发酵法合成苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的方法

技术领域

本发明属于生物医药化工技术领域，具体地说，涉及一种发酵法合成苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的方法。

背景技术

苯氧乙酰胺基青霉素钾是临床上常用的抗生素药物，是治疗革兰阳性菌及部分阴性菌感染的首选药物，临床上已广泛应用于治疗脓肿、化脓性脑膜炎、肺炎、淋病等症。因其对酸稳定，不易被胃酸破坏，口服吸收好，其口服制剂尤其适合儿童使用。目前苯氧乙酰胺基青霉素钾主要采用微生物发酵法生产和两步结晶法生产。

微生物发酵法是指发酵液经酸化提取、脱色过滤、碳酸盐溶液抽提、共沸结晶、洗涤、干燥等步骤得到苯氧乙酰胺基青霉素钾，该工艺不仅生产周期长达半月之久，而且产品中可能会含有其合成前体、工艺副产物以及各种降解产物；另外，苯氧乙酰胺基青霉素钾也可能自身聚合，产生高分子聚合物。这主要是由于微生物发酵法原料成分复杂、微生物代谢产物、代谢途径复杂及生产过程越长，杂质产生机率越大。

两步结晶法是指6-APA与苯氧乙酸衍生物在固定化青霉素酰化酶的催化下合成中间体结晶酸，结晶酸再盐化为钾盐溶液，再经共沸蒸馏得成品钾盐，该工艺需经一步反应、两步结晶才能获得成品，工艺流程复杂、生产工序长，增加降解产物及聚合物等杂质产生的可能性。此外，作为固定化酶的一部分，载体材料的结构和性能会导致酶在固定化过程酶活损失大、酶负载率低、酶活力低，且固定化酶的载体与酶亲和性不高、机械稳定性差，导致催化反应或者循环催化反应过程酶易从载体脱落，影响产品质量及酶的循环利用次数；其次由于酶固定化过程条件苛刻，导致酶活下降较为严重，且有机溶剂的使用不利于酶活；同时固定化酶生产工艺复杂、生产成本高。

采用发酵催化剂催化合成及一步结晶法制备苯氧乙酰胺基青霉素钾盐，具有生产周期短、工艺简单、反应条件温和、转化率高、副产物少、聚合物等杂质含量少、产品质量高等优点。但是，国内生产的苯氧乙酰胺基青霉素钾原料药产品质量同国外的原料药质量相比还存在相当大的距离。因此，如何生产达到甚至超过国外原料药质量水平，得到杂质含量低尤其是聚合物杂质含量低的苯氧乙酰胺基青霉素钾，对于保障用药安全性和有效性具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵法制备苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种发酵法合成苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的方法，包括以下步骤：

①发酵催化剂的发酵制备；

②发酵催化剂的分离；

③发酵催化剂的纯化；

④在发酵催化剂的催化作用下，控制温度20-28℃，用10-30％碳酸钾溶液控制pH6.5-8.0，使6-APA和苯氧乙酸衍生物反应生成产物苯氧乙酰胺基青霉素钾盐；

⑤产物分离及发酵催化剂的回用；

⑥共沸结晶，得到终产物苯氧乙酰胺基青霉素钾盐。

本发明中，所述发酵催化剂为青霉素酰化酶。

进一步地，步骤①包括：将具有发酵催化剂生产能力的菌种在pH自然、33-36℃的条件下，依次经一级种子培养基和二级种子培养基培养，得到二级种子液；将二级种子液接种至发酵培养基，在pH6.5-6.8、33-35℃的条件下培养20-30h，得到发酵液；发酵液的菌含量为1.0×10

其中，所述种子培养基的成分包括：蛋白胨、酵母粉和氯化钠等；所述发酵培养基的成分包括：蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠等。

优选地，二级种子液的接种量为3-6v/v％。

进一步地，步骤②包括：发酵液于5-10℃、8000-12000g离心，收集菌体，菌体经高压均质机破碎释放出发酵催化剂；向得到的均质液中加入絮凝剂使细胞碎片絮凝，离心，收集上清液。

其中，高压均质机的运行压力为800-1000bar，均质2-4次。

所述絮凝剂可选自苯扎氯铵、苯扎溴铵、聚氧化乙烯、聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯酰胺衍生物、聚乙烯亚胺等中的至少一种。

进一步地，步骤③包括：上清液经超滤浓缩，去除小分子化合物、多肽和氨基酸；向得到的浓缩液中加入硫酸铵沉淀发酵催化剂，去除杂蛋白；然后用磷酸盐缓冲液溶解发酵催化剂，经超滤透析去除硫酸铵和小分子化合物；得到发酵催化剂浓缩液，过阴离子交换树脂柱层析，得到纯化的发酵催化剂。

酶的纯化方法具体如下：将上清液于5-10℃条件下用分子量10000-50000MW的超滤膜超滤浓缩至浓缩液发酵催化剂浓度为60-100mg/mL时停止超滤，去除小分子化合物、多肽和氨基酸；向浓缩液中加入硫酸铵于5-10℃沉淀发酵催化剂，去除杂蛋白；发酵催化剂用pH7.8-8.2、0.02-0.025M的磷酸盐缓冲液于5-10℃溶解，溶解液于5-10℃条件下用分子量10000-50000MW的超滤膜超滤透析至发酵催化剂溶液电导率≤4MS，再进一步浓缩至发酵催化剂浓度80-100mg/mL，去除硫酸铵和小分子化合物；将发酵催化剂浓缩液于5-10℃、速率0.5BV/h过阴离子交换树脂柱层析，最后用2BV(2个柱体积)、0.02-0.025M pH7.8-8.0的磷酸盐缓冲液顶洗，得到纯化的发酵催化剂。

进一步地，步骤④包括：在20-28℃条件下，6-APA和苯氧乙酸衍生物在发酵催化剂的作用下，使用10-30％碳酸钾溶液控制pH6.5-8.0反应1-1.5h，所得反应液中含有苯氧乙酰胺基青霉素钾盐。

其中，6-APA和苯氧乙酸衍生物的摩尔比为1:(1-1.3)。

以6-APA计，发酵催化剂总活力为120-200U/g。

所述苯氧乙酸衍生物可选自苯氧乙酸甲酯、苯氧乙酸乙酯、苯氧乙酸甘油酯、苯氧乙酸醇酯等中的至少一种。

本发明中，发酵催化剂以液体的形式加入。

进一步地，步骤⑤包括：反应液于5-10℃条件下用分子量10000-50000MW的超滤膜超滤浓缩回收发酵催化剂，发酵催化剂浓缩液再用于苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的合成；透析液于10-25℃条件下用分子量200-300MW的纳滤膜纳滤浓缩，得到苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液。

进一步地，步骤⑥包括：向苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液中添加带水剂，减压蒸馏浓缩至晶体析出。

所述带水剂可选自正丁醇、异丁醇、苯、甲苯等中的至少一种。

优选地，本发明用于发酵生产催化剂的菌种为大肠杆菌。

本发明苯氧乙酰胺基青霉素钾盐合成路线如图1所示。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明解决了发酵法生产工艺复杂、生产周期长、生产成本高，工艺副产物、降解产物及高分子聚合物等杂质产生机率大的问题。

(二)本发明有效避免了两步结晶法生产工艺流程复杂、生产工序长，增加降解产物及聚合物等杂质产生的可能性。同时，解决了固定化酶的载体与酶亲和性不高、机械稳定性差，导致催化反应或者循环催化反应过程酶易从载体脱落，进而影响产品质量及酶的循环利用次数等问题。

(三)本发明采用发酵催化剂催化合成及一步结晶法制备苯氧乙酰胺基青霉素钾盐，同时采用超滤膜浓缩工艺回收催化剂，保证了催化剂的可重复性利用，可规模化应用；此法制备苯氧乙酰胺基青霉素钾盐工艺生产周期短、操作简单、绿色无污染、生产成本低，产品HPLC纯度≥99.80％，对羟基苯氧乙酰胺基青霉素未检出，聚合物杂质含量≤0.013％，澄清度≤0.5#，产品质量优于发酵法和两步结晶法生产的苯氧乙酰胺基青霉素钾盐，不仅具有很好的生产应用价值，而且对于保障用药安全性和有效性具有重要意义。

附图说明

图1为本发明苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的合成路线。

具体实施方式

本发明提供一种发酵法制备苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的方法，包括以下步骤：

①催化剂的发酵：大肠杆菌在pH自然、温度33-36℃条件下，经一级种子和二级种子培养基培养接种至发酵培养基，在pH6.5-6.8、温度33-35℃条件下培养20-30h，得到发酵液。

②催化剂的分离：发酵液离心、收集菌体，菌体经高压均质机破碎释放催化剂；得到的均质液加入絮凝剂使细胞碎片絮凝，离心、收集清液。

③催化剂的纯化：清液超滤浓缩、去除小分子化合物、多肽和氨基酸；浓缩液沉淀催化剂、去除杂蛋白；催化剂溶解、溶解液超滤透析去除硫酸铵和小分子化合物；浓缩液过阴离子交换树脂柱层析，得到纯化的催化剂。

④苯氧乙酰胺基青霉素钾盐合成：在20-28℃条件下，6-APA和苯氧乙酸衍生物在催化剂的作用下，使用10-30％碳酸钾溶液控制pH6.5-8.0反应1-1.5h，所得反应液中含有苯氧乙酰胺基青霉素钾盐。

⑤产物分离及催化剂回用：反应液超滤浓缩回收催化剂，催化剂浓缩液再用于苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的合成，透析液纳滤浓缩，得苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液。

⑥共沸结晶：苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液添加带水剂，减压蒸馏浓缩至晶体析出。

优选地，步骤①所述的种子培养基成分包括蛋白胨、酵母粉、氯化钠；所述的发酵培养基成分包括蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；所述的发酵培养基接种量为3-6％。

优选地，步骤②所述的离心力为8000-12000g、离心温度5-10℃；所述的高压均质机运行压力800-1000bar、均质操作2-4次；所述的絮凝剂为苯扎氯铵、苯扎溴铵、聚氧化乙烯、聚苯乙烯磺酸盐以及聚丙烯酰胺衍生物、聚乙烯亚胺等。

优选地，步骤③所述的上清液超滤浓缩条件包括：分子量10000-50000MW、温度5-10℃；所述的催化剂沉淀剂为硫酸铵、沉淀温度5-10℃；所述的催化剂溶解溶剂为pH7.8-8.2、浓度0.02-0.025M的磷酸盐缓冲液、溶解温度5-10℃；所述的溶解液超滤透析条件包括：分子量10000-50000MW、温度5-10℃；所述的柱层析条件为：温度5-10℃、速率0.5BV/h，使用2BV、0.02-0.025M磷酸盐缓冲液顶洗。

更优选地，步骤③所述的上清液超滤浓缩至浓缩液催化剂浓度为60-100mg/mL时停止超滤；所述的溶解液超滤透析至催化剂电导率≤4MS，再进一步浓缩至催化剂浓度80-100mg/mL。

优选地，步骤④所述的苯氧乙酰胺基青霉素钾盐合成6-APA和苯氧乙酸衍生物的摩尔比为1:(1-1.3)；所述的苯氧乙酸衍生物包括但不限于苯氧乙酸甲酯、苯氧乙酸乙酯、苯氧乙酸甘油酯、苯氧乙酸醇酯；所述的催化剂以液体的形式加入，以6-APA计，发酵催化剂总活力为120-200U/g。

优选地，步骤⑤所述的超滤浓缩条件包括：分子量10000-50000MW、温度5-10℃；所述的透析液纳滤浓缩条件包括：分子量200-300MW、温度10-25℃。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中催化剂发酵使用的菌种为大肠杆菌，具体为青霉素酰化酶(E.Coli254)菌株，购自石药集团中诺药业(石家庄)有限公司。

种子培养基配方：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，消沫剂0.05％，pH自然。

发酵培养基配方：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，甘油10ml/L，磷酸二氢钾0.15％，磷酸氢二钠0.23％，消沫剂0.05％，pH自然。

阴离子交换树脂柱购自GE公司DEAE fast flow，琼脂糖凝胶材质。

实施例1发酵法制备苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的方法

1、催化剂的发酵：按照种子培养基配方将蛋白胨、酵母粉、氯化钠等用去离子水混合均匀、pH自然，121℃灭菌30min、冷却至室温、待用。按照发酵培养基配方将蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等用去离子水混合均匀、pH自然，121℃灭菌30min、冷却至室温、待用。将大肠杆菌接入种子培养基于33±0.5℃条件下进行一级、二级种子扩培，待种子罐OD值1.8-2.3之间、pH7.4-7.8时，将二级种子液按发酵培养基体积6％的接种量接入发酵培养基，在pH6.5±0.05、温度33℃条件下培养20h，得到发酵液。发酵液的菌含量约为1.0×10

2、催化剂的分离：发酵液用离心机于离心力8000g、温度5-6℃下离心、收集下层菌体，即为催化剂粗品，催化剂粗品活性46000u/L。菌体通过高压均质机在800bar的高压条件下进行4次均质操作，使菌体细胞破碎后释放催化剂。得到的均质液加入絮凝剂苯扎氯铵，调节pH7.54，控制温度10℃絮凝30min，絮凝液经离心机离心去除细胞碎片，收集清液。

3、催化剂的纯化：离心清液控制温度5-6℃，采用10000MW的超滤膜进行超滤浓缩，当催化剂浓度为60mg/mL时停止超滤。浓缩液加入硫酸铵至浓度为30.28％，控制温度5-6℃沉淀催化剂，过滤、收集催化剂沉淀。催化剂沉淀于5-6℃条件下用0.02M、pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解、过滤、去除不溶物。溶解液控制温度5-6℃，采用10000MW的超滤膜透析，至催化剂电导率为3.7MS，再进一步浓缩至催化剂浓度80mg/mL。浓缩液控制温度5-6℃、速率0.5BV/h过阴离子交换树脂柱层析，弃去初始流出的0.5BV的层析液，收集2BV层析液，最后用2BV、0.02M pH8.0的磷酸盐缓冲液顶洗，混合均匀得到催化剂于5℃下保存待用。

4、苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的合成：30.0Kg 6-APA用200L纯化水悬浮，滴加10％碳酸钾溶液使6-APA充分溶解，然后加入23.05Kg苯氧乙酸甲酯搅拌混合均匀，再加入催化剂使体系催化剂总活力为120U/g 6-APA，过程用10％碳酸钾溶液控制pH6.5、温度25℃，反应1h取样检测6-APA残留为0.45g/L，合成反应结束，所得反应液中含有苯氧乙酰胺基青霉素钾盐。

5、产物分离及催化剂回用：反应液控制温度5-6℃，采用10000MW的超滤膜进行超滤浓缩，至透析液中催化剂浓度为0.001mg/mL，超滤结束，收集催化剂浓缩液于5℃下保存待用；透析液控制温度10℃，采用200MW纳滤膜浓缩2倍，收集苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液。

6、共沸结晶：苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液用正丁醇稀释减压蒸馏共沸结晶至有晶体析出，同时结晶过程补加正丁醇至结晶液水分0.58％，晶体过滤、洗涤、干燥得到苯氧乙酰胺基青霉素钾48.29Kg，摩尔收率89.62％。苯氧乙酰胺基青霉素钾HPLC纯度99.87％，对羟基苯氧乙酰胺基青霉素未检出，聚合物杂质0.011％，澄清度0.5#。

实施例2发酵法制备苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的方法

1、催化剂的发酵：按照种子培养基配方将蛋白胨、酵母粉、氯化钠等用去离子水混合均匀、pH自然，121℃灭菌30min、冷却至室温、待用。按照发酵培养基配方将蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等用去离子水混合均匀、pH自然，121℃灭菌30min、冷却至室温、待用。将大肠杆菌接入种子培养基于35±0.5℃条件下进行一级、二级种子扩培，待种子罐OD值1.8-2.3之间、pH7.4-7.8时，将二级种子液按发酵培养基体积4％的接种量接入发酵培养基，在pH6.7±0.05、温度34℃条件下培养25h，得到发酵液。发酵液的菌含量约为1.0×10

2、催化剂的分离：发酵液用离心机于离心力10000g、温度7-8℃下离心、收集下层菌体，即为催化剂粗品，催化剂粗品活性43500u/L。菌体通过高压均质机在900bar的高压条件下进行3次均质操作，使菌体细胞破碎后释放催化剂。得到的均质液加入絮凝剂聚氧化乙烯，调节pH7.72，控制温度10℃絮凝30min，絮凝液经离心机离心去除细胞碎片，收集清液。

3、催化剂的纯化：离心清液控制温度7-8℃，采用30000MW的超滤膜进行超滤浓缩，当催化剂浓度为80mg/mL时停止超滤。浓缩液加入硫酸铵至浓度为29.97％，控制温度7-8℃沉淀催化剂，过滤、收集催化剂沉淀。催化剂沉淀于7-8℃条件下用0.02M、pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解、过滤、去除不溶物。溶解液控制温度7-8℃，采用30000MW的超滤膜透析，至催化剂电导率为2.8MS，再进一步浓缩至催化剂浓度90mg/mL。浓缩液控制温度7-8℃、速率0.5BV/h过阴离子交换树脂柱层析，弃去初始流出的0.5BV的层析液，收集2BV层析液，最后用2BV、0.02M pH8.0的磷酸盐缓冲液顶洗，混合均匀得到催化剂于8℃下保存待用。

4、苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的合成：30.0Kg 6-APA用200L纯化水悬浮，滴加20％碳酸钾溶液使6-APA充分溶解，然后加入27.50Kg苯氧乙酸乙酯搅拌混合均匀，再加入催化剂使体系催化剂总活力为150U/g 6-APA，过程用20％碳酸钾溶液控制pH7.0、温度26℃，反应1.5h取样检测6-APA残留为0.31g/L，合成反应结束，所得反应液中含有苯氧乙酰胺基青霉素钾盐。

5、产物分离及催化剂回用：反应液控制温度7-8℃，采用30000MW的超滤膜进行超滤浓缩，至透析液中催化剂浓度为0.0008mg/mL，超滤结束，收集催化剂浓缩液于7℃下保存待用；透析液控制温度18℃，采用250MW纳滤膜浓缩3倍，收集苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液。

6、共沸结晶：苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液用正丁醇稀释减压蒸馏共沸结晶至有晶体析出，同时结晶过程补加正丁醇至结晶液水分0.46％，晶体过滤、洗涤、干燥得到苯氧乙酰胺基青霉素钾48.53Kg，摩尔收率90.06％。苯氧乙酰胺基青霉素钾HPLC纯度99.92％，对羟基苯氧乙酰胺基青霉素未检出，聚合物杂质0.009％，澄清度<0.5#。

实施例3发酵法制备苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的方法

1、催化剂的发酵：按照种子培养基配方将蛋白胨、酵母粉、氯化钠等用去离子水混合均匀、pH自然，121℃灭菌30min、冷却至室温、待用。按照发酵培养基配方将蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等用去离子水混合均匀、pH自然，121℃灭菌30min、冷却至室温、待用。将大肠杆菌接入种子培养基于36±0.5℃条件下进行一级、二级种子扩培，待种子罐OD值1.8-2.3之间、pH7.4-7.8时，将二级种子液按发酵培养基体积3％的接种量接入发酵培养基，在pH6.8±0.05、温度35℃条件下培养30h，得到发酵液。发酵液的菌含量约为1.0×10

2、催化剂的分离：发酵液用离心机于离心力12000g、温度9-10℃下离心、收集下层菌体，即为催化剂粗品，催化剂粗品活性47800u/L。菌体通过高压均质机在1000bar的高压条件下进行2次均质操作，使菌体细胞破碎后释放催化剂。得到的均质液加入絮凝剂聚丙烯酰胺，调节pH7.95，控制温度10℃絮凝30min，絮凝液经离心机离心去除细胞碎片，收集清液。

3、催化剂的纯化：离心清液控制温度9-10℃，采用50000MW的超滤膜进行超滤浓缩，当催化剂浓度为100mg/mL时停止超滤。浓缩液加入硫酸铵至浓度为31.08％，控制温度9-10℃沉淀催化剂，过滤、收集催化剂沉淀。催化剂沉淀于9-10℃条件下用0.02M、pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解、过滤、去除不溶物。溶解液控制温度9-10℃，采用50000MW的超滤膜透析，至催化剂电导率为1.4MS，再进一步浓缩至催化剂浓度100mg/mL。浓缩液控制温度9-10℃、速率0.5BV/h过阴离子交换树脂柱层析，弃去初始流出的0.5BV的层析液，收集2BV层析液，最后用2BV、0.02M pH8.0的磷酸盐缓冲液顶洗，混合均匀得到催化剂于10℃下保存待用。

4、苯氧乙酰胺基青霉素钾盐的合成：30.0Kg 6-APA用200L纯化水悬浮，滴加30％碳酸钾溶液使6-APA充分溶解，然后加入37.62Kg苯氧乙酸甘油酯搅拌混合均匀，再加入催化剂使体系催化剂总活力为200U/g 6-APA，过程用30％碳酸钾溶液控制pH8.0、温度28℃，反应1.5h取样检测6-APA残留为0.16g/L，合成反应结束，所得反应液中含有苯氧乙酰胺基青霉素钾盐。

5、产物分离及催化剂回用：反应液控制温度9-10℃，采用50000MW的超滤膜进行超滤浓缩，至透析液中催化剂浓度为0.0013mg/mL，超滤结束，收集催化剂浓缩液于9℃下保存待用；透析液控制温度25℃，采用300MW纳滤膜浓缩4倍，收集苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液。

6、共沸结晶：苯氧乙酰胺基青霉素钾盐浓缩液用正丁醇稀释减压蒸馏共沸结晶至有晶体析出，同时结晶过程补加正丁醇至结晶液水分0.64％，晶体过滤、洗涤、干燥得到苯氧乙酰胺基青霉素钾49.39Kg，摩尔收率91.66％。苯氧乙酰胺基青霉素钾HPLC纯度99.80％，对羟基苯氧乙酰胺基青霉素未检出，聚合物杂质0.013％，澄清度0.5#。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。