一组与茄子肉色QTL位点紧密连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种技术领域，特别是涉及一组与茄子肉色QTL位点紧密连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)属茄科(Solanaceae)茄属(Solanum L)。茄子肉色主要分为白色和绿色。其中果肉绿色对白色为显性，由一对完全显性基因控制。同时茄子的果肉颜色与花青素含量、维生素P、可溶性糖含量等营养品质性状关联度大。由于消费习惯的差异，世界各地对茄子肉色的要求不同，因此选育符合区域消费者喜好的茄子是茄子育种的目标之一。

有关茄子肉色的研究，现有技术仍存在以下问题：关于茄子肉色的研究相对较少，通过遗传分析认为其是由一对完全显性基因控制，而关于茄子肉色QTL定位研究相对滞后。传统回交方法是改良茄子肉色的有效手段，但是该方法主要是在回交后代中根据肉色进行选择，该方法育种周期较长、工作量大导致育种效率低下。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一组与茄子肉色QTL位点紧密连锁的SNP分子标记及其应用。本发明提供的相关研究构建了茄子肉色分离群体，并且利用重测序技术和SNP分型技术开发了与茄子肉色紧密连锁的分子标记，为改良茄子肉色提供可用分子标记。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一组与茄子肉色QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括：SNP分子标记Ⅰ-1、SNP分子标记Ⅰ-2、SNP分子标记Ⅱ-1和SNP分子标记Ⅱ-2；

所述SNP分子标记Ⅰ-1和SNP分子标记Ⅰ-2位于茄子8号染色体第82372537位；所述SNP分子标记Ⅰ-1在茄子8号染色体第82372537位的碱基为C；所述SNP分子标记Ⅰ-2在茄子8号染色体第82372537位的碱基为T；

所述SNP分子标记Ⅱ-1和SNP分子标记Ⅱ-2位于茄子8号染色体第84085714位；

所述SNP分子标记Ⅱ-1在茄子8号染色体第84085714位的碱基为A；所述SNP分子标记Ⅱ-2在茄子8号染色体第84085714位的碱基为C。

在本发明中，所述SNP分子标记Ⅰ-1在茄子8号染色体第82372537位碱基上下游各100各碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述SNP分子标记Ⅰ-2在茄子8号染色体第82372537位碱基上下游各100各碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列如CAACACTAATCCTCAAATCTCA TTCTTGAGCTTCCTAATTTCTTCATAATTCGCTATTAGGATAACTTTGGAGTTCTTTGAAATCGTGCGCAAAATCAAGCGTTTTGAACTACAAGTGGCCTGAATTCTCATGTAACCTGAGATATATAGGAAACCCAAAACCAGGGCCCGACCATAATTCCTCAATCTGCATCGAAGTTT所示；

所述SEQ ID NO.2的核苷酸序列如CAACACTAATCCTCAAATCTCATT CTTGAGCTTCCTAATTTCTTCATAATTCGCTATTAGGATAACTTTGGAGTTCTTTGAAATCGTGCGCAAAATCAAGTGTTTTGAACTACAAGTGGCCTGAATTCTCATGTAACCTGAGATATATAGGAAACCCAAAACCAGGGCCCGACCATAATTCCTCAATCTGCATCGAAGTTT所示；

所述SNP分子标记Ⅱ-1在茄子8号染色体第84085714位碱基上下游各100各碱基序列如SEQ ID NO.3所示；所述SNP分子标记Ⅱ-2在茄子8号染色体第84085714位碱基上下游各100各碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述SEQ ID NO.3的核苷酸序列如ATTCAACACAAAACTTGACATTTT CAATTTGTTTGTTAAAAATTGAACAAAATGTGGCATTCACCACTTGTCCAATAATAATGGACGAGTTTGATTATCAAATTATTTCCCTCTCTGATTTTACGTGACATTTTTTTCTTTTCAATTCATTCTAAAAAGGATATTACCTTATTCTGATTGAAAATAATTTAACTTTAATAT所示；

所述SEQ ID NO.4的核苷酸序列如ATTCAACACAAAACTTGACATTTT CAATTTGTTTGTTAAAAATTGAACAAAATGTGGCATTCACCACTTGTCCAATAATAATGGACGAGTTTGATTATCACATTATTTCCCTCTCTGATTTTACGTGACATTTTTTTCTTTTCAATTCATTCTAAAAAGGATATTACCTTATTCTGATTGAAAATAATTTAACTTTAATAT所示。

本发明提供的这组SNP标记可用于茄子肉色性状育种的早期分子标记辅助选择，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用；本发明通过QTL-seq技术以及遗传图谱定位，确定了与茄子肉色性状相关的QTL位点的位置，并发现了与该位点紧密连锁的分子标记，可用于茄子肉色性状的分子标记筛选，使得对于选择目标肉色的茄子品种的工作量大幅度较少，选择时间大幅度缩短，育种效率也大幅提高，适于大规模推广应用；本发明中与茄子肉色QTL位点紧密连锁的SNP标记，经试验检测，连锁性和可靠性均较高，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。

本发明通过检测与茄子肉色性状相关的分子标记，即可预测茄子肉色，进而准确快速筛选优良单株，分子标记位点的检测方法方便快捷，不受环境影响；本发明可以可以预测茄子肉色，可以对回交进行有效选择，可以用于茄子肉色的分子标记辅助育种，加速针对茄子肉色育种的进程。本发明通过对回交后代苗期叶片提取DNA，结合KASP引物进行KASP分子标记分型试验，通过标记的分型结果就可以预测茄子的果实肉色，而不用像常规育种中，等到茄子果实成熟进行判定，可以明显提高育种效率，节约育种成本。其中的引物设计软件可以选择使用Oligo引物设计软件。

本发明根据定位的茄子肉色QTL位点，开发检测茄子肉色的KASP引物，用于检测SNP位点的多态性表达茄子肉色的差异，预测茄子肉色，为茄子肉色的预先选择提供了可靠的分子标记来源。

本发明还提供了一组用于检测茄子肉色的KASP引物，所述KASP引物为根据权利要求2所述的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4设计得到的引物；

所述KASP引物包括：正向引物F-I-1、正向引物F-I-2和反向引物I-R；正向引物F-Ⅱ-1、正向引物F-Ⅱ-2和反向引物Ⅱ-R；

所述正向引物F-I-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5：GAAGGTGACCAAG TTCATGCTTCAGGCCACTTGTAGTTCAAAACG所示；

所述正向引物F-I-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6：GAAGGTCGGAGTC AACGGATTATTCAGGCCACTTGTAGTTCAAAACA所示；

所述反向引物I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7：CTTTGGAGTTCTTT GAAATCGTGCGC所示；

所述正向引物F-Ⅱ-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8：如GAAGGTGACC AAGTTCATGCTTCACGTAAAATCAGAGAGGGAAATAATT所示；

所述正向引物F-Ⅱ-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9：GAAGGTCGGAGTCAA CGGATTCACGTAAAATCAGAGAGGGAAATAATG所示；

所述反向引物Ⅱ-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10：CACTTGTCCAATAATAATGGACGAGTTTG所示。

作为优选，所述KASP所在的反应体系包含KASP引物的混合物、KASP主混合物和DNA模板；所述KASP引物的混合物包括正向引物F-I-1、正向引物F-I-2和反向引物I-R；正向引物F-Ⅱ-1、正向引物F-Ⅱ-2和反向引物Ⅱ-R；所述KASP主混合物包括正向引物尾部FAM标记的寡序列、正向引物尾部HEX标记的寡序列、FAM染料、HEX染料和淬灭剂；所述DNA模板为茄子基因组DNA。反应体系中的各物质，为SNP位点的多态性表达茄子肉色的差异检测，提供了良好的反应环境，保证整个检测过程的顺利完成。

同时本发明还提供了一种利用与茄子肉色QTL位点紧密连锁的SNP分子标记在对茄子肉色性状进行早期鉴定和筛选中的应用。

以及一种利用与茄子肉色QTL位点紧密连锁的SNP分子标记在茄子辅助育种中的应用。

在本发明中，当所述茄子的8号染色体的第82372534位碱基为C时，茄子的肉色为绿色；当所述茄子的8号染色体的第82372534位碱基为T时，茄子的肉色为白色。

在本发明中，当所述茄子的8号染色第84085714位碱基为A时，茄子肉色为白色；当所述茄子的8号染色第84085714位碱基为C时，茄子肉色为绿色。

本发明在定位的茄子肉色的QTL位点内，开发了与性状紧密连锁的分子标记并验证了标记的可靠性，通过检测该分子标记就可以预测茄子肉色，为实现茄子肉色性状的早期鉴定和筛选提供了分子标记辅助选择技术。

当该SNP位点I在等位基因中的碱基为C时，茄子肉色为绿色；当该SNP位点Ⅰ在等位基因中的碱基为T时，茄子肉色为白色。SNP分子标记Ⅰ的基因分型结果，c表示绿肉纯合表型，a表示白肉纯合表型，b表示是绿肉杂合表型。

当该SNP位点Ⅱ在等位基因中的碱基为A时，茄子肉色为白色；当该SNP位点Ⅱ在等位基因中的碱基为C时，茄子肉色为绿色。SNP分子标记Ⅱ的基因分型结果，a1表示F2群体中白肉纯合表型，c1表示F2群体中绿肉纯合表型，b1表示F2群体中的绿肉杂合表型。

本发明对茄子肉色调控基因进行QTL定位，并筛选到与肉色调控基因紧密连锁的分子标记位点，为8号染色体第82372534和第84085714SNP位点，两标记间的物理距离为1713180b。通过2个分子标记可以预测茄子肉色，为茄子肉色的筛选提供分子辅助选择技术支持，将大缩短了传统基因定位时间、减少育种工作量和提高育种效率。

附图说明

图1为实施例F2代群体肉色分离比；

图2为实施例调控茄子肉色基因初定位结果；其中，调控茄子肉色基因初定位结果，利用deeBSA软件初步定位茄子肉色的两个位点，绿色线代表0.95显著性关联阈值，黄色线代表0.99显著性关联阈值；

图3为实施例的SNP分子标记Ⅰ的基因分型结果；

图4为实施例的SNP分子标记Ⅱ的基因分型结果；

图5为实施例调控茄子肉色基因精细定位结果。

具体实施方式

下文中涉及使用的试剂或器械未注明具体技术或条件者，则按照常规实验条件进行，未明确说明有试剂公司说明书的，则按照说明书所建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一组与茄子肉色紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括SNP分子标记Ⅰ-1、SNP分子标记Ⅰ-2和SNP分子标记Ⅱ-1、SNP分子标记Ⅱ-2。

所述SNP位点Ⅰ和SNP位点Ⅱ分别位于茄子8号染色体的第82372534位碱基和第84085714位碱基，第82372534位(SNP位点Ⅰ)碱基为C或T；第84085714位(SNP位点Ⅱ)碱基为A或C。

所述SNP分子标记Ⅰ-1如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1为：CAACACTAATCCTCAAATCTCATTCTTGAGCTTCCTAA TTTCTTCATAATTCGCTATTAGGATAACTTTGGAGTTCTTTGAAATCGTGCGCAAAATCAAGCGTTTTGAACTACAAGTGGCCTGAATTCTCATGTAACCTGAGATATATAGGAAACCCAAAACCAGGGCCCGACCATAATTCCTCAATCTGCA TCGAAGTTT；

所述SNP分子标记Ⅰ-2如SEQ ID NO.2所示；

SEQ ID NO.2为：CAACACTAATCCTCAAATCTCATTCTTGAGCTTCCTAA TTTCTTCATAATTCGCTATTAGGATAACTTTGGAGTTCTTTGAAATCGTGCGCAAAATCAAGTGTTTTGAACTACAAGTGGCCTGAATTCTCATGTAACCTGAGATATATAGGAAACCCAAAACCAGGGCCCGACCATAATTCCTCAATCTGCATCGAAGTTT；

所述SNP分子标记Ⅱ-1如SEQ ID NO.3所示；

SEQ ID NO.7为：ATTCAACACAAAACTTGACATTTTCAATTTGTTTGTT AAAAATTGAACAAAATGTGGCATTCACCACTTGTCCAATAATAATGGACGAGTTTGATTATCAAATTATTTCCCTCTCTGATTTTACGTGACATTTTTTTCTTTTCAATTCATTCTAAAAAGGATATTACCTTATTCTGATTGAAAATAATTTAACTTTAATAT；

所述SNP分子标记Ⅱ-2如SEQ ID NO.4所示；

SEQ ID NO.8为：ATTCAACACAAAACTTGACATTTTCAATTTGTTTGTT AAAAATTGAACAAAATGTGGCATTCACCACTTGTCCAATAATAATGGACGAGTTTGATTATCACATTATTTCCCTCTCTGATTTTACGTGACATTTTTTTCTTTTCAATTCATTCTAAAAAGGATATTACCTTATTCTGATTGAAAATAATTTAACTTTAATAT。

实施例2

本实施例提供茄子肉色紧密连锁的SNP分子标记的定位和应用步骤，具体如下：

1.肉色遗传规律分析

通过对种资质源的筛选，获得了茄子绿肉自交系(NY)和茄子白肉自交系(WT)，并且通过杂交得到了F1材料。然后利用F1自交获得了F2种子。对F2群体1200个单株的肉色进行调查，结果显示茄子肉色在F2群体均基本符合3:1，属于质量性状，可以进行QTL定位(如图1所示)。

2.肉色调控基因的初步定位

(1)样品采集

利用构建的F2代肉色分离群体，选取白肉茄子单株30株叶片构建混池M-pool，选取绿肉茄子单株30株,DNA单株等量混池L-pool用于BSA集群分离分析。

(2)BSA集群分离分析

本研究前期委托北京贝瑞和康生物技术有限公司，对混池M-pool，L-pool进行基因组重测序。测序流程为首先提取植物材料的基因组DNA，基因组DNA用酶随机打断成短的DNA片段后，进行平末端修复。然后在DNA片段两端连接dA尾，并连接测序接头。加上接头的DNA片段经过AMPure XP磁珠进行纯化，并选择300-400bp范围的片段进行PCR扩增。建好的文库经过纯化、库检，Hiseq X10 PE150上机测序。

(3)测序数据分析

采用BSA-Seq对F2代分离群体进行分析，得到测序结果，对数据进行分析，利用DEEP-BSA软件的DEEP-learning算法获得置信区间(81.37Mb和90.17Mb)(如图2所示)。选通过分段选取多态性SNP位点，缩小范围，分别提取上下游各100bp的碱基序列，按照引物设计原则，设计KASP标记引物。

3.KASP试验对茄子果形调控基因的精细定位

KASP反应体系包含KASP引物混合物、KASP主混合物和DNA模板；所述KASP引物混合物包括正向引物F-1、正向引物F-2和反向引物；所述KASP主混合物包括正向引物F-1尾部FAM标记的寡序列、正向引物F-2尾部HEX标记的寡序列、FAM染料、HEX染料和淬灭剂；所述DNA模板为茄子基因组DNA。具体步骤如下：

a.PCR反应在ABIQ6 plus荧光定量PCR仪上进行，使用384孔PCR板，具体反应体系5μL：其中1μL DNA(60ngμL-1)，2.5ul KASP Master mix(2×)，0.21μL引物混合物(由浓度为10μmoL-1F_FAM、F_HEX和R按照1:1:1的体积比混合得到)，ddH

b.PCR循环反应程序：1.预变性：94℃变性15min；2.变性：94℃变性20s，61℃退火60s，共10个循环(从第2个循环开始，每个循环降低0.6℃)；3.变性：94℃变性20s，55℃退火60s，共26个循环；4.37℃降温保持1min。

采用KASP基因分型技术，对F2代分离群体进行基因定位，如图3所示，定位在两个SNP标记SNP分子标记I和SNP分子标记Ⅱ之间，其中SNP分子标记I位于Ch8的82372534，SNP分子标记Ⅱ位于Ch8的84085714，距离171.3Kb。

用于检测SNP分子标记I的KASP标记引物核苷酸序列为：

正向引物F-I-1的核苷酸序列SEQ ID NO.5如GAAGGTGACCAAG TTCATGCTTCAGGCCACTTGTAGTTCAAAACG所示；

正向引物F-I-2的核苷酸序列SEQ ID NO.6如GAAGGTCGGAGTC AACGGATTATTCAGGCCACTTGTAGTTCAAAACA所示；

反向引物I-R的核苷酸序列SEQ ID NO.7如CTTTGGAGTTCTTTGAAA TCGTGCGC所示。

用于检测SNP分子标记Ⅱ的KASP标记引物核苷酸序列为：

正向引物F-Ⅱ-1的核苷酸序列SEQ ID NO.8如GAAGGTGACCAAGTTCA TGCTTCACGTAAAATCAGAGAGGGAAATAATT所示；

正向引物F-Ⅱ-2的核苷酸序列SEQ ID NO.9如GAAGGTCGGAGTCAA CGGATTCACGTAAAATCAGAGAGGGAAATAATG所示；

反向引物Ⅱ-R的核苷酸序列SEQ ID NO.10如为CACTTGTCCAATAATAATGGACGAGTTTG所示。

当SNP位点I在等位基因中的碱基为C时，茄子肉色为绿色；当该SNP位点Ⅰ在等位基因中的碱基为T时，茄子肉色为白色。

图3所示SNP分子标记Ⅰ的基因分型结果，c表示绿肉纯合表型，a表示白肉纯合表型，b表示是绿肉杂合表型。

当SNP位点Ⅱ在等位基因中的碱基为A时，茄子肉色为白色；当该SNP位点Ⅱ在等位基因中的碱基为C时，茄子肉色为绿色。

如图4所示SNP分子标记Ⅱ的基因分型结果，a1表示F2群体中白肉纯合表型，c1表示F2群体中绿肉纯合表型，b1表示F2群体中的绿肉杂合表型。

如图5所示，是KASP基因分型精细定位调控茄子肉色的基因的结果，发现该区域存在1个QTL位点，LOD值为109.4815，PVE值为86.2750％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本发明的发明人来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。