一种小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4及其建立方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物动物细胞系技术领域，具体地，涉及一种小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4及其建立方法和应用。

背景技术

肝内胆管癌是发病率仅次于肝细胞肝癌的肝脏原发恶性肿瘤，近年来发病率呈上升趋势。目前，缺乏免疫健全的肝内胆管癌小鼠模型是限制胆管癌免疫治疗研究的重要原因之一。

人源化免疫重建小鼠模型只能部分模拟免疫系统，且该模型成本高、异质性大、治疗窗口短，难以满足目前免疫治疗研究的需要。而鼠源肝内胆管癌模型可以真实模拟小鼠免疫细胞与肿瘤的交互，对于免疫治疗的研究具有显著优势。国外研究通过转基因鼠、尾静脉水动力等方法分选构建出了小鼠肝内胆管癌的原位模型，Holger Willenbring(J ClinInvest.2012；122(8):2911-2915)报道通过尾静脉水动力注射NICD/AKT质粒构建小鼠肝内胆管癌，Gregory J.Gores(Oncotarget.2018；9:5892-5905)报道通过尾静脉水动力注射YAP/AKT质粒构建小鼠肝内胆管癌并分离出SB 1-7小鼠肝内胆管癌细胞系。

中国发明专利申请(CN202210824732.7)公开了一种小鼠肝内胆管癌细胞系mIC-22及其应用，该专利中通过尾静脉水动力注射NICD/AKT质粒构建小鼠肝内胆管癌并分离出了mIC-22细胞系，为肝内胆管癌研究提供了研究模型，但依然存在以下缺点：(1)使用了人源基因AKT来诱导成瘤，非同源基因的导入可能会导致使用该模型进行研究时产生一些偏倚，特别是在评价免疫治疗时，人源基因会改变肿瘤细胞的免疫原性，使疗效评价存在偏差；(2)直接从原发瘤中提取细胞系，细胞成分复杂且建系成功率低，只分离出了一个细胞系；(3)只构建了皮下瘤模型，没有构建肝脏原位瘤模型，在疗效评价时难以还原肝脏免疫微环境；(4)没有检测该细胞系基因组信息，无法反映与人类胆管癌的相似性。

因此，需要构建一种稳定的、使用鼠源基因诱导并分离提取的肝内胆管癌细胞系以解决上述问题。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4。

本发明第一方面提供了一种小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4，所述小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4(Murine intrahepatic cholangiocarcinoma cell line mICCN-4)于2023年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023122，保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明第二方面提供了上述小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4的建立方法，包括以下步骤：

S1、将鼠源NICD质粒、鼠源Akt质粒及SB质粒溶于PBS中，通过尾静脉水动力注射法对小鼠进行注射；

S2、5～6周后，分离出肿瘤组织，将分离后的肿瘤组织剪碎，放入含有10％FBS的DMEM培养基中，然后再植入小鼠皮下；

S3、待肿瘤长至1x1cm，分离出肿瘤组织，清洗，剪碎，离心，去上清，重悬，在摇床37℃、110rpm条件下消化1小时，过筛，离心，得到肿瘤细胞；

S4、使用含有40ng/ml mEGF、100nM Y27632、10％FBS、1％青霉素-链霉素-两性霉素的DMEM培养基重悬肿瘤细胞，每两天更换一次培养基，待细胞长至80％融合度时进行传代，肿瘤细胞传代稳定后，培养基更换为10％FBS+双抗DMEM培养基。

在一实施方式中，步骤S1中，鼠源NICD质粒、鼠源Akt质粒及SB质粒的质量比为20:4:2；

通过尾静脉水动力注射法对C57/BL小鼠进行注射。

在一实施方式中，步骤S2中，6周后，分离出肿瘤组织，将分离后的肿瘤组织2x2mm碎块，放入4℃预冷的含有10％FBS的DMEM培养基中，然后植入C57小鼠皮下。

在一实施方式中，步骤S3中，待肿瘤长至1x1cm，分离出肿瘤组织，使用含5％青霉素-链霉素-两性霉素的PBS冲洗肿瘤3遍，剪碎，用PBS将碎块移至离心管中，400g/5min条件下离心，去上清，加入3ml含有2mg/ml胶原酶I和胶原酶IV的DMEM重悬，在摇床37℃、110rpm条件下消化1小时，过70μm筛网，400g/5min离心，得到肿瘤细胞。

在一实施方式中，步骤S4中，使用含有40ng/ml mEGF、100nM Y27632、10％FBS、1％青霉素-链霉素-两性霉素的DMEM培养基重悬肿瘤细胞，并在37℃5％CO2条件下培养，每两天更换一次培养基，待细胞长至80％融合度时进行传代，肿瘤细胞传代稳定后，培养基更换为10％FBS+双抗DMEM培养基。

本发明第三方面提供了上述小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4的应用，所述应用选自下列任一种：

(1)、在体外进行CRISPR、慢病毒感染等基因编辑，探究对肝内胆管癌表型的影响；

(2)、在体外进行肝内胆管癌药物敏感性评价；

(3)、在体内构建皮下及肝脏原位瘤；

(4)、在体内评价ICC免疫治疗疗效；

(5)、在体内探究ICC进展和转移机制。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明提供的小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4在建立时，在建立时使用了鼠源的Akt和Notch1胞内段(NICD)质粒来诱导小鼠肝内胆管癌成瘤，完全使用了鼠源基因，在评价药物疗效及肿瘤发生、转移机制时更具有优势，且鼠源基因不易引起排斥反应，使其更容易在体内成瘤，且相比于现有ICC(肝内胆管癌)小鼠细胞系更具有肝内胆管癌的特征。

2、本发明提供的小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4在建立时，首先将诱导的肝内胆管癌组织在免疫健全鼠皮下移植，待肿瘤长至1x1cm时，分离肿瘤组织并提取肿瘤细胞，这种方法能提高肝内胆管癌细胞的纯度并提高肝内胆管癌细胞建系成功率。

3、本发明提供的小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4在建立时，在含有10％FBS的DMEM培养基中加入40ng/ml mEGF和100nM Y27632，培养十代后更换为普通培养基，极大提高了建系成功率，并提取出了3个细胞系，肿瘤细胞在培养三十至四十代后，仍有较强的增殖能力和成瘤能力。

4、本发明提供的小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4原位移植瘤经过单细胞RNA测序及全外显子(WES)测序，结果显示该细胞系基因拷贝数变异(CNV)与其他正常细胞有显著差异，且有较高的胆管癌标志物Ck19、Ck8、Sox9、Spp1、Muc1表达，而肝细胞标志物Alb、Cps1不表达；且该细胞系肿瘤突变负荷(TMB)与人类ICC相当，一些基因的突变也常在人类ICC中发生，其中Trp53的突变更是人类ICC中常见的突变基因之一；因此其相比于现有报道的ICC小鼠细胞系更具有肝内胆管癌的特征。

5、本发明提供的小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN可在体外通过CRISPR、慢病毒感染等技术进行基因编辑，并可方便地在皮下及肝脏原位成瘤，用于药物评价、肿瘤进展及转移的研究。

附图说明

图1为小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4建立过程中肿瘤传至30-40代时的细胞形态图；

图2为CCK8细胞增殖实验结果图；

图3为克隆形成实验结果图；

图4为Transwell细胞迁移和侵袭实验图；

图5为CRISPR基因敲除WB检测图；

图6为慢病毒基因敲减和过表达WB检测图；

图7为肝脏原位瘤形成图；

图8为肝脏原位瘤HE染色和CK19免疫组化染色图；

图9为单细胞测序细胞聚类图；

图10为单细胞测序基因拷贝数变异图；

图11为单细胞测序基因表达图。

具体实施方式

现有肝内胆管癌细胞系主要存在以下问题：(1)使用了人源基因AKT来诱导成瘤，非同源基因的导入可能会导致使用该模型进行研究时产生一些偏倚，特别是在评价免疫治疗时，人源基因会改变肿瘤细胞的免疫原性，使疗效评价存在偏差；(2)直接从原发瘤中提取细胞系，细胞成分复杂且建系成功率低，只分离出了一个细胞系；(3)只构建了皮下瘤模型，没有构建肝脏原位瘤模型，在疗效评价时难以还原肝脏免疫微环境；(4)没有检测该细胞系基因组信息，无法反映与人类胆管癌的相似性。

因此，需要构建一种能稳定的、使用鼠源基因诱导并分离提取肝内胆管癌细胞系的以解决上述问题。

具体地，本发明中使用鼠源基因Akt诱导成瘤，排除了人源基因对肿瘤生物学功能和免疫原性的影响；首先将肿瘤组织在皮下移植，待成瘤后再从皮下瘤提取细胞系，既能提高建系成功率又能增加肿瘤纯度；构建了原位瘤模型，并通过单细胞测序检测其细胞成分，确认了细胞系的胆管癌特征及其中的免疫细胞浸润，说明其用于免疫治疗评价的可行性；同时检测了该细胞系的基因组信息，确认了该细胞系和人类胆管癌的相似性。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种小鼠肝内胆管癌细胞系mICCN-4的建立方法，包括以下步骤：

1、将20ug鼠源NICD质粒、4ug鼠源Akt质粒及2ugSB质粒溶于2ml PBS中，在5s内通过尾静脉水动力注射入C57/BL小鼠体内；

2、待6周以后，解剖查看小鼠胆管癌成瘤情况，取出肿瘤组织，剪成大小约2x2mm碎块，放入4度预冷的含有10％FBS的DMEM培养基中，将肿瘤组织植入C57小鼠皮下；

3、待2周左右，肿瘤长至1x1cm大小时，人道处死小鼠，并使用75％酒精浸泡30秒，解剖小鼠肿瘤并转移到超净台进行操作，使用含5％青霉素-链霉素-两性霉素的PBS冲洗肿瘤3遍，切去肿瘤周围脂肪及坏死组织，仅保留活性的肿瘤成分；

4、将肿瘤组织放入EP管中，使用剪刀剪碎，用5mlPBS将碎块转移至50ml离心管，400g/5min离心，吸去上清，加入3ml含有2mg/ml胶原酶I和胶原酶IV的DMEM重悬，在摇床37℃110rpm条件下消化1小时；

5、碾压通过70μm筛网，400g/5min离心，使用含有40ng/ml mEGF、100nM Y27632、10％FBS、1％青霉素-链霉素-两性霉素的DMEM培养基重悬细胞，并在37℃5％CO

6、每两天更换一次培养基，待细胞长至80％融合度时进行传代，待肿瘤传代稳定后更换为10％FBS+双抗DMEM培养基进行培养，肿瘤传至30-40代时依旧保持较强的增殖能力，其细胞形态如图1所示。共获得了三株来源于不同小鼠的ICC细胞系，分别命名为mICCN-3，mICCN-4和mICCN-5，其中mICCN-4(Murine intrahepatic cholangiocarcinoma cellline mICCN-4)于2023年5月30日保藏与中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2023122，保藏地址为中国武汉武汉大学。

在体外对上述所得细胞系mICCN-3、mICCN-4、mICCN-5进行CCK8增殖实验、克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验，并与人胆管癌细胞系RBE及正常胆管上皮细胞系HiBEpiC对比。

具体地，CCK8细胞增殖实验包括以下步骤：取对数生长期的细胞，消化、离心并重悬于完全培养基中，将细胞数量调整为1000个/100ul并加入96孔板中，分别于1-7天，弃孔板液体，加入CCK8工作液，37℃孵育1小时，通过酶标仪检测其OD450。CCK8细胞增殖实验结果如图2所示；

具体地，克隆形成实验包括以下步骤：取对数生长期的细胞，消化、离心并重悬于完全培养基中，将细胞数调整为1000个/孔铺于6孔板中，待10-14天后，使用4％多聚甲醛固定15分钟，并用0.1％结晶紫染色15分钟，大量清水清洗，晾干拍照。克隆形成实验结果如图3所示；

具体地，Transwell细胞迁移和侵袭实验包括以下步骤：取对数生长期的细胞，消化、离心并重悬于无血清培养基中，并将细胞浓度调整为5*10

由CCK8增殖实验、克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验结果显示，mICCN-4有较强的增殖和侵袭能力，显著强于HIBEpiC并与RBE相当，可作为研究肿瘤增殖的良好模型。

进一步对mICCN-4进行慢病毒感染基因敲减、过表达以及CRISPR基因敲除。

具体地，CRSPR基因敲除Mlh1具体包括以下步骤：将靶向Mlh1基因的sgRNA序列TCACCGTGATCAGGGTGCCC克隆到基因组编辑质粒系统(lentiCRISPR-v2，Addgene：52961)，并与慢病毒载体、包装质粒(pCMV-VSV-G，psPAX2)共转染HEK293T细胞来制备慢病毒颗粒。将转染后的HEK293T上清经0.22μm滤器过滤后感染mICCN-4细胞系，使用嘌呤霉素筛选成功感染的细胞，再挑选若干个单克隆进行扩增，再通过WB检测Mlh1敲除情况，结果显示在四个单克隆有三个成功敲除了Mlh1。结果如图5所示。

具体地，慢病毒感染敲减或过表达Irf5基因具体包括以下步骤：分别构建鼠源Irf5的shRNA质粒和过表达质粒，并与慢病毒载体、包装质粒(pCMV-VSV-G，psPAX2)共转染HEK293T细胞来制备慢病毒颗粒。将转染后的HEK293T上清经0.22μm滤器过滤后感染mICCN-4细胞系，使用嘌呤霉素筛选成功感染的细胞，以获得稳转株，并通过WB进行验证。结果如图6所示。

以上mICCN-4进行慢病毒感染基因敲减、过表达以及CRISPR基因敲除，结果显示常规的基因编辑技术均能在此细胞系中成功进行，证实该细胞系可作为基因敲减及过表达的良好细胞模型。此外，常用于治疗胆管癌的化疗药吉西他滨能够有效地抑制和杀伤本细胞系，证实其可作为药物敏感性评价及耐药机制研究的良好模型。

使用胰酶消化对数生长期的肿瘤细胞，悬浮于PBS中，通过细胞计数使其浓度为1x10

对肝脏原位瘤进行HE染色和CK19免疫组化染色可以验证其具有肝内胆管癌特征，如图8所示。

对原位瘤进行单细胞RNA测序，结果显示该细胞系为单纯的ICC而没有HCC的混杂成分，同时检测到了肿瘤中浸润的中性粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞，如图9所示。拷贝数变异(CNV)分析显示，ICC与中其他正常细胞成分在基因组层面有显著差异，如图10所示。进一步整合公共数据库中正常小鼠肝脏的单细胞测序数据分析显示，ICC与正常肝细胞明显分为两群，且高表达胆管癌细胞的Ck19，Ck8，Sox9，Spp1基因，如图11所示，不表达肝细胞的Alb、Cps1基因，证明其为肝内胆管癌。

对肿瘤进行WES测序，基因突变数据如表1所示，很多基因突变在人类肝内胆管癌中也有一定的突变频率，其中Trp53基因的突变更是人肝内胆管癌最常见的突变之一，提示mICCN-4与人类肝内胆管癌的相似性。

表1小鼠肝内胆管癌基因突变表

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。