一种用于抑郁症诊疗的生物标志物组合及其筛选方法与应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于抑郁症诊疗的生物标志物组合及其筛选方法与应用。

背景技术

随着社会发展和生活方式的改变，重度抑郁症(MDD)已成为当今非常重大的精神疾病。其核心症状包括情绪低落、精神萎靡、悲观厌世、快感丧失，具有高患病率、高自杀率以及高复发率的特点，给家庭和社会带来沉重的负担。目前全球抑郁症患者约有3.22亿，其中，中国抑郁患者已有6800万。关于抑郁症的发病机制学说众多，如神经递质紊乱、神经内分泌异常以及神经发生障碍等，这些学说为揭示抑郁症的病因提供了一定的理论依据，但未获得到广泛的认同。基于这些学说所开发的抗抑郁药物，如临床上用得较多的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、去甲肾上腺素再摄取抑制剂等药物，也仅能使60％的病人得以缓解，疗效欠佳，复发率高且部分难治。因此，抑郁症发病机制的复杂性及药物疗效等因素共同制约了抑郁症的客观诊断以及临床治疗的进展。

过去研究发现，在外周血单核细胞中，一些代谢物被认为是生物标志物，例如γ-氨基丁酸和多巴胺，具有作为神经递质的功能。此外，在尿液中也发现了多种关键代谢物，包括一系列重要的氨基酸。随着对相关代谢物的认识增加，越来越多的生物标志物提高了重度抑郁症诊断的准确性和特异性。鉴于这些事实，有必要开发基于实验室的抑郁症经验诊疗方法。

目前，抑郁症诊断方法仍以量表问卷和临床表现为主，包括汉密尔顿抑郁量表、抑郁自评量表、贝克抑郁自评量表、蒙哥马利-奥斯伯格抑郁等级量表和抑郁-焦虑-压力量表等。问卷侧重于情感和身体，但抑郁症更伴随认知和行为问题，存在大量疲劳、失眠、食欲减退和体重有关问题，诊断结果可能和实际存在偏差。同时，抑郁症的临床表现异质性也较高，特别是在抑郁症早期，抑郁症患者所表现的症状呈现多样化甚至相反的特征，诊断相当困难，患者常常会经历误诊或者漏诊的情况而无法得到有效的治疗。因此，筛选抑郁症相关生物标志物将有助于揭示其潜在的病理生理机制，开发出客观的诊断方法。

在抑郁症研究领域，既往研究主要聚焦于抑郁动物模型脑组织、血液以及尿液的代谢组学分析，进而寻找相关的生物标志物。然而，抑郁症是一种多病因、异质性疾病，动物模型不能完全模拟人的发病，有必要对抑郁症临床标本进行代谢组学分析。相比之下，血液是一种易于获取的、广泛运用于临床诊断的生物样本。其次，在检测方法上，现有的与神经递质相关的靶向代谢组学方法未能检测到足够的潜在代谢物。

因此，进一步开展抑郁症患者血清非靶向代谢组学分析，筛选出潜在的生物标志物，对抑郁症的诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明目的在于提供一种用于抑郁症诊疗的生物标志物组合及其筛选方法与应用。本发明提供的生物标志物组合能够用于抑郁症诊断与治疗效应观测。联合应用乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱诊断抑郁患者时，AUC为0.815，具有一定的准确度，可以制备成诊断试剂或试剂盒。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了一种用于抑郁症诊疗的生物标志物组合，所述生物标志物组合包括乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱或肉豆蔻烯酰肉碱中至少两种的组合。

优选地，所述生物标志物组合包括乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱或肉豆蔻烯酰肉碱中至少3种的组合。

进一步地，所述生物标志物组合包括乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱。

本发明还提供了上述生物标志物组合在制备用于抑郁症诊疗的试剂或试剂盒中的应用。

所述试剂盒包含检测上述生物标志物组合水平的试剂。

所述试剂盒检测样品为人体的血清。

本发明还提供了上述用于抑郁症诊疗的生物标志物组合的筛选方法。本发明采用非靶向代谢组学技术，能够提高检测灵敏度。

所述非靶向代谢组学技术包括预处理单元和检测单元，所述预处理单元包括离心设备、超声设备、冷冻设备和真空浓缩设备；所述检测单元包括液相色谱设备和质谱设备。

本发明选用了液相色谱设备和质谱设备进行检测，不但可以实现对标志物的筛选，还可以实现对这些物质相对含量的表征。

所述液相色谱设备使用的色谱柱包括T3柱和氨基柱；使用T3柱时，流动相A为5mM甲酸铵(含0.5％甲酸)，B为乙腈；使用氨基柱时，流动相A为95％的10mM乙酸铵缓冲液，5％乙腈(PH＝9)，B为乙腈。

所述液相色谱设备的参数设置为：

柱温40℃，样品注射量为5μL，流速为0.3mL/min；

对于T3柱，流动相梯度为：0-1min，5％B；1-3min，5-10％B；3-6min，10-65％B；6-16min，65-95％B；16-17.5min，95％B；17.5-18min，95-5％B。18-21min，5％B；

对于氨基柱，流动相梯度为：0-3min，85％B；3-6min，85-30％B；6-15min，30-2％B；15-18min，2％B；18-19min，2-85％B；19-26min，85％B。

所述质谱设备的参数设置为：

drying gas temperature分别设置为550℃(ESI+)和500℃(ESI-)；ion sprayvoltage设置为+5500V(ESI+)和-4500V(ESI-)；碰撞能量(CE)设置为+40V(ESI+)和-35V(ESI-)。gas 1、gas 2和curtain gas在两种电离模式下分别设置为50、30和30psi。

数据采集在DDA扫描模式下进行，质量范围设置为50-1200Da，采用Sensitivity模式。

在上机测量之前，将血清样本与纯甲醇混合，进一步冷冻处理，通过沉淀操作除去血清中的蛋白质。所得的上清液在真空浓缩器中蒸发挥干，再使用纯甲醇将干燥的提取物复溶，再进行LC-MS/MS分析。上述操作可以充分除去杂质，并保证后续液相以及质谱分析的顺利进行。

本发明选用了T3柱和氨基柱在正离子模式下，对大量抑郁患者和健康对照的血清进行了非靶向代谢组学分析。实验研究发现，重度抑郁症患者血液中乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱、肉豆蔻烯酰肉碱的分子水平均显著低于健康对照组，在两种类型检测模式下，结果均保持一致，且抗抑郁药物治疗后乙酰左旋肉碱水平可明显恢复，提示上述四种肉碱类代谢物组合可成为早期诊断及疗效观测的生物标志物。

完成上述标志物筛选之后，基于这四种生物标志物，利用二元逻辑回归建立诊断模型，自变量为四种生物标志物的特征丰度，应变量为MDD患者和未患病者HC，再进行接收操作特征(ROC)分析，以量化包含四个代谢物的生物标志物组合的诊断性能。结果表明，诊断模型的AUC值为0.815，95％置信区间：0.726-0.904，表明这四个生物标志物的组合有较好的诊断效能。基于此，本发明提供的生物标志物组合可以制备成诊断试剂或试剂盒。

有益效果：

本发明采用非靶向代谢组学技术来提高检测灵敏度，筛选出了潜在的生物标志物，进一步为抑郁症的诊断和治疗提供了新的证据。本发明研究发现：联合应用乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱、肉豆蔻烯酰肉碱诊断抑郁患者时，诊断模型的AUC值为0.815，95％置信区间为0.726-0.904，有较好的诊断效能。因此，本发明提供的生物标志物组合能够用于制备用于抑郁症诊疗的试剂或试剂盒。将上述生物标志物组合应用于抑郁症的临床诊断及疗效观测，有助于解决目前抑郁症的诊断过于依赖临床医师的主观判断的问题，在本领域具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1的HC组和MDD组血清代谢组学分析的OPLS-DA图；图1A为T3柱的检测结果，图1B为氨基柱的检测结果。

图2为实施例1的四种共同差异代谢物的相对含量统计结果。

图3为实施例1的HC组和MDD组的MetaboAnalyst代谢通路分析结果图；图3A为T3-Pos检测模式下的通路分析，图3B为Amide-Pos检测模式下的通路分析。

图4为抗抑郁药物治疗后乙酰左旋肉碱的水平相对含量统计结果。

图5为乙酰左旋肉碱(图5A)、L-辛酰基肉碱(图5B)、月桂酰肉碱(图5C)、肉豆蔻烯酰肉碱(图5D)的ROC曲线图。

图6为两个肉碱类代谢物的生物标志物组合的ROC曲线图。

图7为三个肉碱类代谢物的生物标志物组合的ROC曲线图。

图8为实施例1的四个肉碱类代谢物的生物标志物组合的ROC曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1生物标志物的筛选

(1)实验对象

本实验共招募96名受试者，年龄范围20-66岁，其中，抑郁患者(MDD)48人，健康对照(HC)48人。受试者的详细信息请见表1。

表1受试者信息

上表中的缩写和上标的具体释义如下：

BMI，身体质量指数；

HAMD-17，汉密尔顿抑郁量表17项；

HAMA，汉密尔顿焦虑量表；

NA，不适用；

a

b

(2)样本的收集

入组次日采集静脉血至含抗凝剂的真空采血管中。轻柔颠倒数次充分混匀，并将采血管放置在冰水浴中，于1h内置离心机(离心条件：离心力8000r，离心温度4℃，离心时间10min)离心，离心结束取上清分装放-80℃保存。

(3)样本的前处理

准确吸取50μl血清于1.5ml EP管中，加入800μl含内标4-氯苯丙氨酸(200ng/ml)的冰甲醇，震荡10min。为了沉淀蛋白，将样品在-20℃下沉淀1小时，然后4℃，18000rpm离心10min，吸取上清700μL到新EP管中，真空挥干仪挥干样本后，存于-80℃冰箱待用。

进样前用150μl冰甲醇复溶挥干样，震荡15min。4℃，18000rpm离心10min，吸取上清100μl于新1.5ml EP管。4℃，18000rpm再次离心5min，吸取上清60μl转移到HPLC小瓶中等待进样。

(4)超高效液相色谱-质谱联用检测参数设置

数据采集在超高效液相色谱系统上进行，并与质谱仪联用。

采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱进行分离，柱温为40℃，样品注射量为5μL，流速为0.3mL/min。流动相A为5mM甲酸铵(含0.5％甲酸)，B为乙腈。

流动相梯度设定为：0-1min，5％B；1-3min，5-10％B；3-6min，10-65％B；6-16min，65-95％B；16-17.5min，95％B；17.5-18min，95-5％B。18-21min，5％B。

采用XBridge BEH Amide柱进行分离，柱温为40℃，样品注射量为5μL，流速为0.3mL/min。流动相A为95％的10mM乙酸铵缓冲液，5％乙腈(PH＝9)，B为乙腈。

流动相梯度设定为：0-3min，85％B；3-6min，85-30％B；6-15min，30-2％B；15-18min，2％B；18-19min，2-85％B；19-26min，85％B。在数据采集期间，所有的样品都是随机注入的。

质谱设备的参数设置为：drying gas temperature分别设置为550℃(ESI+)和500℃(ESI-)；ion spray voltage设置为+5500V(ESI+)和-4500V(ESI-)；碰撞能量(CE)设置为+40V(ESI+)和-35V(ESI-)。gas 1、gas 2和curtain gas在两种电离模式下分别设置为50、30和30psi。

数据采集在DDA扫描模式下进行，质量范围设置为50-1200Da，采用Sensitivity正离子模式。

(5)数据处理

数据处理采用Progenesis QI V2.0软件进行处理，MetaboAnalyst 5.0对鉴定数据进行作图。原始数据导入QI后，主要流程包括：Create a new experiment，Import data，Review alignment，Experiment design setup，Peak picking，Identify compounds。首先基于QI的MetaScope结合HMDB数据库的MS和结构信息，基于MetaScope对代谢物二级碎片进行模拟，初步鉴定代谢物；然后再根据METLIN数据库对初步鉴定的代谢物进行二次鉴定。MetaScope主要设置参数为：Precursor tolerance(10ppm)；Retention time within(0.1min)；Fragment tolerance(15ppm)。METLIN数据库主要设置参数为：Precursortolerance(10ppm)；Fragment tolerance(15ppm)。

(6)数据分析

非靶向代谢组学采用DDA模式对样本进行数据采集。分别采用Waters HSS T3柱及XBridge BEH Amide柱对样本进行分离，正离子模式采集样本后，数据分别导入ProgenesisQI V2.0新建Project中，在鉴定模块上根据m/z容差、保留时间、同位素相似性，二级碎片进行量化评分。通过Metlin和HMDB库进行化合物比对鉴定，差异化合物的筛选标准为P-value值<0.05，fold change>1.2，差异代谢物被确定为潜在的诊断生物标志物。后续将鉴定得到的化合物导出为Excel文件后，使用MetaboAnalyst5.0对数据进行图像化分析。最后进行接收操作特征(ROC)分析，以量化代谢物生物标志物小组区分MDD和HC的能力。上述数据处理过程为代谢组学研究常规数据处理方法。

(7)结果分析

7.1MDD组和HC组之间的代谢情况比较

通过非靶代谢组学分析，在T3-Pos、Amide-Pos检测模式下分别鉴定了263和356个代谢物。OPLS-DA模型的得分图显示：在两种模式下，MDD和HC受试者之间有明显的区别(见图1)。

根据标准(P-value值＜0.05，fold change>1.2)，分别在T3-pos模式下和Amide-pos模式下，筛选差异代谢物，主要包括肉碱类、色氨酸类、胆汁酸类、长链脂肪酸类、嘌呤类、鞘脂类、磷脂类、短肽类代谢物。最终在两种检测模式下，检测到四种共同的肉碱类差异代谢物。四种差异代谢物具体信息参见表2。

表2MDD组和HC组之间的差异代谢物

7.2筛选能识别抑郁症的生物标志物

对上述差异代谢物丰度进行作图分析，如图2所示，结果发现，在T3-Pos检测模式下，重度抑郁症患者血液中乙酰左旋肉碱(图2A)、L-辛酰基肉碱(图2B)、月桂酰肉碱(图2C)、肉豆蔻烯酰肉碱(图2D)的分子水平均显著低于健康对照组。在Amide-Pos检测模式下，重度抑郁症患者血液中乙酰左旋肉碱(图2E)、L-辛酰基肉碱(图2F)、月桂酰肉碱(图2G)、肉豆蔻烯酰肉碱(图2H)的分子水平均显著低于健康对照组。在T3-Pos、Amide-Pos两种分析模式下丰度变化均保持一致。

进一步地，在T3-Pos检测模式，使用MetaboAnalyst对MDD组和HC组的代谢通路进行分析，确定了五条改变的通路：神经鞘脂质代谢、甘油磷酸脂代谢、色氨酸代谢、卟啉和叶绿素代谢及初级胆汁酸的生物合成(图3A)。在Amide-Pos检测模式，使用MetaboAnalyst对MDD组和HC组的代谢通路进行分析，确定了两条主要改变的通路：神经鞘脂质代谢及甘油磷酸脂代谢(图3B)。从功能分析结果来看，两组的代谢通路也有一定区别，实现比单一分离和MS极性条件下更高的检测覆盖率。

为了进一步验证以上四种差异代谢物是否能够有效地进行抑郁症的诊疗，发明人对抑郁患者(20例)及经过不同抗抑郁药治疗的抑郁患者(20例)进行了治疗效果测试，具体采用的非靶向代谢组学检测方法同上述实施例。在T3-Pos检测模式下，结果发现，抗抑郁药物治疗后乙酰左旋肉碱的水平可明显恢复(图4A)。L-辛酰基肉碱(图4B)、月桂酰肉碱(图4C)及肉豆蔻烯酰肉碱(图4D)的分子水平在两组无显著性差异。

实施例2诊断能力的比较

为了进一步优化诊断效果，在确认四种共同代谢物之前，发明人尝试了使用单一物质或不同生物标志物组合的相对含量来进行诊断效果的比较。

基于这四种生物标志物，利用二元逻辑回归建立诊断模型，自变量为四种生物标志物的特征丰度，应变量为MDD患者和未患病者HC，再进行接收操作特征(ROC)分析，以量化包含四个代谢物的生物标志物组合的诊断性能。二元逻辑回归和ROC分析均使用现有技术的常规统计软件SPSS21.0进行。

ROC曲线用来评判分类、检测结果的好坏，是非常重要和常见的统计分析方法，是以假阳性率(1-特异性)为横轴，真阳性率(敏感性)为纵轴所组成的坐标图，测试样本在不同的判断标准(阈值)得出的不同结果画出的曲线。曲线下面积AUC用来表示准确性，AUC值越高，说明准确率越高。

测试一：

选用乙酰左旋肉碱作为用于抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.695，95％置信区间：0.585-0.804(图5A)。

测试二：

选用L-辛酰基肉碱作为用于抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.675，95％置信区间：0.566-0.785(图5B)。

测试三：

选用月桂酰肉碱作为用于抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.777，95％置信区间：0.680-0.875(图5C)。

测试四：

选用肉豆蔻烯酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.726，95％置信区间：0.624-0.828(图5D)。

测试五：

选用乙酰左旋肉碱和L-辛酰基肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.727，95％置信区间：0.620-0.835(图6A)。

测试六：

选用乙酰左旋肉碱和月桂酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.788，95％置信区间：0.695-0.881(图6B)。

测试七：

选用乙酰左旋肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.761，95％置信区间：0.661-0.860(图6C)。测试八：

选用L-辛酰基肉碱和月桂酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.790，95％置信区间：0.694-0.885(图6D)。

测试九：

选用L-辛酰基肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.730，95％置信区间：0.627-0.832(图6E)。测试十：

选用月桂酰肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.811，95％置信区间：0.722-0.900(图6F)。

测试十一：

选用乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱和月桂酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.795，95％置信区间：0.702-0.888(图7A)。

测试十二：

选用乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.765，95％置信区间：0.666-0.864(图7B)。

测试十三：

选用乙酰左旋肉碱、月桂酰肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.815，95％置信区间：0.726-0.904(图7C)。

测试十四：

选用L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.807，95％置信区间：0.716-0.899(图7D)。

测试十五：

选用乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱和肉豆蔻烯酰肉碱作为抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.815，95％置信区间：0.726-0.904(图8)。

综上，乙酰左旋肉碱、L-辛酰基肉碱、月桂酰肉碱和肉豆蔻烯酰肉这四个生物标志物的组合有更优秀的诊断效能。

对比例1乙酰左旋肉碱的诊断能力

已有研究报道，与健康人相比，抑郁症患者血液中的乙酰左旋肉碱水平显著偏低。在严重抑郁症患者及抑郁症发病年龄早的患者群体中，血液乙酰左旋肉碱水平尤其低。此外，乙酰左旋肉碱缺乏程度反映了抑郁症发病的严重程度和发病年龄，乙酰左旋肉碱是一种可以改变抑郁症诊断和治疗的工具。本发明也同样显示了重度抑郁症患者血液中乙酰左旋肉碱的分子水平显著低于健康对照组，且抗抑郁药物治疗后乙酰左旋肉碱水平可明显恢复。单独选用乙酰左旋肉碱作为用于抑郁症诊疗的生物标志物，经二元逻辑回归和ROC分析，诊断模型的AUC值为0.695，95％置信区间为0.585-0.804(图5A)。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。