微生物来源材料及其生产方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年2月22日提交的题目为“微生物来源材料及其生产方法”的美国临时专利申请号63/152,142的优先权权益，其内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及微生物来源材料的分离过程，包括从细菌、真菌和微藻中分离蛋白质，以及包含微生物来源材料和源于细菌、真菌和/或微藻的蛋白质的组合物。

背景技术

由于人口的不断增长，可替代肉类和奶制品来源的另外食物来源的需求正在增长，尤其是生产便宜但是提供高营养价值的食物来源。此外，肉类生产，对温室气体的排放有很大影响，并且对同样美味和有营养但是生产对环境伤害更少的新食品存在需求。

消费者越来越多地追求高质量、天然和正宗。然而，肉类替代品被视为高度加工的产品。对能提供传统动物产品的味道、质地和感官体验，同时使用便宜的、广泛可获得的天然富含蛋白质的资源的的食物产品替代品的需求仍然很大。此外，对从微生物中处理和分离单细胞蛋白以用于肉类替代产品的高效和简单的方法仍然有很大的需求。

发明内容

在本发明的一个方面，提供了一种用于优化从包含细胞壁的微生物中提取的蛋白质含量的方法，所述方法包括：a)破碎微生物的细胞壁至适合酶促反应的颗粒尺寸；和b)接收包含可溶性蛋白质的第一级分和包含不可溶性蛋白质的第二级分，其中第一和第二级分中的任何一个都含有按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量，从而优化从包含细胞壁的微生物中提取的蛋白质含量。

在一些实施方式中，适合酶促反应的颗粒尺寸在2μm至10μm之间。

在一些实施方式中，对于微生物破碎细胞壁包括应用以下任何一种：a)压力在150巴到1500巴之间；b)温度在50℃至100℃之间；c)超声波处理；d)珠磨机均质化，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述第一级分、所述第二级分或两者都适用于挤出。

在一些实施方式中，所述微生物是细菌、真菌或微藻。

在一些实施方式中，所述真菌是酵母。

在一些实施方式中，所述酵母包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyceschattanoogensis)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、高里假丝酵母(Candida guilliermondii)、脂溢假丝酵母(Candidalipolityca)、杰丁塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera jadinii)、毕赤酵母(Pichiapastoris)或者其任何组合。

在一些实施方式中，所述酵母源于下游的食物相关行业。

在一些实施方式中，所述酵母包括废酵母、速发酵母、非活性酵母、活酵母或其任何组合。

在一些实施方式中，第一级分和第二级分包括特征在于平均颗粒尺寸在1μm至100μm之间的颗粒。

在一些实施方式中，所述蛋白质的特征在于分子量在1kDa至250kDa之间。

在一些实施方式中，所述不可溶性蛋白质的特征在于水溶解度小于300g/L。

在一些实施方式中，所述施加压力包括高压均质化。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括包含从细胞壁中去除纤维或其部分的步骤。

在一些实施方式中，去除纤维包括化学水解、酶水解或两者。

在一些实施方式中，所述酶水解包括使微生物与酶接触，其中所述酶选自：脂酶、磷脂酶、多聚半乳糖醛酸酶、几丁质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、聚阿拉伯糖酶(arabinanase)、果胶酶、内切淀粉酶、内切-β-聚糖酶、水解酶、纤维素、阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶、外切-内切-蛋白酶，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述酶包括磷脂酶、聚半乳糖醛酸酶、几丁质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶和聚阿拉伯糖酶。

在一些实施方式中，所述酶水解在pH3.5至7之间进行。

在一些实施方式中，所述方法包括重复施加150巴到1500巴之间的压力。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括步骤：包括对微生物清洗、研磨、磨碎、洗涤、干燥，或其任何组合。

在一些实施方式中，第一级分和第二级分中任何一个的形式是粉末、溶液、悬浮液，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括步骤：包括从第一级分、第二级分或两者分离、净化、浓缩蛋白质，或其任何组合。

在本发明的一个方面，提供了组合物，其包括第一级分、第二级分或两者，它们源于包括细胞壁的微生物并且包括通过本发明的方法得到的按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量。

在本发明的一个方面，提供了一种组合物，其包括按干重计50％以上的源于含细胞壁的微生物的蛋白质。

在一些实施方式中，所述蛋白质的特征在于分子量在1kDa至250kDa之间。

在一些实施方式中，所述组合物的特征在于水溶解度小于300g/L。

在一些实施方式中，所述蛋白质的特征在于表13中展示了的氨基酸谱。

在一些实施方式中，所述组合物是粉末形式，其特征在于平均颗粒尺寸在1μm至100μm之间。

在一些实施方式中，所述组合物包括按干重计在5％至20％之间的纤维含量。

在一些实施方式中，所述组合物包括少于5％的灰分含量。

在一些实施方式中，所述组合物的特征在于其蛋白质消化率校正的氨基酸评分(PDCAAS)在0.7至1之间。

在一些实施方式中，所述微生物是细菌、真菌或微藻。

在一些实施方式中，所述真菌是酵母。

在一些实施方式中，所述酵母包括酿酒酵母、纳塔尔链霉菌、恰塔努加链霉菌、脆壁酵母、产朊假丝酵母、高里假丝酵母、脂溢假丝酵母、杰丁塞伯林德纳氏酵母、毕赤酵母，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述酵母源于下游的食物相关产业。

在一些实施方式中，所述酵母包括废酵母、速发酵母、非活性酵母、活酵母，或其任何组合。

在本发明的一个方面，提供了一种包含本发明组合物的食物产品。

在一些实施方式中，所述食物产品的特征在于适合作为肉类、蛋类、芝士、乳制品、肉类替代产品、素食产品或其任何组合的等效产品使用。

除非另有定义，本文所用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同含义。尽管与本文描述相似或等同的方法和材料可以被用在本发明实施方式的实践或测试中，但下面描述示例性方法和/或材料。如果发生冲突，将遵循专利说明书，包括定义。此外，材料、方法和例子仅是说明性的并且不意欲作为必定的限制。

进一步的实施方式和本发明的适用性的所有范围将在下文给出的详细描述中变得显而易见。然而，应当理解，由于从本文详细的描述中在本发明的精神和范围内各种变化和变型对本领域技术人员将变得显而易见，因此虽然指出了本发明优选的实施方式，但详细描述和具体例子仅以说明性方式给出。

附图说明

图1A-B包括蛋白质含量随高压均质实验进展的条形图(相比于DM)(图1A)和蛋白质含量随水解和均质实验进展的条形图(相比于DM)(图1B)。

具体实施方式

本发明涉及一种优化从含细胞壁的微生物中提取的蛋白质含量的方法。本发明涉及一种通过破碎微生物细胞壁至适合酶促反应的颗粒尺寸而从含细胞壁的微生物中分离蛋白质的方法。本发明涉及一种通过接收包含可溶性蛋白质的第一级分和包含不可溶性蛋白质的第二级分而从含细胞壁的微生物中分离蛋白质的方法，其中第一和第二级分中的任何一个都含有按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量。

在一些实施方式中，所述微生物是细菌、真菌或微藻。在一些实施方式中，所述真菌是酵母。

在一些实施方式中，提供了一种从包含按重量计在酵母材料的10％至90％之间的蛋白质含量的酵母中获得酵母材料方法。

本发明部分地基于以下发现：包含按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量的第一级分和第二级分的任何一个适合于挤出。

本发明部分地基于以下发现：使用特定条件破坏微生物细胞壁至适合酶促反应的颗粒尺寸，提供了从微生物中分离的最终蛋白质含量的提升。在一些实施方式中，本文提供的条件提供了蛋白质含量和纯度提升的组合物。在一些实施方式中，本文提供的条件提供了乳化能力提升的组合物。如本文所用的“乳化能力”是指组合物形成基本稳定乳状液的能力。在一些实施方式中，术语“稳定”是指组合物基本保持其结构、物理和/或化学特性的能力。在一些实施方式中，术语“稳定”是指没有相分离、沉淀和/或分解的乳状液。在一些实施方式中，所述乳状液是水包油乳状液。在一些实施方式中，本文描述的组合物能够形成特征在于小液滴大小的乳状液。在一些实施方式中，小液滴随时间是稳定的。

本发明还涉及了一种组合物，其包括第一级分和第二级分或两者，它们来源于含细胞壁的微生物并且包含按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量。

方法

根据一些实施方式，提供了一种从含细胞壁的微生物分离蛋白质的方法。在一些实施方式中，方法包括对微生物施加150巴到1500巴之间的压力，并且接收包含可溶性蛋白质的第一级分和包含不可溶性蛋白质的第二级分。

根据一些实施方式，提供了一种优化从含细胞壁的微生物中提取的蛋白质含量的方法，所述方法包括：a)破碎微生物的细胞壁至适合酶促反应的颗粒尺寸；和b)接收包含可溶性蛋白质的第一级分和包含不可溶性蛋白质的第二级分，其中第一和第二级分中的任何一个都含有按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量，从而优化从包含细胞壁的微生物中提取的蛋白质含量。

在一些实施方式中，所述方法包括对微生物施加的压力在100巴至1500巴之间、150巴至1500巴之间、250巴至1500巴之间、450巴至1500巴之间、490巴至1500巴之间、500巴至1500巴之间、550巴至1500巴之间、700巴至1500巴之间、1000巴至1500巴之间、100巴至1200巴之间、150巴至1200巴之间、250巴至1200巴之间、450巴至1200巴之间、490巴至1200巴之间、500巴至1200巴之间、550巴至1200巴之间、700巴至1200巴之间、1000巴至1200巴之间、50巴至900巴之间、100巴至900巴之间、250巴至900巴之间、450巴至900巴之间、490巴至900巴之间、500巴至900巴之间、550巴至900巴之间、700巴至900巴之间、450巴至700巴之间、490巴至700巴之间、500巴至700巴之间或550巴至700巴之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，第一和第二级分的任何一个包含按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量。

在一些实施方式中，第一和第二级分的任何一个按重量计包含的蛋白质含量在级分的10％至90％之间、12％至90％之间、15％至90％之间、20％至90％之间、50％至90％之间、50％至90％之间、10％至85％之间、12％至85％之间、15％至85％之间、20％至85％之间、50％至85％之间、50％至85％之间、10％至80％之间、12％至80％之间、15％至80％之间、20％至80％之间、50％至80％之间、50％至80％之间、10％至75％之间、12％至75％之间、15％至75％之间、20％至75％之间、50％至75％之间或50％至75％之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，适合酶促反应的颗粒尺寸在2μm至10μm之间、3μm至10μm之间、4μm至10μm之间、5μm至10μm之间、6μm至10μm之间、2μm至7μm之间、3μm至7μm之间、4μm至7μm之间或2μm至5μm之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，对微生物破碎细胞壁包括应用以下任何一种：a)压力在150巴到1500巴之间；b)温度在50℃至100℃之间；c)超声波处理；d)珠磨机均质化，或其任何组合。

根据一些实施方式，提供了一种从含细胞壁的微生物分离蛋白质的方法，包括对微生物施加在150巴到1500巴之间的压力，以及接收包含可溶性蛋白质的第一级分和包含不可溶性蛋白质的第二级分，其中第一和第二级分中的任何一个都含有按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量，从而从含细胞壁的微生物分离蛋白质。

在一些实施方式中，第一级分、第二级分或两者适合挤出。

如本文所用的，术语“挤出”是指将各种原料和成分转化为改性的中间产品和成品的高温、高压、短时间过程。

在一些实施方式中，所述微生物是细菌、真菌或微藻。

根据本发明的合适细菌的非限制性例子包括乳杆菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、乳球菌(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)、气球菌(Aerococcus)、肉杆菌(Carnobacterium)、肠球菌(Enterococcus)、酒球菌(Oenococcus)、芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus)、四联球菌(Tetragenococcus)、漫游菌(Vagococcus)、魏斯氏菌(Weissella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、醋酸菌(Acetobacte)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、黄芽孢杆菌(Anoxybacillusflavithermus)、地芽胞杆菌(Geobacillus)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)，或其任何组合。

如本文所用的，术语“微藻”意义是任何单细胞的、光合微生物，无论是野生型还是基因修饰微藻。

如本文所用的，“真菌”是指真核生物组的任何成员，其包括微生物例如酵母、霉菌和蘑菇。

在一些实施方式中，所述真菌包括菌丝或是产生菌丝的微生物。非限制性的例子包括丝状真菌镰刀菌(Fusarium venenatum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、紫红曲霉(Monascus purpureus)、中间脉孢菌(Neurospora intermedia)和接合菌(Zygomycota)(米根霉(Rhizopus oryzae))。

在一些实施方式中，所述真菌是酵母。

如本文所用的，术语“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的真核的、单细胞微生物。示例性的酵母是酵母菌目Saccharomycetales的出芽酵母(budding yeast)。酵母的具体例子是酵母菌属(Saccharomyces spp.)，包括但是不限制于酿酒酵母。在一些实施方式中，所述酵母包括酿酒酵母、纳塔尔链霉菌、恰塔努加链霉菌、脆壁酵母、产朊假丝酵母、高里假丝酵母、脂溢假丝酵母、杰丁塞伯林德纳氏酵母、毕赤酵母，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述酵母源于下游食物相关行业。在一些实施方式中，所述酵母材料源于下游啤酒。在一些实施方式中，所述酵母材料源于下游酵母提取物。在一些实施方式中，所述酵母包括废酵母、速发酵母、非活性酵母、活酵母，或其任何组合。

在一些实施方式中，第一级分和第二级分的任何一个包括颗粒，其特征在于平均颗粒尺寸在1μm至100μm之间、1μm至95μm之间、1μm至90μm之间、1μm至89μm之间、1μm至80μm之间、1μm至50μm之间、2μm至50μm之间、3μm至50μm之间、4μm至50μm之间、5μm至50μm之间、6μm至50μm之间、1μm至40μm之间、2μm至40μm之间、3μm至40μm之间、4μm至40μm之间、5μm至40μm之间、6μm至40μm之间、1μm至10μm之间、2μm至10μm之间、3μm至10μm之间、4μm至10μm之间、5μm至10μm之间、6μm至10μm之间、1μm至9μm之间、2μm至9μm之间、3μm至9μm之间、4μm至9μm之间、5μm至9μm之间、6μm至9μm之间、1μm至8μm之间、2μm至8μm之间、3μm至8μm之间、4μm至8μm之间、5μm至8μm之间、6μm至8μm之间、1μm至6μm之间、2μm至6μm之间、3μm至6μm之间或4μm至6μm之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，第一级分和第二级分的任何一个包括颗粒，其特征在于最大颗粒尺寸在1μm至100μm之间、1μm至95μm之间、1μm至90μm之间、1μm至89μm之间、1μm至80μm之间、1μm至50μm之间、2μm至50μm之间、3μm至50μm之间、4μm至50μm之间、5μm至50μm之间、6μm至50μm之间、1μm至40μm之间、2μm至40μm之间、3μm至40μm之间、4μm至40μm之间、5μm至40μm之间、6μm至40μm之间、1μm至10μm之间、2μm至10μm之间、3μm至10μm之间、4μm至10μm之间、5μm至10μm之间、6μm至10μm之间、1μm至9μm之间、2μm至9μm之间、3μm至9μm之间、4μm至9μm之间、5μm至9μm之间、6μm至9μm之间、1μm至8μm之间、2μm至8μm之间、3μm至8μm之间、4μm至8μm之间、5μm至8μm之间、6μm至8μm之间、1μm至6μm之间、2μm至6μm之间、3μm至6μm之间或4μm至6μm之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述蛋白质的特征在于分子量在1kDa至250kDa之间、5kDa至250kDa之间、10kDa至250kDa之间、15kDa至250kDa之间、20kDa至250kDa之间、25kDa至250kDa之间、30kDa至250kDa之间、1kDa至200kDa之间、5kDa至200kDa之间、10kDa至200kDa之间、15kDa至200kDa之间、20kDa至200kDa之间、25kDa至200kDa之间或30kDa至200kDa之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，不可溶性蛋白质的特征在于水溶解度小于300g/L、小于280g/L、小于250g/L、小于220g/L、小于200g/L、小于150g/L、小于100g/L，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

根据一些实施方式，提供了一种从酵母中获得包含按重量计在酵母材料的10％至90％之间的蛋白质含量的酵母材料的方法。在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：a.提供酵母；和b.对酵母施加150巴至1500巴之间的压力，从而从酵母中获得酵母材料。

如本文所用的术语“酵母材料”是指由构成酵母、由酵母分泌、衍生或产生的任何化合物。在一些实施方式中，酵母材料是碳基材料。

在一些实施方式中，所述酵母材料包括：全酵母、酵母提取物、酵母生物质、酵母匀浆物、酵母滤液、酵母浓缩物、其任何级分，或其任何组合。在一些实施方式中，所述酵母材料选自：全酵母、酵母生物质、酵母滤液、酵母浓缩物、其任何级分，以及其任何组合。在一些实施方式中，酵母材料包括或由全酵母组成。在一些实施方式中，酵母材料没有酵母提取物。

在一些实施方式中，所述酵母材料包括粉末、溶液、悬浮液，或其任何组合。

在一些实施方式中，步骤b包括向酵母施加以下压力：在100巴至1500巴之间、150巴至1500巴之间、250巴至1500巴之间、450巴至1500巴之间、490巴至1500巴之间、500巴至1500巴之间、550巴至1500巴之间、700巴至1500巴之间、1000巴至1500巴之间、100巴至1200巴之间、150巴至1200巴之间、250巴至1200巴之间、450巴至1200巴之间、490巴至1200巴之间、500巴至1200巴之间、550巴至1200巴之间、700巴至1200巴之间、1000巴至1200巴之间、100巴至900巴之间、150巴至900巴之间、250巴至900巴之间、450巴至900巴之间、490巴至900巴之间、500巴至900巴之间、550巴至900巴之间、700巴至900巴之间、450巴至700巴之间、490巴至700巴之间、500巴至700巴之间或550巴至700巴之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述酵母材料包含的蛋白质含量按重量计在酵母材料的10％至90％之间、12％至90％之间、15％至90％之间、20％至90％之间、50％至90％之间、50％至90％之间、10％至85％之间、12％至85％之间、15％至85％之间、20％至85％之间、50％至85％之间、50％至85％之间、10％至80％之间、12％至80％之间、15％至80％之间、20％至80％之间、50％至80％之间、50％至80％之间、10％至75％之间、12％至75％之间、15％至75％之间、20％至75％之间、50％至75％之间或50％至75％之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述酵母材料包含的氮含量按重量计在酵母材料的1％至15％之间、4％至15％之间、5％至15％之间、6％至15％之间、7％至15％之间、1％至10％之间、4％至10％之间、5％至10％之间、6％至10％之间、7％至10％之间、4％至7％之间或5％至7％之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述酵母材料是通过施加150巴至1500巴的压力从固体级分获得的。在一些实施方式中，通过施加150巴至1500巴的压力从固体级分获得的酵母材料包含按重量计在酵母材料的40％至70％之间的蛋白质含量。在一些实施方式中，通过氮含量的换算计算蛋白质含量。在一些实施方式中，通过使用6.25的氮-蛋白质折算系数计算蛋白质含量。

在一些实施方式中，所述酵母材料是通过施加250巴至700巴的压力从固体级分获得的。在一些实施方式中，通过施加250巴至700巴的压力从固体级分获得的酵母材料包含按重量计在酵母材料的15％至50％之间的蛋白质含量。在一些实施方式中，通过氮含量的换算计算蛋白质含量。在一些实施方式中，通过使用6.25的氮-蛋白质折算系数计算蛋白质含量。

在一些实施方式中，所述酵母材料适合挤出。

在一些实施方式中，所述酵母材料的特征在于平均颗粒尺寸在1μm至100μm之间、1μm至95μm之间、1μm至90μm之间、1μm至89μm之间、1μm至80μm之间、1μm至50μm之间、2μm至50μm之间、3μm至50μm之间、4μm至50μm之间、5μm至50μm之间、6μm至50μm之间、1μm至40μm之间、2μm至40μm之间、3μm至40μm之间、4μm至40μm之间、5μm至40μm之间、6μm至40μm之间、1μm至10μm之间、2μm至10μm之间、3μm至10μm之间、4μm至10μm之间、5μm至10μm之间、6μm至10μm之间、1μm至9μm之间、2μm至9μm之间、3μm至9μm之间、4μm至9μm之间、5μm至9μm之间、6μm至9μm之间、1μm至8μm之间、2μm至8μm之间、3μm至8μm之间、4μm至8μm之间、5μm至8μm之间、6μm至8μm之间、1μm至6μm之间、2μm至6μm之间、3μm至6μm之间或4μm至6μm之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，施加压力包括高压均质化。

如本文所用的，术语“高压均质化”是指将样品(主要是液体样品)强制通过一个系统的过程，该系统使样品受到多种力中的任何一种力，目的是使样品均质化和/或减小样品中任何组分的颗粒尺寸。取决于特定系统的设置，高压均质化可以在剪切力、冲击和空化的任何组合下进行和操作。在一些实施方式中，可以通过阀门(均质阀)或通过在压力的施加下研磨细胞来实施所述过程。

如本文使用的术语“研磨”是指将外力施加在固体上使其分裂成更小颗粒的方法。在一个实施方式中，研磨是指湿磨，其使用以下方法进行：如辊式软膏磨机、滚筒球磨机、振动球磨机、行星式球磨机、离心流体磨机、搅拌珠磨机、流动导管珠磨机、环形间隙珠磨机和湿式喷流磨机。在一个实施方式中，研磨是指通过压缩或摩擦进行干磨，其使用的方法例如喷流磨机、锤式磨机、剪切磨机、辊磨机、剪切冲击磨机、球磨机和滚筒磨机。在一个实施方式中，研磨是指防止如此形成的颗粒凝结并获得高度分散的颗粒的湿法加工。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括包含从细胞壁或其部分中去除纤维的步骤。

在一些实施方式中，从细胞壁或其部分中去除纤维的步骤在施加压力之前、在施加压力的期间或者在施加压力之后进行，其中施加的压力如上文所描述。

在一些实施方式中，去除纤维包括化学水解、酶水解，或两者。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括水解步骤。在一些实施方式中，所述方法进一步包括酶水解步骤。

在一些实施方式中，所述酶水解包括使微生物与酶接触，其中所述酶选自：脂酶、磷脂酶、多聚半乳糖醛酸酶、几丁质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、聚阿拉伯糖酶、果胶酶、内切淀粉酶、内切-β-聚糖酶、水解酶、纤维素、阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶、外切-内切-蛋白酶，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括步骤：包括将酵母材料与酶接触。在一些实施方式中，所述酶选自脂肪酶、磷脂酶、多聚半乳糖醛酸酶、几丁质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、聚阿拉伯糖酶、果胶酶、内切淀粉酶、内切-β-聚糖酶、水解酶、纤维素、阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶、外切-内切-蛋白酶，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述酶包括磷脂酶、多聚半乳糖醛酸酶、几丁质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶和聚阿拉伯糖酶。在一些实施方式中，所述酶包括i.磷脂酶和ii.多聚半乳糖醛酸酶、几丁质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶和聚阿拉伯糖酶。在一些实施方式中，以1:1的重量/重量比使用i.磷脂酶和ii.多聚半乳糖醛酸酶、几丁质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶和聚阿拉伯糖酶。

在一些实施方式中，所述酶水解以pH3.5至7之间、4至7之间、4.5至7之间、3.5至6.5之间、4至6.5之间或4.5至6.5之间进行，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述方法包括重复施加150巴到1500巴之间的压力。在一些实施方式中，所述方法包括重复施加150巴到1500巴之间的压力1至5次之间、1至4次之间、1至3次之间、1至2次之间、2至5次之间、2至4次之间、2至3次之间、3至5次之间或3至4次之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，第一级分和第二级分被分离。在一些实施方式中，第一级分和第二级分通过相分离被分离。相分离可以通过本领域技术人员任何已知的方法进行。在一些实施方式中，相分离可以通过离心沉淀进行。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括酶失活步骤。酶失活是本领域技术人员众所周知的。在一些实施方式中，酶失活进行的温度在50℃至100℃之间、60℃至100℃之间、65℃至100℃之间、70℃至100℃之间、75℃至100℃之间、80℃至100℃之间、85℃至100℃之间或90℃至100℃之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括步骤：包括对微生物清洗、研磨、磨碎、洗涤、干燥或其任何组合。在一些实施方式中，所述方法进一步包括初始步骤：包括对微生物清洗、研磨、磨碎、洗涤、干燥或其任何组合。

在一些实施方式中，第一级分和第二级分中的任何一个的形式是粉末、溶液、悬浮液，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括步骤：提取微生物1至5次之间、1至4次之间、1至3次之间、1至2次之间、2至5次之间、2至4次之间、2至3次之间、3至5次之间或3至4次之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括从第一级分和第二级分或两者分离、净化、浓缩蛋白质或其任何组合的步骤。

在一些实施方式中，所述方法不用溶剂。

组合物

根据一些实施方式，提供了一种组合物，其包括第一级分和第二级分或两者，它们源于含细胞壁的微生物并且包含通过上文描述的方法获得的按重量计在级分的10％至90％之间的蛋白质含量。

根据一些实施方式，提供了一种组合物，其包括通过上文描述的方法获得的酵母材料，该酵母材料包括按重量计在酵母材料的10％至90％之间的蛋白质含量。

在一些实施方式中，所述组合物通过施加250巴到1500巴之间的压力从固体级分获得。在一些实施方式中，通过施加250巴到1500巴之间的压力从固体级分获得的组合物包括按重量计在酵母材料的30％至70％之间的蛋白质含量。在一些实施方式中，通过氮含量的换算计算蛋白质含量。在一些实施方式中，通过使用6.25的氮-蛋白质折算系数计算蛋白质含量。

在一些实施方式中，所述组合物包括本文所描述的酵母材料，其包含的氮含量按重量计在酵母材料的1％至15％之间、4％至15％之间、5％至15％之间、6％至15％之间、7％至15％之间、1％至10％之间、4％至10％之间、5％至10％之间、6％至10％之间、7％至10％之间、4％至7％之间或5％至7％之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

根据一些实施方式，提供了一种组合物，其包括按干重计大于50％的源于含细胞壁的微生物的蛋白质。在一些实施方式中，所述组合物包括按干重计以下含量的源于含细胞壁的微生物的蛋白质：大于50％、大于51％、大于55％、大于60％、大于62％。

在一些实施方式中，所述蛋白质的特征在于分子量在1kDa至250kDa之间、5kDa至250kDa之间、10kDa至250kDa之间、15kDa至250kDa之间、20kDa至250kDa之间、25kDa至250kDa之间、30kDa至250kDa之间、1kDa至200kDa之间、5kDa至200kDa之间、10kDa至200kDa之间、15kDa至200kDa之间、20kDa至200kDa之间、25kDa至200kDa之间或30kDa至200kDa之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述组合物的特征在于水溶解度小于300g/L、小于280g/L、小于250g/L、小于220g/L、小于200g/L、小于150g/L或小于100g/L，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述蛋白质的特征在于表13中展示的氨基酸谱。

在一些实施方式中，所述组合物是粉末形式，其平均颗粒尺寸在1μm至100μm之间、1μm至95μm之间、1μm至90μm之间、1μm至89μm之间、1μm至80μm之间、1μm至50μm之间、2μm至50μm之间、4μm至50μm之间、5μm至50μm之间、10μm至50μm之间、15μm至50μm之间、20μm至50μm之间、1μm至45μm之间、2μm至45μm之间、4μm至45μm之间、5μm至45μm之间、10μm至45μm之间、15μm至45μm之间、20μm至45μm之间、1μm至40μm之间、2μm至40μm之间、4μm至40μm之间、5μm至40μm之间、10μm至40μm之间、15μm至40μm之间或20μm至40μm之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述组合物包含的纤维含量按干重计在5％至20％之间、6％至20％之间、7％至20％之间、5％至15％之间、6％至15％之间或7％至15％之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述组合物包含的灰分含量低于5％、低于4.5％、低于4％、低于3.9％或低于3％，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述组合物的特征在于蛋白质消化率校正的氨基酸评分(PDCAAS)在0.7至1之间、在0.75至1之间、在0.8至1之间、在0.85至1之间或在0.9至1之间，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述微生物是如上文所述的细菌、真菌或微藻。在一些实施方式中，所述真菌是酵母。

在一些实施方式中，所述酵母包括酿酒酵母、纳塔尔链霉菌、恰塔努加链霉菌、脆壁酵母、产朊假丝酵母、高里假丝酵母、脂溢假丝酵母、杰丁塞伯林德纳氏酵母、毕赤酵母，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述酵母源于下游的食物相关产业。在一些实施方式中，所述酵母包括废酵母、速发酵母、非活性酵母、活酵母，或其任何组合。

根据一些实施方式，提供了一种包含上文描述的组合物的食物产品。

如本文所用的，术语“食物产品”是指可以用做食物或可添加进食物的材料、物质或添加剂。通常地，食物产品是动物，优选为哺乳动物如人类，可以作为其饮食一部分食用的任何组合物。在一些实施方式中，食物产品是指食物补充剂。

在一些实施方式中，食物产品的特征在于适合作为肉类、蛋类、芝士、乳制品、肉类替代产品、素食产品或其任何组合的等效产品使用。

在一些实施方式中，食物产品的特征在于使用蛋类制备的等效产品的黏稠度的至少60％。在一些实施方式中，食物产品的特征在于使用肉类、蛋类、乳制品或其任何组合制备的等效产品的黏稠度的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，包括之间的任何范围。每种可能代表本发明的一个单独实施方式。

在一些实施方式中，所述食物产品包括肉类、蛋类、乳制品，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述食物产品没有肉类、蛋类、乳制品，或其任何组合。在一个实施方式中，“没有(free of)”是“没有(devoid of)”或基本上“没有(devoid of)”。

如本文所用的，术语“蛋类”、“肉类”、“乳制品”，例如，当描述“产品不含肉类、蛋类、乳制品”时所用的，是指动物产品或动物制品的任何组分。

在一些实施方式中，所述食物产品是素食食物产品。在一些实施方式中，所述食物产品是纯素食食物产品。

如本文所用的，术语“纯素食(vegan)”是指组分的性质，并且表示组分不是来源于或衍生自动物或动物产品。因此，是“纯素食”的组分没有任何动物产品或动物副产品。在本领域，以及对于那些遵循素食或纯素食的人，什么构成动物产品或副产品是众所周知的。特别地，术语“动物产品”是指任何动物部分、动物副产品或动物生产的产品。被认为是“动物产品”的材料的一些例子包括可消费或通常准备供人类消费的动物部分(包括，例如脂肪、肉、血等等)。由动物生产的产品也被认为是如本文所用的“动物产品”，并且是指在没有宰杀动物的情况下动物生产的产品(例如，奶、蛋、蜂蜜等等)。“动物副产品”是通常不自己消费而是供消费的屠宰动物的副产品的产品，例如，骨头、尸体等等。然而，动物副产品通常被加工成人类可消费的食品，其一些众所周知的例子包括明胶、酪蛋白、乳清、凝乳酶等等。如本文所用的，这些经加工的动物副产品(例如，明胶、酪蛋白、乳清、凝乳酶等等)被包含在术语“动物副产品”中。如本文所用的，“纯素食”和“素食”组分或成分基本上没有(或在一些实施方式中，完全没有)所述动物制品和副产品。

在一些实施方式中，本文描述的组合物和食物产品适合纯素食饮食和/或素食饮食。例如，在组合物适合纯素食饮食的实施方式中，组合物可主要包括植物类组分，使得组合物基本上不含动物产品、动物副产品或基本上没有源于动物来源的组分。

在一些实施方式中，食物产品是可直接使用的产品。在一些实施方式中，食物产品是冷冻食物产品。在一些实施方式中，食物产品合适于通过加热、煎和烤烹饪。

在一些实施方式中，本文描述的食物产品或组合物包括一种或多种调味剂。在一些实施方式中，本文描述的食物产品或组合物包括酵母、糖、盐及其任何组合。各种天然或人工调味剂对本领域技术人员是已知的，并且可包括例如盐、香料、糖、甜味剂、谷氨酸一钠、硫酸调味剂，如黑盐，或其他调味剂。

在一些实施方式中，本文描述的食物产品或组合物包括一种或多种着色剂。各种天然或人工着色剂对本领域技术人员是已知的，并且可包括例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素、姜黄、胭脂树红、芒果黄或棕榈类油。

在一些实施方式中，本文描述的食物产品或组合物进一步包括乳化剂、增稠剂、油，或其任何组合。

在一些实施方式中，所述油是植物类油。可根据本发明使用的植物油的例子包括，但不限于，大豆油，红花油，亚麻籽油，玉米油，葵花籽油，橄榄油，芥花油，芝麻油，棉籽油，棕榈油，菜籽油，桐油，或任何这些油的混合物。可选地，可以使用任何部分氢化的植物油或基因修饰植物油。部分氢化的植物油或基因修饰植物油的例子包括，但不限于，高含油红花油、高含油大豆油、高含油花生油、高含油葵花籽油和高含油菜籽油(海甘蓝籽油(crambeoil))。

一般描述

如本文所用的，术语“大约”是指±10％。

术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其词形变化形式的意思是“包括但不限于”。

术语“由……组成(consisting of)”意思是“包括并限于”。

术语“基本由……组成(consisting essentially of)”意思是组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤和/或部分，但只有在额外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖性的情况下。

本文使用词语“示例性的(exemplary)”意思是“作为例子、实例或说明”。描述为“示例性的”任何实施方式不一定被解释为优选的或优于其他实施方式，和/或被解释为排除来自其他实施方式的特征的合并。

本文使用术语“任选地(optionally)”意思是“在一些实施方式中提供并且在其他实施方式中没有提供”。本发明的任何特定实施方式可以包括多个“任选的”特征，除非这些特征相互冲突。

如本文所用的，除非本文明确另作说明，单数形式：“—(a)”、“—(an)”和“所述(the)”包括复数个提及的内容。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。

在整个申请中，可以以范围形式展示本发明的各种实施方式。应当理解，范围形式的描述仅为了方便和简洁并且不应该被解释为对发明范围僵化的限制。因此，范围的描述应被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围例如从1至6的描述应当被认为具体地公开了子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

无论何时本文指示了数值范围，其意思是包括在所指示范围内的任何提及的数值(分数或整数)。短语“在第一个所指示数字和第二个所指示数字之间的范围”和“从第一个所指示数字至第二个所指示数字的范围”可互换使用，并且旨在包括第一个和第二个所指示数字以及其间的所有分数和整数数字。

如本文所用的，术语“方法”是指完成特定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的技术人员已知的或他们容易从已知的方法、手段、技术和程序发展而来的那些方法、手段、技术和程序。

如本文所用的，术语“治疗(treating)”包括停止、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状，或基本上防止病况的临床或美学症状的出现。

应当理解，为了清晰在分开的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为了简洁在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以分开提供，或者以任何合适的子组合提供，或者在本发明的任何其他描述的实施方式中适当提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必要特征，除非实施方式在没有这些要素的情况下不能实现。

如上文所描述并在权利要求部分中要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。

实施例

现在参考以下实施例，其与上文述描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方式。

过程

将酵母材料与水在25℃下混合30min。根据描述的条件，使用机械破坏来破碎细胞壁。可选地，进行酶处理后离心。将颗粒从上清液中分离并干燥，得到最终的蛋白粉。

实施例1

通过干法和湿法分级技术破碎酵母细胞壁

材料和方法

酵母

实验使用的酵母为Lesaffre公司提供的SAF Instant Red。它是一种速发干酵母，普遍适用于所有面团，并且指示直接添加到面团中。表1总结了技术数据表中的信息。

表1.酵母数据表单信息

酶

表2描述了实验中使用的酶。

表2.在本实验中使用的酶的性质

分析

总氮

根据内部程序PR-16027(NF EN ISO 5983-2)，通过Kjeldahl(TecatorTM withKjeltec 8400，

干物质

根据内部程序PR-14032，使用自动PrepAsh(340系列，型号219，

颗粒大小分布

颗粒大小分布(PSD)根据内部程序PR-17014确定，使用Mastersizer 3000(Malvern)，其使用Hydro MV系数。

电泳

采用内部程序P14027，使用SDS和β-巯基乙醇进行分析。

样品准备

为了实现氮和干物质分析，将样品先在实验室离心机(Jouan)中以4000x g离心10分钟。为了解颗粒大小分布，使用了所有样品。

颗粒大小分布结果

采用高压均质机和酶水解进行裂解酵母细胞的过程以提取细胞质蛋白。每个实验都通过颗粒测定法进行评估，其指出了所应用过程的影响，并且表3显示了颗粒大小分布(PSD)的d10、d50和d91外推值。

表3.颗粒大小分布(PSD)

d10：样品质量的10％由较小直径颗粒组成的直径(即10％的颗粒的直径小于或等于d10值)；

d50：样品质量的50％由较小直径颗粒组成的直径(即50％的颗粒的直径小于或等于d50值)；

d90：样品质量的90％由较小直径颗粒组成的直径(即90％的颗粒的直径小于或等于d90值)。

数据显示了在使用均质机进行的不同实验中“d”指标的值相似。水解过程中显示了例外，其中在viscozyme水解(样品C5665-31)的情况下显示d50和d90指数的值更高，而酶的混合物显示d10和d50的值更低。总体而言，处理之间的PSD没有显著差异。

蛋白质含量

蛋白质含量(Nx6.25)(/DM)突出了处理之间的差异，并且图3A-B总结了进展情况。

在恒压下，遍数(从1到3)导致上清中蛋白质纯度更高。在500巴下进行实验的情况中，纯度提高了47％。在恒定遍数下增加压力(从250到500以及到1000巴)可提高上清液中的蛋白质纯度。与在250巴下进行的实验相比，在500巴下进行的使用1遍的实验表明上清液中的纯度提高了7％。当与在500巴下应用3遍相比时，在1000巴下进行的使用3遍的实验使上清液中的蛋白质纯度提高29％(图3A)。

通过β-葡聚糖酶(viscozyme L)进行3个小时的酶水解提供了36％的蛋白质纯度(图3B)。将该酶处理与均质化(500巴，1遍)结合导致纯度增加到50％(+36％)。通过酶的混合物(viscozyme L、果胶酶和alcalase)进行3个小时的酶水解产生的上清液具有28％的蛋白质纯度(比单独使用viscozyme L观察到的少8％)。应用250巴没有显示出任何改进。应用500巴使上清液中蛋白纯度提高31％，相当于+10％。

蛋白质产率

表4汇总了所有实验的蛋白质产率比较。

表4.不同实验条件下的蛋白质产率汇总

就产率而言，最佳试验条件为1000巴，3遍，因为与500巴-3遍试验相比，产率提高了115％。然而，必须考虑蛋白质纯度，并且，单独用viscozyme水解和均质化的组合显示出最高的观察纯度(49％)。与酶混合物实现的实验相比，水解和均质化结合的实验指出单独viscozyme可以释放更高数量的蛋白质(+58％)。

实施例2

方法优化

不同的机械破碎方法成功地用于几种酵母材料，包括加热、珠磨机、超声波和高压均质机。

均质机的使用被证明是一种非常有效的方法(在200-750巴之间的压力下)，一方面机械破碎细胞，另一方面将尽可能多的蛋白质分级到不溶相中。

表5展示了使用不同的机械破碎方法从相同酵母流中获得的蛋白质含量。

表5.机械破碎后的蛋白质含量

酶解步骤

不同的酶被成功地单独和联合使用。所述酶包括：a)Lecitase–脂酶(磷脂酶)；b)Ban 48L0-具有β-葡聚糖酶侧活性的内切淀粉酶；c)Pectinex Ultra SPL-多聚半乳糖醛酸酶；d)Vino Taste Pro-具有几丁质酶侧活性的多聚半乳糖醛酸酶(果胶酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶和聚阿拉伯糖酶)；e)Viscozyme-内切β聚糖酶(酶的复合物)；f)Alcalase-蛋白水解酶；和g)Flavorzyme

-蛋白水解酶。表6列出了结果汇总。

表6.酶解步骤后蛋白质含量

在0.1％和3％之间，反应时间在30分钟到10小时之间，成功测试了不同的酶浓度。0.5-1％的酶处理2-4小时得到最好的结果。

为了测试pH对酶解步骤的影响，在不同的pH下进行了实验。表7展示了结果。

表7.pH对酶解步骤的影响

过程显示对不同来源的酿酒酵母有效。优化的过程在不同的流中进行并且表8展示了最终蛋白质含量。

表8.从不同来源的酿酒酵母获得的蛋白质含量

分析了最终产物的功能特性，如颗粒尺寸、蛋白质级分尺寸、乳化性、保水和保油能力等。

颗粒尺寸

在喷雾干燥后收集的样品的颗粒大小分布使用Malvern颗粒尺寸分析仪分析(表9)。

表9.颗粒大小分布

蛋白质尺寸-SDS page分析

进行SDS-PAGE分析，以按它们分子量分离样品的不同蛋白质和蛋白质亚基。分析进行了一份两次。

一些微弱的蛋白质条带被观察到大约在80kDa、60kDa、45kDa、35kDa、30kDa、27kda和25kDa。在10kda以下小肽以及不可溶性蛋白质残留也可见。

乳化

通过在标准条件下产生水包油乳状液，测试样品在pH为7下的乳化性能，并且通过颗粒大小分布测量油滴的大小分布。好的乳化剂能够形成有随时间稳定的小液滴的乳状液。使用酪蛋白酸盐作为本测试的参考。

酪蛋白酸盐产生随时间稳定的小油滴(<5μm)并且可以被认为是非常好的乳化剂。酵母提取物产生稳定的乳状液，但是其由更大的油滴(75μm)组成。在更高的蛋白质含量(5％)下油滴尺寸减少到25μm(表10)。样品被证明是很好的乳化剂。

表10.颗粒大小分布

固体乳状液的生产

在pH为7下生产固体乳状液，其水：油：蛋白质的比例是100:338:5。产品为半固体，和普通蛋黄酱相似。

生产后和储存后立即使用流变仪分析了得到的固体乳状液的黏度。样品表现出剪切稀化的特性(黏度随剪切速率降低)，这是结构流体的特征。所述乳状液的黏度较高。储存3天后黏度变化不明显。

表11展示了与大豆和乳清相比，最终酵母提取蛋白质粉的保水(WHC)和保油(OHC)能力。

表11.保水(WHC)和保油(OHC)能力

营养值

表12汇总了从酵母中得到的最终产品的营养值信息。

表12.营养分析(100克最终产品的期望值)

对氨基酸谱进行了评估(表13)。

表13.氨基酸谱(每100克蛋白质中必需氨基酸的相对比例)

蛋白质溶解度

在酸性、中性和碱性条件下测量了蛋白质溶解度(表14)。在所有条件下测试样品显示了低蛋白质溶解度。

表14.蛋白质溶解度

当被储存在干燥条件下的环境温度时，最终产品在至少2年里是稳定的。

虽然本发明是结合其具体实施方式进行描述的，但明显的是，许多替代、改型和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，其目的在于包括落在所附权利要求的精神和范围内的所有这些替代、改型和变化。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请，在此处通过引用完整地并入说明书，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地和单独地指出通过引用并入本文。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应当被解释为认可该参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的方面，它们不应当被解释为必然限制。