一种利用生物发光报告系统鉴定肺炎克雷伯菌基因昼夜节律表达的方法

技术领域

本发明涉及一种利用生物发光报告系统鉴定肺炎克雷伯菌基因昼夜节律表达的方法。本发明属于生物技术领域。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)属肠杆菌科克雷伯菌属，革兰阴性菌。存在于自然界和健康人体中，当机体免疫力下降时，可引起多种炎症，如肺炎，脑膜炎，尿路感染，甚至是血液感染及肝脓肿等侵袭性感染。

昼夜节律(circadian rhythm)是指生命活动以大约24小时为周期的变动，又称节律。从原始蓝藻细菌到哺乳动物，生物体内都存在昼夜节律，生理行为的昼夜节律性调控对于维持生命体的正常生活至关重要。昼夜节律遭到破坏后代谢系统紊乱、生命活动受到影响，引起疾病发生。最近研究表明，在非光合细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中也存在昼夜节律，其细菌生物膜形成及相关基因表达遵循日常周期以此适应外界环境变化的节律。另外，在致病微生物产气克雷伯菌(Klebsiella aerogenes)的研究中发现，温度变化可以作为授时因子(zeitgeber)，即温度高低循环可以作为昼夜节律的夹带(entrainment)条件，通过模拟宿主体温的昼夜差异，使产气克雷伯菌的集群运动能力与夹带条件同步化，且在自由运行阶段仍维持一定周期的波动。然而，肺炎克雷伯菌如何感知时间，通过菌体内部生理代谢调节，使其分子表达适应一天中的时间，通过掌握细菌的昼夜节律，可以更精准时间进行临床给药，给生物医学、生物农业和工业生物技术领域带来有价值的信息。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种重组生物发光肺炎克雷伯菌；

本发明的目的之二在于提供一种利用生物发光报告系统鉴定肺炎克雷伯菌基因昼夜节律表达的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种重组生物发光肺炎克雷伯菌，所述的重组生物发光肺炎克雷伯菌为含有mqo启动子(Pmqo)驱动luxCDABE基因表达的重组质粒的肺炎克雷伯菌。

其中，优选的，所述的mqo启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，优选的，所述的重组质粒为mqo启动子(Pmqo)驱动luxCDABE基因表达的重组质粒pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE。

其中，优选的，所述的重组质粒pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE是通过以下方法构建得到的：

提取肺炎克雷伯菌标准株ATCC13883基因组DNA，PCR扩增两端添加酶切位点的mqo基因启动子序列Pmqo，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收纯化。pBBR1MCS4-luxCDABE质粒经Spe I单酶切后，通过无缝克隆实验将pBBR1MCS4-luxCDABE质粒和Pmqo目的片段连接，连接产物pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板筛选，得到pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE重组质粒的大肠杆菌DH5α单菌落，PCR电泳并测序鉴定；提取pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE重组质粒，电转化肺炎克雷伯菌ATCC13883感受态细胞，在含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板筛选，得到含pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE重组质粒的肺炎克雷伯菌ATCC13883单菌落。

其中，优选的，PCR扩增所采用的引物如下：

Pmqo-F：gaggaaaaaaaaatgactagtTCCCTTCTCTGCCAGGTGC

Pmqo-R：aatttttttagtcatactagtTGCAGGCATAATAGAATTATCACGTAGCAC。

进一步的，本发明还提出了所述的重组生物发光肺炎克雷伯菌在利用生物发光报告系统鉴定肺炎克雷伯菌基因昼夜节律表达中的应用。

更进一步的，本发明还提出了一种利用生物发光报告系统鉴定肺炎克雷伯菌基因昼夜节律表达的方法，包括以下步骤：

将未接触夹带条件的所述的重组生物发光肺炎克雷伯菌以1:100稀释在LB肉汤培养基中过夜培养，复苏菌株；将其暴露于周期恒定的循环温度条件下，即T＝24h，Δt＝3℃，培养细菌三天，之后释放到恒定34℃低温条件培养三天，具体的循环培养条件如下：

在重组生物发光肺炎克雷伯菌培养的60～96h之间，每4小时收集1mL菌液，通过小动物成像仪对其进行生物发光强度节律性进行检测并绘制曲线，数学模型拟合分析节律周期和振幅；

mFourfit函数模型：对重组生物发光肺炎克雷伯菌的平均生物发光亮度使用连续光度测量法分析其自由运行周期，使用mFourfit模型函数进行计算，函数模型如下:

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本实验通过构建代谢基因mqo驱动的重组生物发光的肺炎克雷伯菌，通过发光特性监测，直观的观察细菌基因表达在夹带条件下的变化规律。luxCDABE基因操纵子包含了编码荧光素酶和底物合成酶的基因，其中luxA、luxB编码异质二聚体荧光素酶，luxC、luxD和luxE合成脂肪醛，作为荧光素酶发光反应的底物。荧光素酶催化脂肪醛氧化，产生波长为450～490nm的可见蓝绿光。Lux生物发光报告系统具有不需添加外源底物，不影响宿主的正常生理功能的优点，可应用于鉴定肺炎克雷伯菌基因昼夜节律表达中。

附图说明

图1为pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE重组质粒鉴定结果；

M为100bp DNALadder；

图2为使用多功能小动物活体成像仪对生物发光细菌Kp-lux的生物发光进行收集，测定其发光强度；

图3为重组生物发光肺炎克雷伯菌Kp-lux温度夹带及自由运行条件下发光强度节律变化的qPCR及小动物成像平均生物发光强度监测；

图4为重组生物发光肺炎克雷伯菌Kp-lux温度夹带及自由运行条件下CFU菌落计数和OD

图5为Kp-lux在夹带及自由运行条件下生物发光平均亮度拟合余弦曲线周期。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本发明的研究内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1重组生物发光肺炎克雷伯菌(Pmqo::Kp-lux，后简称为Kp-lux)的制备

1.提取肺炎克雷伯菌质量控制株ATCC13883(简写Kp13883)基因组DNA：

使用Buffer GL、Proteinase K、RNase A、Buffer GB和无水乙醇裂解菌体，通过收集柱收集基因组DNA，Buffer WA和Buffer WB清洗收集柱，最后使用ddH

2.结合转录组测序和启动子序列预测分析，NCBI数据库验证筛选，确定mqo基因的启动子(Pmqo)序列，其序列如SEQ ID NO.1所示；

3.通过NCBI中primer-blast功能设计mqo基因的启动子序列两侧添加Spe I酶切位点的Pmqo的PCR引物(小写字母为酶切位点和保护碱基)：

Pmqo-F：gaggaaaaaaaaatg

Pmqo-R：aatttttttagtcat

4.以提取得到的肺炎克雷伯菌质量控制株ATCC13883基因组DNA为模板PCR扩增两端添加酶切位点的mqo基因启动子序列Pmqo，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收纯化；

PCR反应体系：Pmqo-F 2μl，Pmqo-R 2μl，dNTP Mix 1μl，2×Phanta Max Buffer25μl，Kp13883 genomic DNA 5μl，DNA Polymerase 1μl，dH

反应程序：95℃3min，(95℃15s，58℃15s，72℃50s，共35个循环)，72℃5min。

5.pBBR1MCS4-luxCDABE质粒经Spe I单酶切后，通过In-Fusion无缝克隆将pBBR1MCS4-luxCDABE质粒和Pmqo目的片段进行连接；

pBBR1MCS4-luxCDABE质粒单酶切体系：Spe I 2.5μl，10×M buffer 5μl，pBBR1MCS4-luxCDABE 2.5μl，dH

pBBR1MCS4-luxCDABE和Pmqo无缝克隆连接体系：Cloning reaction(Insert 1.5(Pmqo)μl，Linearized vector4(pBBR1MCS4-luxCDABE-cr)μl，5×In-Fusion SnapAssembly Master Mix 2μl，dH

6.连接产物pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE转化大肠杆菌DH5α化学转化感受态细胞中；涂布含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板筛选，得到pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE重组质粒的大肠杆菌DH5α单菌落，PCR电泳并测序鉴定；

7.提取pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE重组质粒，制备肺炎克雷伯菌Kp13883电转化感受态细胞，通过电击转化将重组质粒pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE转化进肺炎克雷伯菌电转感受态中；

8.在含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板筛选，得到含pBBR1MCS4-Pmqo-luxCDABE重组质粒的肺炎克雷伯菌Kp13883单菌落(Kp-lux)，对其进行菌落PCR鉴定，结果如图1所示。

实施例2重组生物发光肺炎克雷伯菌Kp-lux的生物发光检测

方法：

将未接触夹带条件(温度循环)的肺炎克雷伯菌Kp-lux以1:100稀释在LB肉汤培养基中过夜培养，复苏菌株。将其暴露于周期恒定的循环温度条件下(T＝24h，Δt＝3℃)培养细菌三天，之后释放到恒定低温条件(t＝34℃)培养三天，具体的循环培养条件如表所示(表1)。在Kp-lux培养的60～96h之间，每4小时收集1mL菌液，通过小动物成像仪对其进行生物发光强度节律性进行检测并绘制曲线，数学模型拟合分析节律周期和振幅。

mFourfit函数模型：对重组生物发光肺炎克雷伯菌Kp-lux的平均生物发光亮度使用连续光度测量法分析其自由运行周期，使用mFourfit模型函数进行计算，函数模型如下:

表1昼夜节律表达周期设定条件

结果：

使用多功能小动物活体成像仪对生物发光细菌Kp-lux的生物发光进行收集，测定其发光强度。1mL过夜培养的Kp-lux菌液在1.5mL Ep管中的发光强度如图2所示，其生物发光平均亮度为391.52CPS(countper second)。

图3为重组生物发光肺炎克雷伯菌Kp-lux温度夹带及自由运行条件下发光强度节律变化的qPCR及小动物成像平均生物发光监测；

图4为重组生物发光肺炎克雷伯菌Kp-lux温度夹带及自由运行条件下CFU菌落计数和OD

图5为Kp-lux在夹带及自由运行条件下生物发光平均亮度拟合余弦曲线周期。节律周期为10.14h，略小于预期的12h。推测为夹带12h后，监测数据有限，仅为7个监测点，夹带效果没有得到充分利用。节律性检验采用BD2EJTK进行，p值为0.00246，拟合曲线具备节律性。