一种改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明属于益生菌剂技术领域，涉及一种改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌BBr16及其应用，具体涉及一种短双歧杆菌

背景技术

随着全球人口老龄化趋势的加剧，脑功能障碍的发病率迅速增加，其中包括神经退行性疾病。尽管已有研究证明了一些缓解这些症状的方法，但记忆缺陷仍然是老年人口中严重的问题。肠道作为主要的营养吸收器官，含有约1014种微生物，而肠道菌群在正常生理条件下保持着平衡。与衰老相关的认知障碍的发病机制与肠-肝轴失衡和肠源性内毒素血症密切相关。此外，肠道源性的脂多糖还可促进炎症反应。

双歧杆菌是一种益生菌，广泛存在于人体肠道中，并被认为是肠道微生态平衡的重要组成部分。双歧杆菌具有良好的黏附性，能够维持肠道菌群的结构，并有效保护肠粘膜形态和代谢功能的完整性。双歧杆菌在预防和治疗肠道菌群失调方面发挥着重要作用，其主要机制包括通过空间位阻的方式调节菌群的平衡。此外，双歧杆菌还能产生多种抑菌成分，如酸性物质、抗菌肽和生物酶，从而抑制病原菌的生长和活性。作为一种益生菌，双歧杆菌微生态制剂具有安全健康、无副作用的特点，并能在动物体内定植并发挥多种有益的健康效果，因此在临床补充剂领域得到了广泛应用。

目前尚缺乏针对与衰老相关的认知障碍的特定药物，根据与衰老相关的认知障碍的发病机制和临床途径，治疗与衰老相关的认知障碍可选择抗炎细胞因子、抗氧化剂以及调节肠道菌群的方法。在这一背景下，开发更多的益生菌产品以改善与衰老相关的认知障碍显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌BBr16及其应用，具体提供一种短双歧杆菌

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌，所述改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌命名为短双歧杆菌

本发明从广西巴马瑶族自治县母乳喂养健康婴儿粪便中分离获得并保藏了一株新的能够预防或治疗与衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌，将其命名为短双歧杆菌

本发明所涉及的短双歧杆菌

（1）选取分离自广西巴马瑶族自治县母乳喂养健康婴儿粪便样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的多株菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为40%的甘油进行保藏。

（2）针对保藏的多株单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株耐胃酸和胆盐能力（人工模拟）更优的单菌株，对其进行鉴定并保藏。

第二方面，本发明提供一种改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌的培养物，所述培养物的制备方法包括：将第一方面所述的短双歧杆菌

上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

所述培养基可采用MRS培养基，其配方组成示例性地包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K

第三方面，本发明提供一种预防、改善或治疗与衰老相关的认知障碍的益生菌剂，所述益生菌剂中的菌株包括第一方面所述的短双歧杆菌

本发明所涉及的短双歧杆菌

优选地，在益生菌剂中，所述短双歧杆菌

优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

优选地，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。

优选地，所述保护剂包括脱脂乳粉。

所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述益生菌剂中的菌株还包括副干酪乳杆菌

本发明还创造性地发现上述BBr16菌株能够与LC86菌株进行复配使用用于预防、改善或治疗与衰老相关的认知障碍，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明BBr16菌株与LC86菌株在上述功效上具有协同增效作用。

进一步优选地，所述短双歧杆菌

基于BBr16菌株与LC86菌株在上述功效上的潜在相互作用，两种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。

第四方面，本发明提供根据第一方面所述的短双歧杆菌Bifidobacterium breveBBr16菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备具有预防、改善或治疗与衰老相关的认知障碍的药物或保健品中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明从广西巴马瑶族自治县母乳喂养健康婴儿粪便样本中分离获得并保藏了一株新的能够预防或治疗与衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌，将其命名为短双歧杆菌

附图说明

图1是各组小鼠的衰老程度评估结果统计图；

图2是旷场试验中各组小鼠的移动距离（cm）；

图3是旷场试验中各组小鼠在中心区域的停留时间（s）；

图4是水迷宫试验中各组小鼠到达平台的延迟时间（s）；

图5是各组小鼠双侧纹状体和海马中多巴胺和5-羟色胺的水平统计图；

图6是各组小鼠的血清肿瘤坏死因子TNFα、白介素6（IL6）、MCP1和IL10的水平统计图；

图7是各组小鼠结肠组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化物酶（CAT）和丙二醛（MDA）水平统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述涉及的短双歧杆菌BBr16菌株，其分类命名为短双歧杆菌

下述涉及的副干酪乳杆菌LC86菌株，其分类命名为副干酪乳杆菌

下述使用的MRS固体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2g、酵母粉5 g、柠檬酸氢二铵2 g、K

下述使用的MRS液体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2g、酵母粉5 g、柠檬酸氢二铵2 g、K

下述涉及的菌悬液制备方法：将所需菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，使用PBS重悬菌体，即得。

试验动物为SPF级雄性老化加速（SAMP8）小鼠，小鼠饲料购自上海斯莱克公司；测定TNFα、IL1b、IL6和MCP1水平用购自上海酶联生物科技有限公司的ELISA试剂盒；测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化物酶（CAT）和丙二醛（MDA）水平用购自南京建成生物工程公司的检测试剂盒。

下述试验结果图中统计学方法为使用R语言（R4.2.2）进行统计分析，使用ggplot2包进行作图，其中，柱状图上有不同字母的表示组间有显著差异（p<0.05）。

实施例1

本实施例筛选一株改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌，步骤如下：

（1）选取分离自广西巴马瑶族自治县母乳喂养健康婴儿粪便样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的多株菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为40%的甘油进行保藏。

（2）针对保藏的多株单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株耐胃酸和胆盐能力（人工模拟）更优的单菌株，具体如下：

（2.1）耐酸和胆盐能力测试：

把MRS培养基的pH调到3.0，121℃下15min灭菌后按2%的接种量接入已活化两代的液体培养扩培物，37℃培养24h，测定其在24h过程中的吸光度的变化∆OD

耐酸性实验：以pH=6.80的PBS缓冲液为基础，再用37%的盐酸将其调至3.0，121℃下15min灭菌后按10%接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min取样测定活菌数。

耐胆盐实验：菌种活化两代后的液体培养物以2%接种量接入含有不同胆盐浓度的MRS培养基中（培养基中分别含0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、2%胆盐），同时以不含胆盐的MRS培养基为对照，在37℃恒温培养24h后取样测定活菌数，结合上一个实验结果筛选出耐酸耐胆盐的优良菌株。

（2.2）产酸能力测试：

采用滴定法测定菌株的产酸能力。取甘油管保藏的菌株活化后按2%接种量接种于MRS液体培养基，37℃恒温培养18h，取各菌株的发酵液10mL于50mL无菌水中，滴加2-3滴1g/L的酚酞作为指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液进行滴定，以溶液出现粉红色且30s后不褪色为滴定终点，每个样品3次平行。以未接种的MRS液体培养基作空白对照，其计算公式为：总酸度/(g·L

综合上述筛选实验，选择乳酸产量最多且胃酸胆盐耐受能力最强的一株菌株。

实施例2

本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行生理生化特征以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：

（1）生理生化特征如下表1所示：

表1

（2）16S rDNA分子生物学鉴定：

将-80℃保藏的菌株取出，按2%比例接种于装有20mL MRS液体培养基的离心管中，在37℃下培养24 h后进行离心分离，8000 rpm下离心15min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为短双歧杆菌。

SEQ ID No:1：

GCAAGGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGACGTTGCTGATTCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCAGCTCGCACTGTCGCATCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCGGCACAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAACCCCATCTCTGGGATCGTCGGGAACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAAAGGTACACTCAACACAAAGTGCCTTGCTCCCTAACAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGAAGCCATGGTGGGCCGTTACCCCGCCATCAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAGGCTTTCCCAACACACCATGCGGTGTGATGGAGCATCCGGCATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCATGGGGCAGGTCGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCACCAAGCAAAGCCCGATGGATCCCGTTCGACT。

基于实施例2的16S rDNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于短双歧杆菌，命名为短双歧杆菌

实施例3

本实施例对短双歧杆菌BBr16菌株的培养条件进行优化，步骤如下：

将短双歧杆菌BBr16菌株接种于MRS液体培养基中，分别于10-50℃的不同温度下培养48 h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD

表2

结果显示，短双歧杆菌BBr16菌株在35-40℃下生长最佳，培养18-22 h即可达到生长稳定期。

实施例4

本实施例验证短双歧杆菌BBr16菌株的耐胃酸、胆盐能力，步骤如下：

（1）制备人工胃液、胆盐：

以质量分数计，人工胃液中含有0.20%的NaCl以及0.30%的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。

10%牛胆盐：称取10.0g牛胆盐（沃凯，国药集团化学试剂有限公司，中国上海）至100mL无菌水中，0.22um滤膜过滤除菌。

含0.1%胆盐MRS培养基：按说明书配制MRS培养基（北京索莱宝科技有限公司），高压蒸汽灭菌（121℃，15min）后，加入适量10%牛胆盐溶液至终浓度为0.1%。

（2）耐胃酸能力测试：

取1.0 mL短双歧杆菌BBr16菌悬液（浓度为1×10

存活率（%）=N1/N0×100%，

其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表3。

表3

（3）耐胆盐能力测试：

取1.0 mL短双歧杆菌BBr16菌悬液（浓度为1×10

存活率（%）=N1/N0×100%，

其中，N1：胆盐处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果为存活率为32%。

由上述结果可以看出，本发明所述的短双歧杆菌BBr16具有良好的耐胃酸能力和耐胆碱能力，良好的胃酸和胆盐耐受能力为其在胃肠道定植，维持胃肠道黏膜屏障稳态以及制备预防、改善或治疗衰老相关的认知障碍的产品创造了条件。

实施例5

本实施例探究短双歧杆菌

（1）动物分组：将50只16周龄成年雄性老化加速小鼠（SAMP8）(22±2 g)随机分为5组，每组10只，分别模型对照组（CTL组）、短双歧杆菌BBr16干预组（BBr16组），副干酪乳酪杆菌LC86干预组（LC86组），以及短双歧杆菌BBr16和副干酪乳酪杆菌LC86复合菌干预组（BBr16+LC86组，活菌数比例4:1），以及短双歧杆菌BBr16和副干酪乳酪杆菌ATCC27092复合菌干预组（BBr16+ ATCC27092组，活菌数比例4:1）。同时以10只16周龄成年雄性雄性老化加速小鼠（SAMP8） (22±2g)为年轻对照组。所有小鼠均无特定病原体。将小鼠单独饲养于笼内，环境清洁安静，温度23-25℃，湿度50-70%。各组小鼠在实验期自由获得食物和水。

（2）干预方法：BBr16组以1×10

（3）使用分级评分系统对上述各组小鼠衰老程度进行评估，每个类别都有5个等级，分别记为0、1、2、3、4，分数越高表示衰老越严重。评估中使用的指标包括反应性行为、被动性行为、光泽度、粗糙度、脱发、皮肤溃疡、眼周病变和脊柱前凸后凸等方面。将各方面的评分相加以获得每只小鼠的评分，小鼠衰老的评分标准如表4所示。

表4

各组小鼠的衰老程度评估结果如图1所示（以平均值呈现），由图可知，与年轻对照组的青年鼠相比，模型对照组（CTL）的衰老评分显著升高。与模型对照组（CTL）相比，菌株干预后评分有不同程度地降低，其中BBr16+LC86组降低程度最高，高于BBr16组和LC86组，说明BBr16菌株与LC86菌株在改善老化加速小鼠的衰老程度上具有协同增效作用。

（4）对认知能力的评估，通过旷场实验和水迷宫实验来评估小鼠的空间学习和记忆能力。

旷场实验方法：将小鼠轻轻转移到大小为25×25×40 cm的有机玻璃活动室中。让小鼠自由探索活动室，持续10分钟。观察和记录小鼠在旷场活动室中的行为表现，包括移动距离（cm）和在中心区域的停留时间（s）。每次实验后，使用70%乙醇清洁腔室以减少气味干扰。统计结果如图2和图3所示（以平均值呈现）。

水迷宫实验方法：实验在圆形水池中进行，水池直径为100厘米，高度为40厘米，水深为30厘米，水的温度保持在26 ± 1°C。在为期6天的训练期间，小鼠每天进行四次水下寻找平台的训练。如果小鼠在60秒内无法到达平台，它们将被引导到平台上。第七天，平台被移除，小鼠被允许有60秒的时间进行迷宫搜索。使用诺达思（Noldus）的Ethovision动物运动轨迹跟踪系统（Ethovision XT）分析小鼠的游泳路径。记录小鼠到达平台的延迟时间（s）。统计结果如图4所示（以平均值呈现）。

由上图结果可知，BBr16可以显著改善小鼠因衰老引起的认知障碍，其中BBr16+LC86组的改善能力最佳，高于BBr16组和LC86组，说明BBr16菌株与LC86菌株在改善小鼠因衰老引起的认知障碍上具有协同增效作用。

（5）对小鼠脑部神经递质水平的影响，考察各组小鼠双侧纹状体和海马中多巴胺和5-羟色胺的水平。

采集小鼠两侧纹状体和海马体样本后匀浆，并在12000g 4°C下进行离心10 min。上清使用0.22 μm膜进行过滤，过滤液用于HPLC-MS检测。在HPLC部分，采用赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific公司）的超高效液相系统（Thermo Vanquish），并使用沃特世（Waters）公司的色谱柱（ACQUITY UPLC HSST3）（2.1 × 150 mm, 1.8 μm）。流速设置为0.25 mL/min，柱温为40°C，进样量为2 μL。在质谱部分，使用赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）的质谱检测器（Thermo Q Exactive Focus），并分别在正离子和负离子模式下使用电喷雾离子源(ESI)进行数据采集。各组的统计结果如图5所示（以平均值呈现）。

由上图结果可知，BBr16可以显著提高老化加速小鼠双侧纹状体和海马体中多巴胺和5-羟色胺的水平，其中BBr16+LC86组的提高幅度最大，优于BBr16组和LC86组，说明BBr16菌株具有优异的改善衰老相关的认知障碍的效果，且BBr16菌株与LC86菌株在上述功效上具有协同增效作用。

（6）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠的血清肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素6（IL6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP1）和白介素10（IL10）的水平。

采集各组的血清样品，使用ELISA试剂盒测定血清肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素6（IL6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP1）和白介素10（IL10）的水平，结果如图6所示，由图结果可知，给予BBr16干预后，可以降低血清肿瘤坏死因子α、白介素6和单核细胞趋化蛋白-1的生成，促进血清IL10的生成，且BBr16+LC86组的效果更为明显。

（7）氧化应激标志物的检测。

实验结束后处死小鼠，各组小鼠结肠加入生理盐水中，然后匀浆，得到10%结肠匀浆。将匀浆离心10 min（5,000 g，4℃）以获得上清液。通过南京建成生物工程公司的检测试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化物酶（CAT）和丙二醛（MDA）水平。

结果如图7所示，由图结果可知，给予BBr16干预后，可以提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、过氧化物酶的水平，降低丙二醛的水平，且BBr16+LC86组的效果更为明显。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。