新的多酚化合物

技术领域

本发明涉及由作为豆科植物的刺槐豆(Ceratonia siliqua L.)分离、纯化而获得的新的多酚化合物及其用途，进一步涉及该化合物的制造方法。

背景技术

刺槐豆(Ceratonia siliqua L.)是主要原产于地中海地方的豆科植物。刺槐豆的荚果、即刺槐豆的荚与果肉称为槐豆(carob)，自古以来便被食用或作为食品原料利用。成熟的荚果的长度是10～25cm左右，呈甜味。刺槐豆的荚果含有多量的多醣类、纤维素及矿物质类，且少量含有蛋白质、非碳水化合物系的低分子化合物等。近年来，刺槐豆新功能的相关研究正在进行，有报告指出刺槐豆的荚果(pod)萃取物对溃疡性大肠炎、胃溃疡等消化器官疾病具有预防与治疗效果(非专利文献1、2)。并且，专利文献1记载有刺槐豆的种子萃取物具有α-葡糖苷酶抑制活性，且具有抑制体重增加的效果(专利文献1)。

另一方面，胶原蛋白是占生物体总蛋白质约20％的重要蛋白质。胶原蛋白主要是存在于结缔组织，负责对软骨、骨头、腱、韧带、真皮及眼白部分等多数组织赋予强度、赋予弹性/伸展性的功用。并且，胶原蛋白是细胞外基质的主要构成成分。胶原蛋白依照其结构存在有数十种形式，在皮肤的真皮中含有非常多的I型胶原蛋白，且对皮肤赋予强度与弹性。针对该I型胶原蛋白的表达与生成，COL1A1基因发挥重要的功用，I型胶原蛋白是由COL1A1基因所编码的2条α1链、与COL1A2基因所编码的1条α2链构成。由于胶原蛋白具有保持皮肤弹性的功用，因而已知随年龄增加导致胶原蛋白减少，而成为皮肤出现皱纹的原因。所以，为了补充随年龄增加而减少的胶原蛋白，认为促进胶原蛋白基因的表达，而促进生物体内胶原蛋白的生成是有效手段。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-119999号公报

非专利文献

非专利文献1：Rtibi K,Jabri M A,Selmi S,et al.,"Preventive effect ofcarob(Ceratonia siliqua L.)in dextran sulfate sodium-induced ulcerativecolitis in rat",RSC Advances,2016年,Vol.6,p.19992-20000.

非专利文献2：Rtibi K,Selmi S,Grami D,et al.,"Chemical constituents andpharmacological actions of carob pods and leaves(Ceratonia siliqua L.)on thegastrointestinal tract：Areview",Biomedicine&Pharmacotherapy,2017年,Vol.93,p.522-528.

发明内容

发明要解决的问题

然而，上述非专利文献1、2与专利文献1中，虽然针对刺槐豆萃取物，报告有具有溃疡等消化器官疾病的治疗效果、体重增加的抑制效果，但尚未达到具体活性成分的特定。

再者，截至目前尚未有将刺槐豆使用于促进胶原蛋白基因表达的相关研究，其有效性完全处于不明朗状态。

因此，本发明是有鉴于上述事项而完成，其目的在于提供：源自刺槐豆的新的活性成分及其用途。

再者，本发明另一目的是提供：可促进胶原蛋白基因表达的新的胶原蛋白生成促进剂，其源自刺槐豆。并且，目的在于提供：含有该胶原蛋白生成促进剂的皮肤外用剂、化妆品及胶原蛋白生成促进用饮食品。

用于解决问题的手段

本发明人等从刺槐豆的荚果萃取物分离出新的多酚化合物，发现该新的化合物具有增加胶原蛋白基因表达量的作用。根据该见解而完成本发明。

为了解决上述问题，本发明是下述式(I)所示的化合物或其盐、或者它们的溶剂合物。

[化1]

式(I)所示的化合物是从刺槐豆(Ceratonia siliqua)的荚果萃取物分离、纯化而得的新的多酚化合物，具有优异的胶原蛋白生成促进作用。

再者，本发明的胶原蛋白生成促进剂含有上述式(I)所示的化合物或其盐、或者它们的溶剂合物。通过给予式(I)所示的化合物，便可促进胶原蛋白基因的表达，而促进胶原蛋白生成。

再者，本发明的胶原蛋白生成促进剂优选的是上述式(I)所示的化合物或其盐、或者它们的溶剂合物的浓度为0.0001mM～1mM。由此，可选择胶原蛋白生成促进效果优异的活性成分浓度。

再者，本发明的胶原蛋白生成促进剂优选是皮肤外用剂或化妆品。由此，可获得能促进皮肤中的胶原蛋白生成的皮肤外用剂或化妆品。

再者，本发明的胶原蛋白生成促进用饮食品含有上述式(I)所示的化合物或其盐、或者它们的溶剂合物。由此，可获得能促进生物体内的胶原蛋白生成的饮食品。

再者，本发明的上述式(I)所示的化合物的制造方法具有：获得刺槐豆(Ceratoniasiliqua)的荚果的含水醇萃取物的工序；将该含水醇萃取物依次利用石油醚、乙酸乙酯进行液液萃取，回收乙酸乙酯馏分的工序；以及从所回收的乙酸乙酯馏分中分离式(I)所示的化合物的工序。由此，可获得具有胶原蛋白生成促进作用的新的多酚化合物。

发明效果

根据本发明，可提供：具有如以下那样的优异效果的新的多酚化合物、胶原蛋白生成促进剂、皮肤外用剂、化妆品及饮食品。

(1)增加胶原蛋白基因的表达量，而能促进胶原蛋白生成。

(2)由于以由自古以来所食用的刺槐豆的荚果衍生的化合物作为有效成分，故对人体的安全性高。

附图说明

图1是表示本发明化合物的高分辨率ESI质谱的图。

图2是表示本发明化合物的紫外吸收光谱的图。

图3是表示本发明化合物的红外吸收光谱的图。

图4是表示本发明化合物的

图5是表示本发明化合物的

图6是表示本发明化合物的HSQC光谱的图。

图7是表示本发明化合物的HMBC光谱的图。

图8是表示本发明化合物的NOESY光谱的图。

图9是总括本发明化合物的

图10是表示本发明化合物的HMBC相关及NOESY相关的图。

图11是表示由本发明化合物所导致的胶原蛋白基因(COL1A1)的mRNA表达量的图。

具体实施方式

以下，针对本发明的新的多酚化合物及胶原蛋白生成促进剂、包含其的皮肤外用剂、化妆品、胶原蛋白生成促进用饮食品、以及该化合物的制造方法进行说明。

本发明的下述式(I)所示的新的多酚化合物是异阿魏酸(isoferulic acid)与没食子酸分别酯键结于葡萄糖而得的化合物。该化合物被授名为“OLANDU”(注册商标)。

[化2]

本发明的新的多酚化合物可为盐，优选是药理学上可接受的盐。作为该新的多酚化合物的药理学上可接受的盐，只要为与酸或碱形成的盐即可，并无特别的限定。并且，该新的多酚化合物或其盐可为溶剂合物，并无特别的限定，例如可举出：水合物、乙醇等有机溶剂合物。

本发明的新的多酚化合物“OLANDU”具有胶原蛋白生成促进作用，可作为胶原蛋白生成促进剂使用。其中，作为所促进生成的胶原蛋白，优选是皮肤中包含较多的I型胶原蛋白或III型胶原蛋白，更优选是I型胶原蛋白。

本发明中，所谓胶原蛋白生成促进，是指促进胶原蛋白基因表达、或促进胶原蛋白(蛋白质)表达，相较于没有添加或给予本发明新的多酚化合物的状态的对照组，胶原蛋白基因或胶原蛋白的表达呈亢进状态。更具体而言，胶原蛋白基因的表达水平优选是对照组的1.5倍以上、更优选是1.7倍以上、特别优选是2倍以上。胶原蛋白基因的表达水平是例如利用实时PCR(QPCR)、微阵列等公知的方法便可测定，而胶原蛋白的表达水平是例如利用免疫染色、免疫印迹法(Western Blotting)等公知的方法便可测定。

本发明的新的多酚化合物“OLANDU”是通过从刺槐豆的荚果分离、纯化便可获得。本发明所使用的刺槐豆的学名是Ceratonia siliqua，是豆科云实亚科刺槐豆属的植物。虽然是原产于地中海沿岸地方的植物，但在本发明中，产地、栽培环境并无特别的限定，可使用所有产地与栽培环境的刺槐豆。

针对本发明新的多酚化合物“OLANDU”的分离方法进行说明。首先，从刺槐豆的荚果获得含水醇萃取物。本发明中的所谓刺槐豆荚果的含水醇萃取物，是指在刺槐豆的荚果中添加作为萃取溶剂的含水醇，施行萃取处理而获得的萃取物。所谓刺槐豆的荚果，是指刺槐豆的带荚果实的荚与果肉，荚或果肉的任一者均可作为萃取材料使用，但更优选是使用荚和果肉。萃取处理是对采集的状态、即对生的状态的刺槐豆荚果、或干燥状态的刺槐豆荚果实施，但为了谋求萃取效率的提升、或为了容易处置，也可对经施行各种前处理的刺槐豆荚果施行萃取处理。作为前处理，并无特别的限定，可举出：干燥处理、破碎处理或粉碎处理等，也可对经施行这些前处理的刺槐豆的荚果实施萃取处理而获得萃取物。

对于构成作为萃取溶剂使用的含水醇的醇而言，只要能萃取本发明的多酚化合物，并无特别的限定，可举出例如：乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇、或异丁醇等。其中，从对人体的安全性与萃取效率等观点出发，萃取溶剂适合选择含水乙醇。并且，含水醇的醇浓度优选是50％～99％、更优选是60％～97％、特别优选是70％～95％。并且，在萃取溶剂中，在不致妨碍本发明化合物萃取的范围内，也可含有其他的成分。

作为利用含水醇施行的萃取方法，是在刺槐豆的荚果中添加作为萃取溶剂的含水醇并浸渍，而施行萃取。例如，当将刺槐豆荚果制成含水率小于10％的干燥破碎物时，相对于植物体1重量份，优选是使用萃取溶剂5～10重量份。并且，萃取方法是可利用室温中的萃取、加热萃取、加压加热萃取或亚临界萃取等任何方法实施，但从萃取效率的观点出发，优选是利用回流操作施行的加热萃取。并且，为了提高萃取效率，优选是施行多次萃取操作，更优选是改变萃取溶剂中的醇浓度而施行多次萃取操作。虽无特别的限定，具体而言是可举出：实施1～5次利用95％乙醇施行的回流萃取，接着再实施1～5次利用70％乙醇施行的回流萃取的萃取方法。萃取时间是根据萃取方法、萃取材料的形态、萃取溶剂的种类或萃取温度等进行各种设定，例如，使用70％～95％乙醇施行回流萃取时，1次的萃取时间优选是设为1～3小时左右、特别优选是设为1.5小时左右。经上述萃取处理后，通过利用倾析、离心分离或过滤等去除残渣，便可获得刺槐豆荚果的含水醇萃取物。通过对所获得萃取物施行减压蒸馏等处理，也可含有作为浓缩液、固态物者。

对于依上述方式所获得刺槐豆荚果的含水醇萃取物，由于认为存在刺槐豆荚果中大量含有的醣类等，因而在除去这些不需要的成分的目的下，也可利用离子交换树脂施行分离操作。具体而言，相对于刺槐豆荚果的含水醇萃取物1重量份，添加1～10重量份的水而使其分散，再通过已填塞大孔吸附树脂等离子交换树脂的管柱，吸附本发明的多酚化合物，使醣类等不需要的成分流出除去。然后，利用95％乙醇等洗脱，由此回收含有本发明多酚化合物的馏分。

接着，针对刺槐豆荚果的含水醇萃取物、或上述利用离子交换树脂分离的回收馏分进一步施行的分离操作进行说明。使含水醇萃取物或回收馏分分散于水系溶剂中，再依次利用石油醚、乙酸乙酯施行溶剂萃取。水系溶剂只要能使本发明多酚化合物分散，则并无特别的限定，合适使用50％含水甲醇。利用石油醚/水系溶剂施行多次液液萃取后，再利用乙酸乙酯/水系溶剂施行多次液液萃取。利用该溶剂萃取操作所回收的乙酸乙酯馏分中含有本发明的新的多酚化合物。利用各溶剂系的液液萃取的次数优选是2～10次左右、特别优选是5次左右。

从依上述方式获得的乙酸甲酯馏分，依照常法施行纯化，由此可分离本发明的新的多酚化合物“OLANDU”。纯化方法可举出：正相色谱法、反相色谱法、薄层色谱法、凝胶过滤色谱法及高效液相色谱法等，它们之中，可单独使用1种、或组合多种进行纯化。各种色谱法所使用的载体、洗脱溶剂等，可根据各种色谱法进行适当选择。

需要说明的是，依上述方式，从刺槐豆的荚果分离、纯化的本发明多酚化合物，可不作为纯物质分离，也可作为含有源自刺槐豆原料的其他成分的混合物使用。

本发明的新的多酚化合物“OLANDU”可作为促进胶原蛋白基因的表达，并促进生物体内胶原蛋白生成的胶原蛋白生成促进剂使用。利用本发明的化合物促进胶原蛋白生成，由此增加对象细胞中的胶原蛋白。

含有本发明新的多酚化合物“OLANDU”的胶原蛋白生成促进剂可作为用于增加皮肤细胞所含的胶原蛋白量，防止或改善皮肤老化，使皮肤保持于稳定状态的皮肤外用剂使用。并且，本发明的胶原蛋白生成促进剂可作为具有增加皮肤细胞所含的胶原蛋白量，预防或改善皮肤皱纹、松弛，使皮肤保持健康的作用的化妆品使用。

本发明胶原蛋白生成促进剂的给予量依照目标的胶原蛋白生成促进效果、预防或治疗效果、给予方法、年龄等而有所变化，因而无法一概地规定，当作为外用剂使用时，对于通常一天的非口服的给予量而言，本发明的多酚化合物优选设为0.02μg～30mg、更优选设为0.2μg～3mg、进一步优选设为2μg～300μg。并且，对于作为内用剂使用时的口服给予量而言，本发明的多酚化合物通常一天优选设为0.2μg～1000mg、更优选设为2μg～200mg。

本发明的胶原蛋白生成促进剂、皮肤外用剂及化妆品的剂型并无特别的限定，可举出例如：低粘度液体、洗剂(lotion)等液剂；乳液、凝胶、糊膏、乳霜、泡沫、面膜、软膏、粉剂、喷雾剂或贴剂等；以及锭剂、颗粒剂、胶囊剂或内服用液剂等。需要说明的是，本发明的胶原蛋白生成促进剂也可应用于化妆品、准医药品或医药品的任一者。具体的制品并无特别的限定，可举出：化妆水、化妆乳霜、化妆乳液、美容液、化妆面膜、化妆清洁剂、肥皂、护发剂、沐浴剂、或彩妆化妆品等。

本发明的胶原蛋白生成促进剂、皮肤外用剂及化妆品中，本发明新的多酚化合物的配混浓度优选是0.0001mM～1mM、更优选是1μM～100μM、进一步优选是5μM～20μM。通过将新的多酚化合物的配混量设在该范围内，便可稳定地配混本化合物，也可提高对皮肤的安全性、且可发挥高胶原蛋白生成促进效果。

本发明的胶原蛋白生成促进剂可利用以往惯用的方法制备为各种形态。此情况下，可使用通常制剂用的载体、赋形剂等作为医药品添加剂而可接受的添加剂进行制剂化。并且，为了提升本化合物的生物体可用率、稳定性，也可采用包含有微胶囊、微粉末化、使用环糊精等进行包藏化等的制剂技术的药物递送系统。

再者，本发明的胶原蛋白生成促进剂、皮肤外用剂及化妆品中，可适当配混作为皮肤外用剂及化妆品通常使用的成分的水、油脂类、蜡类、碳氢化合物类、脂肪酸类、高级醇类、酯类、植物萃取精华类、维生素类、水溶性高分子、表面活性剂、金属皂、醇、多元醇、pH调节剂、防腐剂、香料、粉体、增粘剂、色素或螯合剂等成分。进而，在不致损及本发明作用效果的范围内，可并用通常所使用的各种功能性成分，例如从保湿剂、美白剂、消炎剂、细胞活化剂、抗紫外线剂、血液循环促进剂、及抗氧化剂等中所选择的功能性成分的一种或两种以上。

再者，本发明的胶原蛋白生成促进用饮食品含有本发明新的多酚化合物“OLANDU”作为活性成分。本发明的胶原蛋白生成促进用饮食品可制成：锭剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂等补充剂形态；清凉饮料、果汁饮料、酒精性饮料等饮料；糖果、口香糖、小甜饼、饼干、巧克力等点心；面包、粥、谷物片、面类、果冻、汤汁、乳制品、调味料等所有形态。当依此作为饮食品使用时，在不致影响到本发明有效成分效能的范围内，也可与其他有效成分、维生素、矿物质或氨基酸等营养素等进行各种组合。本发明的饮食品包括有：补充剂、健康食品、功能性食品、特定保健用食品等。并且，本发明饮食品每1天的摄取量，是本发明多酚化合物通常一天优选设为0.2μg～1000mg、更优选设为2μg～200mg。

以下，针对本发明利用实施例进行更详细说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。

实施例

[实施例1]

1.刺槐豆荚果的含水醇萃取物的制备

采集后，从经干燥处理的刺槐豆(Ceratonia siliqua)的带荚果实中去除种子。将该刺槐豆的荚果利用粉碎机施行粉碎，获得粒径2mm以下的粉碎物。对20kg的粉碎物，添加140kg(7倍量)的含水95％乙醇，施行2次1.5小时回流萃取的操作后，对残渣更进一步利用140kg(7倍量)的含水70％乙醇施行1.5小时回流萃取。将所获得回流萃取液合并后，减压蒸馏去除溶剂而获得刺槐豆荚果的含水乙醇萃取物12.4kg。

[实施例2]

2.刺槐豆荚果的含水醇萃取物的分离与纯化

使实施例1所获得刺槐豆荚果的含水乙醇萃取物分散于1～10倍量的水中，使其吸附于离子交换树脂(大孔吸附树脂D101、Cangzhou Bon Adsorber Technology Co.,Ltd.)。利用管柱容量3倍量的蒸馏水洗脱而除去醣类等杂质后，利用管柱容量3倍量的含水95％乙醇洗脱，减压蒸馏去除溶剂，获得462.7g的乙醇洗脱馏分(非碳水化合物系低分子化合物馏分)。接着，使所获得乙醇洗脱馏分分散于1.0L的含水50％甲醇中，依次利用石油醚、乙酸乙酯分别各施行5次液液萃取。减压蒸馏去除各溶剂，分别获得石油醚馏分28.4g、乙酸乙酯馏分139.4g及水系馏分290.2g。

其次，针对135.0g乙酸乙酯馏分，施行正相硅胶管柱色谱法(管柱填充材料：200～300筛目、青岛海洋化工场制品)，使用石油醚(P)/乙酸乙酯(E)及二氯甲烷(C)/甲醇(M)2种展开溶剂洗脱，而施行分离。该结果，获得108个洗脱馏分。针对所获得108个洗脱馏分，利用薄层色谱法施行鉴定，合并类似的馏分，获得10个洗脱馏分A～J。

其次，针对洗脱馏分F(8.5g)与洗脱馏分G(9.6g)，施行反相ODS管柱色谱法(管柱填充材料：40～63μm、Merck公司制品)，利用甲醇：水＝15：85→100：0的梯度洗脱施行分离。针对所获得洗脱馏分，利用薄层色谱法施行鉴定，合并类似的馏分，获得6个洗脱馏分F1～F6。

其次，针对洗脱馏分F4(4.2g)施行凝胶过滤色谱法(管柱填充材料：Sephadex LH-20)，利用二氯甲烷：甲醇＝1：1洗脱，获得5个洗脱馏分F4a～F4e。

其次，对洗脱馏分F4c(1.1g)施行半制备HPLC(管柱I：YMC-Pack ODS-A、250×20mm、5μm)，利用甲醇：水＝40：60、检测波长217nm进行分离，获得3个馏分F4c1、F4c2及F4c3。其中，对馏分F4c2施行半制备HPLC(管柱II：YMC-Pack ODS-A、250×10mm、5μm)，利用甲醇：水＝36：64、检测波长217nm进行分离，获得本发明化合物(以下将该化合物称为“OLANDU”)23.8mg(保持时间tR＝37.14分钟)。

[实施例3]

3.化合物(OLANDU)的结构解析

施行实施例2所获得化合物、“OLANDU”的结构解析。结构解析时，施行高分辨率质谱分析(HR-ESI-MS，负离子模式)、紫外吸收光谱分析、红外吸收光谱分析、

·高分辨率质谱分析：电喷洒离子化四极飞行时间式质谱仪(Bruker Daltonics公司制品)

·紫外吸收光谱分析：紫外可见分光光度计(UV-2401PC、株式会社岛津制作所制品)

·红外吸收光谱分析：FT-IR(NEXUS470、Thermo nicolet公司制品)

·NMR分析：600MHz核磁共振装置(AVANCE III 600、Bruker公司制品)

OLANDU的物理性质如下所述。高分辨率质谱分析(HR-ESI-MS)的光谱示于图1，紫外吸收光谱分析的结果示于图2，红外吸收光谱分析的结果示于图3。

·性状：黄色粉末

·HR-ESI-MS(negative(负性))m/z：507.1180[M-H]

·紫外吸收光谱：λmax(MeOH)nm(logε)：192.2(3.82),218.0(4.26),291.0(4.02),322.4(3.95)

·红外吸收光谱(KBr、cm

高分辨率质谱分析(图1)的结果，根据准分子离子峰是m/z507.1180[M-H]

再者，根据利用

再者，根据由HMBC分析所获得光谱(图7)，在H-2与C-4/C-6、H-5与C-1/C-3、H-6与C-4、H-7与C-2/C-6/C-9、H-8与C-1、以及OCH

[化3]

[实施例4]

4.OLANDU的胶原蛋白基因的表达促进作用的探讨

使用实施例2所获得OLANDU，调查在作为源自人类表皮的角化细胞株的HaCaT细胞中，胶原蛋白基因(COL1A1基因)的表达促进效果。

首先，将HaCaT细胞使用DMEM培养基(含有：10％FBS与100U/mL青霉素、100μm/mL链霉素)，在37℃、5％CO

待培养结束后，从各孔中回收HaCaT细胞，使用RNA萃取试剂(RNAzol(注册商标)、Molecular Research Center公司制品)，萃取总RNA(total RNA)。使用超微量分光光度计(NanoDrop、ThermoFisher Scientific公司制品)，确认经萃取获得的总RNA(total RNA)浓度。在该总RNA(total RNA)中，添加：寡dT引物、dNTP混合物(dNTP Mix)、5×第一链缓冲液、RNase抑制剂、DTT及M-MLV逆转录酶，而从总RNA(total RNA)合成eDNA。使用该cDNA，利用实时PCR(QPCR)测定胶原蛋白基因的表达量。

QPCR是使用市售QPCR试剂盒与QPCR测定装置(Light Cycler(注册商标)480、Roche Diagnostics株式会社制品)实施，检测时使用作为双链DNA结合荧光色素的SYBR(注册商标)Green。目标基因是选择编码I型胶原蛋白的α1链的COL1A1基因，QPCR用引物是使用下述表1所示序列编号1、2的引物。

[表1]

结果示于图11。胶原蛋白基因(COL1A1基因)的mRNA表达量是以将对照(对照组)的表达量设为100时的相对值表示。如图11所示，通过添加本发明的化合物、OLANDU，相较于未添加的对照，得知胶原蛋白基因的表达量大幅增加。即使OLANDU的浓度为1μM，胶原蛋白基因的表达量仍增加约2倍，10μM时则胶原蛋白基因的表达量增加3倍以上，得知表达促进作用最高。

本发明并不局限于上述实施方式或实施例，在不脱离权利要求书所记载发明主旨的范围内的各种设计变更方案，均涵盖于技术范围内。

产业上的可利用性

本发明的新的多酚化合物可作为胶原蛋白生成促进剂、皮肤外用剂及化妆品使用，并广泛利用于医疗、美容领域。

序列表自由文本

序列编号1：目标基因：COL1A1的QPCR用正向引物

序列编号2：目标基因：COL1A1的QPCR用反向引物

序列表

<110> 拿波佳尔股份有限公司

<120> 新的多酚化合物

<130> PCT22-001

<150> JP 2021-066340

<151> 2021-04-09

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

tctgcgacaa cggcaaggtg20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

gacgccggtg gtttcttggt20