗耳球把毛细管中血吹入0.5mL离心管中(低温存放)；采血完成后放入37℃烤箱烤30min，后放入低温高速离心机中(10000转/min)离心10min，分离出血清用于ELISA方法测试。

单抗制备过程：

细胞融合

采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

选择性培养

选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

单克隆抗体的大量制备

取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

ELISA测试使用到的试剂配方如下：

封闭液(1L体积)：脱脂奶粉2.5g，氯化钠8g，磷酸二氢钾0.6g，磷酸氢二钠5.8g，蔗糖50g，氯化钾0.9g，防腐剂0.5mL，牛血清50mL，余量为水。

酶稀(16L)：氯化钠128g，磷酸二氢钾9.48g，磷酸氢二钠92.8g，甘油800mL，牛血清3200mL，防腐剂12mL，余量为水。

样稀(4L)：氯化钠23.38g，氯化钾0.118g，磷酸二氢钾3.48g，磷酸二氢钠2.19g，磷酸氢二钠20.64g，曲拉通40mL，防腐剂1.5mL，余量为水。

底物A液(100mL)：柠檬酸0.48g，过氧化尿素0.05g，冰醋酸90mL，余量为水。

底物B液(400mL)：柠檬酸0.164g，盐酸盐TMB 0.2g，N-N 4mL，甲醇14mL，1mol/L盐酸160μL，余量为水。

20×浓缩洗液(40L)：氯化钠2560g，磷酸氢二钠928g，磷酸二氢钾80g，氯化钾1.44g，防腐剂12mL，吐温20 800mL，余量为水。

具体测试方法如下：

(1)抗原包被：用CB缓冲液把二甲戊灵包被原稀释为1K比例，稀释后按100μL/孔加入酶标板微孔板中，盖盖板膜放37℃中包被2h。

(2)封闭：包被完后取出泼掉包被液后用洗涤工作液(20×浓缩洗液稀释为1×)，250μL/孔或用洗壶洗1次，浸泡30s，泼掉后用吸水纸或毛巾拍干，加入封闭液150μL/孔，放入37℃恒温培养箱中反应2h，取出泼掉封闭液拍干待用。

(3)不同标准品浓度的稀释：用0.02mol/LPBS缓冲液把直接购买的100μg/mL的二甲戊灵高标稀释成0ppb(直接为PBS缓冲液)、1ppb、10ppb、20ppb。

(4)酶标二抗工作液的稀释：用酶稀缓冲液把直接把购买酶标二抗原液稀释成1:1K的浓度。

(5)血清或单抗工作液的稀释：用样稀缓冲液把血清或制备单抗按1:1K、1:5K、1:1W、1:2W的浓度进行稀释。

(6)检测步骤：按棋盘法方案进行测试，具体操作步骤如下：

1)加标准品/样本：加入标准品/样本50μL到对应的微孔中。

2)加血清或单抗工作液：加血清或单抗工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。

3)洗板加酶二抗工作液：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)，加酶标二抗工作液100μL/孔，用盖板膜盖板后置于37℃避光环境中反应30min。

4)洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。

5)显色：加入底物A液和B液各50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15min。

6)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

在满足相关技术参数情况下，OD值为2.0左右时，抗体的最大稀释倍数为抗体效价；以标准品浓度为横坐标，以对应吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算二甲戊灵的半数抑制浓度(IC

测试结果如表1～表6所示。

表1 1免疫后采血清测试数据

表2 2免疫后采血清测试数据

表3 3免疫后采血清测试数据

表4 4免疫后采血清测试数据

表5 采全血清测试数据

/>

表6 制备单抗测试数据

根据表1～表4中的数据可以看出，随着免疫次数的增加，血清中二甲戊灵抗体的浓度逐渐增加；根据表5中的数据可以看出，血清中二甲戊灵浓度已经基本达到1W，IC

测试例2胶体金测试

测试方法如下：

(1)划板：用pH值为7.2，0.1mol/L的PB缓冲液按照1:10,1:20,1:50,1:100的比例分别稀释包被抗原，作为T线包被液，用pH值为7.2，0.02mol/L的PB+10％BSA缓冲液按照1:60稀释二抗作为C线包被液，均按1μL/cm量进行划板，划完后放37℃烤12h(背板用上海杰一30*6cm

(2)金标垫处理标准：上海杰一普通玻璃纤维切成30*1cm

(3)样品垫处理标准：上海捷宁SF-06无纺布切成30*1.7cm

(4)标金：用纯净水先将血清或单抗进行1:10倍稀释混匀，分别取4管1mL 40nm大小颗粒的胶体金溶液，分别加入0.02mol/L的K

(5)干烟叶样品前处理方法

1)检测前将干烟叶样品烘干后粉成细粉。

2)称取1±0.05g样品放至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL甲醇中，盖上盖子，手动振荡30s，静置分层。

3)取样品上清液100μL加入2mL聚苯乙烯离心管中，加入400μL稀释液(pH7.2，0.02mol/L的PB)，振荡混匀即为样品待检液。

(6)干烟叶样品检测方法

1)取全部样品待检液垂直滴于加样孔中；

2)液体流动时开始计时，反应10min，利用分析软件、胶体金读数仪或目测判读结果；本发明采用5个干烟叶样品，分别记为1#、2#、3#、4#和5#；在干烟叶样品中添加二甲戊灵标准品，控制1g干烟叶中二甲戊灵的添加浓度分别为0ppb、10ppb、20ppb和40ppb。

测试结果如表7所示。

表7 制备单抗制备胶体金干烟叶检测限测试数据

取干烟叶样品2#，进行5次平行测试，测试结果见表8。

表8 制备单抗制备胶体金干烟叶平行性测试数据

表7中的结果表明，采用本发明的制备单抗制备胶体金，对干烟叶样品中二甲戊灵的最低检测限为10ng/g左右，灵敏度高；根据表8中的数据可以看出，本发明提供的检测方法平行性好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。