一种脂质体注射液的磷脂测定方法

技术领域

本发明涉及药物关键物料的检测方法，具体涉及一种脂质体中同时检测MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种磷脂测定的方法。

背景技术

脂质体的主要成分包括：

1、磷脂类:包括天然磷脂和合成磷脂二类。磷脂的结构特点为一个磷酸基和一个季铵盐基组成的亲水性基团，以及由两个较长的烃基组成的亲脂性基团。天然磷脂以卵磷脂(磷脂酰胆碱，PC)为主，来源于蛋黄和大豆，显中性。合成磷脂主要有DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、DPPE(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)等，其均属氢化磷脂类，具有性质稳定，抗氧化性强，成品稳定等特点，是国外首选的辅料。

2、胆固醇:胆固醇与磷脂是共同构成细胞膜和脂质体的基础物质。胆固醇具有调节膜流动性的作用，故可称为脂质体"流动性缓冲剂"。

当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。

脂质体可用于转基因，或制备药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。药剂学上脂质体系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。目前上市的脂质体药物品种有盐酸多柔比星、两性霉素B、紫杉醇，布比卡因，伊立替康等。已经上市的药物盐酸伊立替康脂质体注射液是包封在脂质双层囊泡或脂质体中的拓扑异构酶1抑制剂，适用于转移性胰腺癌，和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)/甲酰四氢叶酸(Leucovorin)共同用于治疗曾接受过吉西他滨(Gemcitabine)化疗后期晚期(转移性)胰脏癌病患。MPEG2000-DSPE，中文通用名：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；中文化学名称：N-(羰基－甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，钠盐；CAS号：147867-65-0。

胆固醇，中文别名:(3β)-胆甾-5-烯-3-醇；胆甾-5-烯-3β-醇；胆脂醇；异辛甾烯醇；胆甾醇；胆甾烷醇；胆固烯醇，CAS号:57-88-5。

DSPC,也称磷脂酰胆碱,是一种全合成磷脂，CAS号816-94-4。在脂质体药物的制备过程中，以上三种成分常被用到。

现有文献资料中，脂质体药物中的磷脂的测定方法主要有以下几种：高效液相色谱法、钼蓝比色法、钒钼酸盐紫外分光光度法、荧光法、硫氰铁铵显色法。现有方法存在所用试剂种类多、操作步骤复杂等缺点。且目前同时检测一种脂质体中的MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种成分的方法未见报道。

发明内容

本发明采用高效液相色谱法同时测定一种脂质体的3种成分，具有操作方便、检测效率高等优点。

本发明提供一种脂质体注射液的磷脂测定方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

1)供试品溶液的配制，包括供试品溶液A的配制，供试品溶液B的配制；

2)对照品溶液的配制：包括MPEG2000-DSPE对照品贮备液的配制；混合对照品贮备液的配制；

3)检测：

将供试品溶液A，供试品溶液B，对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种成分的含量。

其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：

仪器：液相色谱仪，ELSD

色谱柱：Thermo Hypersil BDS C8(4.6mm×250mm，5μm)

流动相A：0.05mol/L乙酸铵溶液；

流动相B：甲醇；

柱温：40℃；流速：1.0ml/min；

进样量：50μl；运行时间：22min。

稀释剂：流动相。

梯度表：

其中，所述供试品为含有MPEG2000-DSPE、DSPC和胆固醇的脂质体注射液。所述供试品为伊立替康脂质体注射液，其中含有MPEG2000-DSPE、DSPC和胆固醇。根据需要所述供试品也可以是其他脂质体注射液，如盐酸多柔比星脂质体注射液、两性霉素B脂质体注射液、紫杉醇脂质体注射液，布比卡因脂质体注射液等。

其中所述供试品溶液的配制，方法如下：

供试品溶液A：精密量取供试品1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为测试MPEG2000-DSPE用溶液；

供试品溶液B：精密量取供试品1ml，置200ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为测试DSPC和胆固醇用溶液。

其中所述对照品溶液的配制，方法如下：

MPEG2000-DSPE对照品贮备液：取MPEG2000-DSPE对照品30mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为MPEG2000-DSPE对照品贮备液；

混合对照品贮备液：取胆固醇对照品15mg和DSPC对照品35mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，加稀释剂适量，超声约2分钟使溶解，放至室温；精密量取MPEG2000-DSPE对照品贮备液5ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。

其中所述3)检测，方法如下：

将供试品溶液A，供试品溶液B，对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种成分的含量；

其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：

仪器：液相色谱仪，ELSD

色谱柱：Thermo Hypersil BDS C8(4.6mm×250mm，5μm)

流动相A：0.05mol/L乙酸铵溶液

流动相B：甲醇；

柱温：40℃；流速：1.0ml/min；

进样量：50μl；运行时间：22min；

稀释剂：流动相；

梯度表：

其中，用回归方程计算供试品中相应各组分的含量。

其中所述0.05mol/L乙酸铵溶液的配制方法如下：称取7.85g乙酸铵溶于1000ml超纯水，混合均匀，超声即得。

最优选的，所述方法，步骤如下：

1)供试品溶液的配制：

供试品溶液A：精密量取供试品1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为测试MPEG2000-DSPE用溶液；

供试品溶液B：精密量取供试品1ml，置200ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为测试DSPC和胆固醇用溶液。

2)对照品溶液的配制：

MPEG2000-DSPE对照品贮备液：取MPEG2000-DSPE对照品30mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为MPEG2000-DSPE对照品贮备液。

混合对照品贮备液：取胆固醇对照品15mg和DSPC对照品35mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，加稀释剂适量，超声约2分钟使溶解，放至室温；精密量取MPEG2000-DSPE对照品贮备液5ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。

3)检测：

将供试品溶液A，供试品溶液B，对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种成分的含量。

其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：

仪器：液相色谱仪，ELSD

色谱柱：Thermo Hypersil BDS C8(4.6mm×250mm，5μm)

流动相A：0.05mol/L乙酸铵溶液(称取7.85g乙酸铵溶于1000ml超纯水，混合均匀，超声即得)可等比例放大或缩小；

流动相B：甲醇；

柱温：40℃；流速：1.0ml/min；

进样量：50μl；运行时间：22min。

稀释剂：流动相。

梯度表：

其中，用回归方程计算供试品中相应各组分的含量。

其中，所述供试品为含有MPEG2000-DSPE、DSPC或者胆固醇的脂质体注射液。

本发明的色谱条件(流动相、载气流速)是经过筛选得到的，筛选过程如下：

不同流动相的选择

分别考察不同流动相B对3种磷脂色谱峰的影响，实验表明，当流动相B使用乙醇时，MPEG2000-DSPE峰型差，且胆固醇与DSPC的分离度小于1.5，分离差。

不同流动相比例的选择

当流动相的梯度变为如下时，

MPEG2000-DSPE不能被有效检出，即MPEG2000-DSPE不出峰。在本发明计算MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种成分的含量过程中，需要用到标准曲线，标准曲线的绘制需要用到以下溶液的配制：MPEG2000-DSPE对照品贮备液：取MPEG2000-DSPE对照品30mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为MPEG2000-DSPE对照品贮备液。

混合对照品贮备液：取胆固醇对照品15mg和DSPC对照品35mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，加稀释剂适量，超声约2分钟使溶解，放至室温；精密量取MPEG2000-DSPE对照品贮备液5ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。

STD-A1：精密量取混合对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得线性溶液STD-A1；

STD-A2：精密量取混合对照品贮备液2ml，置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得线性溶液STD-A2；

STD-A3：精密量取混合对照品贮备液2ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得线性溶液STD-A3；

STD-A4：精密量取混合对照品贮备液3ml置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得线性溶液STD-A4；

STD-A5：精密量取混合对照品贮备液3ml置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得线性溶液STD-A5。

将上述溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种成分的含量并绘制标准曲线。

MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种成分标准曲线的数据如下：

本检测方法与现有类似方法的差异，如CN202011549984公开了一种高效液相色谱-电喷雾检测器同时检测COVID19 LPP疫苗中mPEG2000-DSPE、DOPE和M5三种磷脂的方法，但样品前处理非常复杂，需离心和超滤。而且目前同时检测复合磷脂脂质体这一总体物质中的MPEG2000-DSPE、胆固醇和DSPC三种磷脂的方法也未见报道。

本发明的优点在于：

1.本发明样品配制方法简单高效；

2.本发明检测时间短，检查效率高。

附图说明

图1对照品溶液图谱

图2供试品溶液A图谱

图3供试品溶液B图谱

具体实施方式

以下通过实施案例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

其中，所述供试品为伊立替康脂质体注射液。

1)色谱条件：

仪器：液相色谱仪，CAD

色谱柱：Thermo Hypersil BDS C8(4.6mm×250mm，5μm)

流动相A：0.05mol/L乙酸铵溶液(称取3.85g乙酸铵溶于1000ml超纯水，混合均匀，超声即得)可等比例放大或缩小；

流动相B：甲醇；

柱温：40℃；流速：1.0ml/min；

进样量：50μl；运行时间：22min。

稀释剂：流动相。

梯度表：

2)溶液配制：

MPEG2000-DSPE对照品贮备液：取MPEG2000-DSPE对照品30mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为MPEG2000-DSPE对照品贮备液。

混合对照品贮备液：取胆固醇对照品15mg和DSPC对照品35mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，加稀释剂适量，超声约2分钟使溶解，放至室温；精密量取MPEG2000-DSPE对照品贮备液5ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。

供试品溶液A：精密量取供试品1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为测试MPEG2000-DSPE用溶液；

供试品溶液B：精密量取供试品1ml，置200ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为测试DSPC和胆固醇用溶液。

3)检测结果：

实施例2

其中，所述供试品为伊立替康脂质体注射液。

1)色谱条件：

仪器：液相色谱仪，CAD

色谱柱：Thermo Hypersil BDS C8(4.6mm×250mm，5μm)

流动相A：0.08mol/L乙酸铵溶液(称取6.16g乙酸铵溶于1000ml超纯水，混合均匀，超声即得)可等比例放大或缩小；

流动相B：甲醇；

柱温：40℃；流速：1.0ml/min；

进样量：50μl；运行时间：22min。

稀释剂：流动相。

梯度表：

2)溶液配制：

MPEG2000-DSPE对照品贮备液：取MPEG2000-DSPE对照品30mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为MPEG2000-DSPE对照品贮备液。

混合对照品贮备液：取胆固醇对照品15mg和DSPC对照品35mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，加稀释剂适量，超声约2分钟使溶解，放至室温；精密量取MPEG2000-DSPE对照品贮备液5ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。

供试品溶液A：精密量取供试品1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为测试MPEG2000-DSPE用溶液；

供试品溶液B：精密量取供试品1ml，置200ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为测试DSPC和胆固醇用溶液。

3)检测结果：