一种通过微生物转化制备羧甲基海藻糖的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种通过微生物转化制备羧甲基海藻糖的方法及应用。

背景技术

海藻糖是以α，α-1,1糖苷键连接两个吡喃环葡萄糖分子的非还原性天然双糖，广泛存在于干旱或寒冷环境下的动植物体内，其结构式为式Ⅰ。羧甲基海藻糖(CMT)则是在海藻糖的碳6位羟基位置引入羧甲基基团后形成的一种新型的多功能活性分子(式Ⅱ)，该结构赋予了CMT独特的生物活性。

已有的发明专利CN 101348507 B一种羧甲基海藻糖的吸湿保湿剂及其制备，完全依托于化学合成技术，采用氯乙酸和碱性异丙醇两步化学合成的方法制备获取羧甲基海藻糖。然而，该工艺技术在生产过程可能会带来产物中溶剂和副产物残留及环境污染等问题，从而影响产物的纯度与功效。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了利用芽孢杆菌和毕氏酵母两种菌联合发酵技术，实现了羧甲基海藻糖的制备，该生产制备工艺技术无有机溶剂残留，也实现了产物生物安全性与生物活性的增益。获得的羧甲基海藻糖表现出优异的抵御胶原蛋白流失和抗衰老的生物活性。

为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种通过微生物转化制备羧甲基海藻糖的方法，包括以下步骤：

S1、制备静息细胞，将芽孢杆菌和毕氏酵母分别接种至肉汤培养基和YPD培养基中扩培，离心弃培养基收集菌体静息细胞；

S2、羧甲基转化，将步骤S1获得的芽孢杆菌和毕氏酵母的静息细胞接种至羧甲基化培养基连续培养一段时间后，得到富含羧甲基海藻糖的发酵液；

S3、纯化，将步骤S2所得发酵液依次经过离心、微滤、纳滤后收集上清液冷冻干燥，得到羧甲基海藻糖。

优选的，步骤S1中，肉汤培养基组成为：0.50wt％-1.50wt％牛肉膏、0.10wt％-1.00wt％蛋白胨、0.10wt％-0.50wt％NaCl，调pH至5.5-6.5。

进一步优选的，肉汤培养基的扩培条件为：100-200rpm、35-37℃摇床好氧发酵48-72h。

优选的，步骤S1中，YPD培养基组成为：0.10wt％-1.00wt％酵母膏、1.00wt％-2.00wt％蛋白胨、0.30wt％-2.00wt％葡萄糖，调pH至5.5-6.5。

进一步优选的，YPD培养基的扩培条件为：150-250rpm、25-30℃摇床兼性厌氧发酵48-72h。

优选的，所述步骤S2中，羧甲基化培养基组成为：0.10wt％-1.00wt％海藻糖、0.30wt％-0.40wt％复合氨基酸、0.10wt％-1.00wt％甜菜碱、0.03wt％-0.04wt％二硫苏糖醇、0.10wt％-1.00wt％NaHCO

优选的，芽孢杆菌和毕氏酵母的静息细胞接种量为1.00wt％-2.00wt％。

进一步优选的，步骤S2中，发酵培养条件为150-250rpm、30-35℃摇床兼性厌氧发酵24-48h。

优选的，步骤S3中，微滤采用的是0.22μm的微孔滤膜。

优选的，步骤S3中，纳滤收集的分子量为300Da-1000Da。

优选的，步骤S1中，毕氏酵母为毕氏酵母MF060，其分类命名为：毕氏酵母，拉丁文名称为：Pichia pastoris，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：武汉大学，保藏日期为：2022年12月01日，保藏编号为：CCTCC No:M 20221817。

优选的，芽孢杆菌为常规市售菌种。

本发明的第二个方面，提供了本发明所述的方法制备的羧甲基海藻糖，羧甲基海藻糖纯度≥98％，C-6位化学位移至69.8ppm，C-7、C-8的化学位移分别为72.9ppm和175.4ppm。

优选的，一种通过微生物转化制备羧甲基海藻糖的方法，包括以下步骤：

S1、制备静息细胞，将芽孢杆菌和毕氏酵母分别接种至肉汤培养基和YPD培养基中扩培，离心弃培养基收集菌体静息细胞；

S2、羧甲基转化，将步骤S1获得的芽孢杆菌和毕氏酵母的静息细胞接种至羧甲基化培养基连续培养一段时间后，得到富含羧甲基海藻糖的发酵液；

S3、纯化，将步骤S2所得发酵液依次经过离心、微滤、纳滤后收集上清液冷冻干燥，得到羧甲基海藻糖。

优选的，步骤S1中，肉汤培养基组成为：0.50wt％-1.50wt％牛肉膏、0.10wt％-1.00wt％蛋白胨、0.10wt％-0.50wt％NaCl，调pH至5.5-6.5。

进一步优选的，肉汤培养基的扩培条件为：100-200rpm、35-37℃摇床好氧发酵48-72h。

优选的，步骤S1中，YPD培养基组成为：0.10wt％-1.00wt％酵母膏、1.00wt％-2.00wt％蛋白胨、0.30wt％-2.00wt％葡萄糖，调pH至5.5-6.5。

进一步优选的，YPD培养基的扩培条件为：150-250rpm、25-30℃摇床兼性厌氧发酵48-72h。

优选的，所述步骤S2中，羧甲基化培养基组成为：0.10wt％-1.00wt％海藻糖、0.30wt％-0.40wt％复合氨基酸、0.10wt％-1.00wt％甜菜碱、0.03wt％-0.04wt％二硫苏糖醇、0.10wt％-1.00wt％NaHCO

优选的，芽孢杆菌和毕氏酵母的静息细胞接种量为1.00wt％-2.00wt％。

进一步优选的，步骤S2中，发酵培养条件为150-250rpm、30-35℃摇床兼性厌氧发酵24-48h。

优选的，步骤S3中，微滤采用的是0.22μm的微孔滤膜。

优选的，步骤S3中，纳滤收集的分子量为300Da-1000Da。

优选的，步骤S1中，毕氏酵母为毕氏酵母MF060，其分类命名为：毕氏酵母，拉丁文名称为：Pichia pastoris，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：武汉大学，保藏日期为：2022年12月01日，保藏编号为：CCTCC No:M 20221817。

优选的，芽孢杆菌为常规市售菌种。

本发明的第三个方面，提供了本发明所述的羧甲基海藻糖在制备抗衰老产品中的应用。

综上所述，本发明本专利技术利用天然海藻糖为底物，通过一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)和一株毕氏酵母MF060的混合发酵技术，以甜菜碱、碳酸氢钠等为供体，完成了两种菌混合发酵转化的过程，获取的发酵物通过相应的分离纯化以及鉴定手段，提取获得了羧甲基海藻糖。本发明采用微生物法将海藻糖的6’-OH进行了羧甲基化，获取了羧甲基海藻糖，实现生物活性的增益。对比已有的公开技术，本发明的优点包括但不限于：1)采用微生物发酵的方法制备羧甲基海藻糖克服了传统化学合成法中的溶剂残留与环境污染问题；2)通过筛选微生物将海藻糖以混合发酵的方式转化为羧甲基海藻糖，提升了产物的生物安全性并提供了一种新的产物制备方法；3)获得的羧甲基海藻糖纯度高，并表现出优异的抵御胶原蛋白流失和抗衰老的生物活性，可广泛应用于化妆品保湿水、精华液等产品中。

与现有技术相比，应用本发明的技术方案的有益效果及显著进步在于：本发明提供的一种通过微生物转化制备羧甲基海藻糖的方法，以天然海藻糖为底物，以甜菜碱、碳酸氢钠等为补加供体，利用一株芽孢杆菌与一株毕氏酵母MF060的混合发酵技术，将海藻糖转化为羧甲基海藻糖，本发明的方法既无溶剂残留，又实现了产物生物安全性与生物活性的双向增益；获得的羧甲基海藻糖表现出优异的抵御胶原蛋白流失和抗衰老的生物活性。

附图说明

为更清楚地说明本发明的技术方案，以下将对本发明的实施例使用的附图进行简单介绍。

图1是本发明实施例5中的羧甲基海藻糖HPLC图谱；

图2是本发明实施例5中的羧甲基海藻糖NMR图谱；

图3是本发明实施例5中的羧甲基海藻糖对基质金属蛋白酶(MMP-1)的抑制作用效果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明。实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

此外，以下实施例和对比例中所涉及的反应装置、化学试剂均市售可得，所涉及的检测仪器、检测试剂均市售可得。芽孢杆菌为常规市售菌种，毕氏酵母为毕氏酵母MF060，其分类命名为：毕氏酵母，拉丁文名称为：Pichia pastoris，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：武汉大学，保藏日期为：2022年12月01日，保藏编号为：CCTCC No:M20221817。

实施例1

1.1、静息细胞制备

芽孢杆菌：准确称取1.50wt％牛肉膏、1.00wt％蛋白胨、0.50wt％NaCl，调pH至6.5，高压蒸汽灭菌121℃、30min后冷却至室温，接入芽孢杆菌于200rpm、37℃摇床好氧发酵72h，将所得菌液稀释至1×10

毕氏酵母MF060：准确称取1.00wt％酵母膏、2.00wt％蛋白胨、2.00wt％葡萄糖，调pH至6.0，高压蒸汽灭菌121℃、30min后冷却至室温接入毕氏酵母MF060于250rpm、30℃摇床兼性厌氧发酵72h，将所得菌液稀释至1×10

1.2、混菌发酵

准确称取1.00wt％海藻糖、0.40wt％复合氨基酸、1.00wt％甜菜碱、0.04wt％二硫苏糖醇、1.00wt％NaHCO

1.3、纯化干燥

采用5000rpm离心10min除去发酵残渣，采用0.22μm微孔滤膜除去菌体，采用纳滤截留分子量300Da-1000Da的组分，最后收集上清液冷冻干燥，得到其中的产物为羧甲基海藻糖。

实施例2

2.1、静息细胞制备

芽孢杆菌：准确称取1.00wt％牛肉膏、0.50wt％蛋白胨、0.40wt％NaCl，调pH至6.0，高压蒸汽灭菌121℃、30min后冷却至室温，接入芽孢杆菌于150rpm、36℃摇床好氧发酵60h，将所得菌液稀释至1×10

毕氏酵母MF060：准确称取0.50wt％酵母膏、1.50wt％蛋白胨、1.00wt％葡萄糖，调pH至5.8，高压蒸汽灭菌121℃、30min后冷却至室温接入毕氏酵母MF060于200rpm、27℃摇床兼性厌氧发酵60h，将所得菌液稀释至1×10

2.2、混菌发酵

准确称取0.50wt％海藻糖、0.35wt％复合氨基酸、0.50wt％甜菜碱、0.35wt％二硫苏糖醇、0.50wt％NaHCO

2.3、纯化干燥

采用5000rpm离心10min除去发酵残渣，采用0.22μm微孔滤膜除去菌体，采用纳滤截留分子量300Da-1000Da的组分，最后收集上清液冷冻干燥，得到其中的产物为羧甲基海藻糖。

实施例3

3.1、静息细胞制备

芽孢杆菌：准确称取0.50wt％牛肉膏、0.10wt％蛋白胨、0.10wt％NaCl，调pH至5.5，高压蒸汽灭菌121℃、30min后冷却至室温，接入芽孢杆菌于100、35℃摇床好氧发酵48h，将所得菌液稀释至1×10

毕氏酵母MF060：准确称取0.10wt％酵母膏、1.00wt％蛋白胨、0.30wt％葡萄糖，调pH至5.5，高压蒸汽灭菌121℃、30min后冷却至室温接入毕氏酵母MF060于150rpm、25℃摇床兼性厌氧发酵48h，将所得菌液稀释至1×10

3.2、混菌发酵

准确称取0.10wt％海藻糖、0.30wt％复合氨基酸、0.10wt％甜菜碱、0.03wt％二硫苏糖醇、0.10wt％NaHCO

3.3、纯化干燥

采用5000rpm离心10min除去发酵残渣，采用0.22μm微孔滤膜除去菌体，采用纳滤截留分子量300Da-1000Da的组分，最后收集上清液冷冻干燥，得到其中的产物为羧甲基海藻糖。

实施例4

本实施例为实施例1-3的对比例

4.1、静息细胞制备

芽孢杆菌：准确称取1.50wt％牛肉膏、1.00wt％蛋白胨、0.50wt％NaCl，调pH至6.5，高压蒸汽灭菌121℃、30min后冷却至室温，接入芽孢杆菌于200rpm、37℃摇床好氧发酵72h，将所得菌液稀释至1×10

酿酒酵母：准确称取1.00wt％酵母膏、2.00wt％蛋白胨、2.00wt％葡萄糖，调pH至6.0，高压蒸汽灭菌121℃、30min后冷却至室温接入酿酒酵母于250rpm、30℃摇床兼性厌氧发酵72h，将所得菌液稀释至1×10

4.2、混菌发酵

准确称取1.00wt％海藻糖、0.40wt％复合氨基酸、1.00wt％甜菜碱、0.04wt％二硫苏糖醇、1.00wt％NaHCO

纯化与检测

采用5000rpm离心10min除去发酵残渣，采用0.22μm微孔滤膜除去菌体，采用纳滤截留分子量300Da-1kDa的组分，对该组分进行HPLC检测，未检出羧甲基海藻糖。

实施例5

对上述实施例1所得样品进行如下检测：

1、HPLC分析

色谱柱为安捷伦XDB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测器为岛津LC-10A紫外检测器；检测波长为205nm；流动相为：甲醇：20mmoL磷酸二氢钾水溶液＝2：98，用磷酸调pH至2.0；流速0.5mL/min；进样量20μL；柱温30℃。

结果如图1所示，羧甲基海藻糖HPLC图谱中，出峰时间5.673min的物质峰即为羧甲基海藻糖。

2、NMR分析

取适量待测羧甲基海藻糖，置于直径5mm的核磁共振管中，用氘代水溶解，在测试温度：207K；单脉冲程序，脉冲偏转角为30°条件下进行测定，通过调整仪器参数、调谐、控温、匀场、采样，得到核磁共振碳谱谱图和氢谱。

结果如图2所示，通过微生物转化制备的羧甲基海藻糖纯度≥98％，C-6位化学位移至69.8ppm，C-7、C-8(对应于羧甲基基团中的C＝O)的化学位移分别为72.9ppm和175.4ppm，符合羧甲基取代修饰底物分子海藻糖的6’-OH结构单元分子设计预期。

3、抗衰老活性分析

在小鼠背部剃毛区域每天定量分别涂抹0.5％海藻糖、0.5％羧甲基、1％羧甲基海藻糖、2％羧甲基海藻糖，在Day42处死小鼠取划定的皮肤区域，放置于4％多聚甲醛中进行脱水固定，固定后分切，进行石蜡包埋，切片后脱蜡至水后进行皮肤组织中基质金属蛋白酶MMP-1活性检测。

结果如图3所示，通过微生物转化制备的羧甲基海藻糖表现出优异的抗衰活性。皮肤老化的分子机制在于细胞外基质(ECM)和胶原蛋白的变化，基质金属蛋白酶(MMPs)参与细胞外物质降解，在ECM的降解和重塑中起重要作用。小鼠MMP-1免疫组化染色实验结果判定蓝色为细胞核，棕黄色或棕褐色为目标蛋白，致衰小鼠经0.5％海藻糖治疗30天后MMP-1表达量无明显变化，0.5％-2％羧甲基海藻糖治疗组MMP-1阳性表达量得到明显抑制。

申请人声明，在上述说明书的描述过程中：

术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。

最后应说明的是：

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；

尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。