肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用。

背景技术

肝血管肉瘤又称血管内皮细胞肉瘤或恶性血管内皮瘤，是肝脏血管源性恶性肿瘤中最常见的一种，约占同期肝脏恶性肿瘤检出率的0.69％，多发于男性，男女之比约3～5.5；1，常见于老年人，平均发病年龄52岁。肝血管肉瘤目前具体发病机制不清楚，可能与饮水中含有无机砷、单胺氧化酶抑制剂等有关。主要临床表现为腹痛、厌食、恶心、体重减轻、发热等，肝肿大,晚期黄疸、血性腹水等。肝血管肉瘤恶性程度高，病程进展快，其治疗方式主要采用放化疗，化疗敏感药物主要包括氟尿嘧啶、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星、表柔比星，肿瘤切除机会少，有报道显示未正规治疗的病人大多数于6～12个月内死亡，多死于肝功能衰竭或腹腔内出血。

目前，越来越多的人已经认识到整合不同水平的数据是诊断早期肝血管肉瘤生物标志物的重要方法。近年来，蛋白质组学作为系统生物学的重要组成部分，结合模式识别方法，可用于判断生物体的病理生理状态，因此被广泛运用于疾病研究中。液相色谱-质谱串联技术是蛋白质组学的主要研究手段，前列腺癌的诊断标志物肌氨酸的检测、新生儿疾病筛查时的多种氨基酸检测等均是代谢小分子在疾病诊断中应用的已有成功案例。因此，寻找新的可以诊断肝血管肉瘤的代谢标志物具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法，本发明采用质谱分析的方法检测小分子的含量，该方法简单，实用，且通过多种小分子的检测可以更好地提高检测方法的灵敏度与特异性。

为实现上述目的，本发明肝血管肉瘤标志物的筛选方法采取下述技术方案：

一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法，包括如下步骤：

(1)提取分子产物，将保存于-80℃下的血液样本解冻后，采用4℃下的PBS清洗，然后，加入ddH

(2)LC-MS/MS质谱分析，将上述冻干粉用体积比为1:1的乙腈和水溶液复溶后，采用超高效液相色谱系统分离，然后采用质谱仪I进行检测分析；

(3)数据处理，样本检测完毕后，采用质谱仪II鉴定分子产物，同时采集血液样品的一级质谱谱图和二级质谱谱图；

(4)统计学分析，根据OPLS-DA模型，以VIP>1为筛选标准，初步筛选出差异分子产物；然后，采用多维度统计分析方法，选择VIP>1、Fold change>2或<0.5的分子产物作为具有显著性差异的蛋白质。

优选地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱的参数设置为：柱温为25℃、流速为0.3mL/min、上样量为2μL；流动相由两相组成，其中，流动相A为含有25mM乙酸铵和25mM氨水的水溶液，流动相B为纯乙腈；样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5min，95％ B；0.5～7min，95％B～65％B；7～8min，65％B～50％B；8～9min，50％B；9～9.1min，50％B～95％B；9.1～12min，95％B；上述过程中样品均置于4℃下。

优选地，步骤(2)中，所述质谱仪I在ESI正离子模式下进行，ESI源的参数设置为：Drying gas流速，16L/min；Gas温度，250℃；Sheath gas温度，500℃；sheath Gas流速，12L/min；Nebulizer，20psig；Vcap，3000V；Nozzle电压，175V；Mass Range，50～1200Da；Acquisition rate，4HZ；每个循环的时间，50ms。

优选地，步骤(3)中，所述质谱仪II的ESI源参数设置为：Ion Source Gas1，50；IonSource Gas2，80；source temperature，650℃；Curtaingas，30；Ion Sapary VoltageFloating±5000V，正离子模式；二级质谱IDA获得，采用高灵敏度模式进行采集，Declustering potential，±60V，正离子模式；Collision Energy；35±15eV；IDA的参数设置如下：Exclude isotopes within 4道尔顿，Candidate ions to monitor per cycle：10；采集数据的模式按照如下质核比进行分段，50～300m/z，290～600m/z，590～900m/z，890～1200m/z。

优选地，步骤(3)中，经ProteoWizard将原始数据转换成.mzXML格式，然后采用lc-ms spectra annotation软件进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定。

优选地，步骤(4)中，具有显著性差异的蛋白质为RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质。

本发明目的之二在于提供一种肝血管肉瘤标志物在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用，该标志物可以为日后的肝血管肉瘤的诊断研发提供新的治疗靶点和思路。

为实现上述目的，本发明肝血管肉瘤标志物在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用采取下述技术方案：

一种肝血管肉瘤标志物在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用，所述肝血管肉瘤蛋白质标志物为RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质。

优选地，所述试剂盒中包括特异性检测RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质的试剂。

优选地，具体操作时，采用SPSS分别绘制RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质的ROC曲线，其中，RAPGEF6蛋白质的cut off值为8734.77，Mcm7蛋白质的cutoff值为90796.54，IDI1蛋白质的cut off值为10155.52，TOMM6蛋白质的cut off值为47012.01。

本发明目的之三在于提供一种肝血管肉瘤标志物作为靶标在筛选抗肝血管肉瘤药物中的应用，该标志物可以为日后的肿瘤药物的研发提供新的治疗靶点和思路。

为实现上述目的，本发明肝血管肉瘤标志物作为靶标在筛选抗肝血管肉瘤药物中的应用采取下述技术方案：

一种肝血管肉瘤标志物作为靶标在筛选抗肝血管肉瘤药物中的应用，所述肝血管肉瘤蛋白质标志物为RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质。

有益效果：

本发明采用LC-MS/MS质谱分析方法检测待测样本，通过大量的临床样本进行液相色谱串联质谱分析后，在蛋白质检测中筛选出有代表性的分子产物。通过肝血管肉瘤血液与正常对照血液相应分子产物含量的差异倍数(小于2或小于0.5)可以确定4个分子具有良好的检验效益，即RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质。上述4个蛋白分子可以作为检测肝血管肉瘤的新的标志物。本发明通过液相色谱串联质谱分析检测出的分子标志物可以为日后的肝血管肉瘤药物的研发提供新的治疗靶点和思路。

附图说明

图1为RAPGEF6蛋白质诊断肝血管肉瘤的ROC曲线；

图2为肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本中RAPGEF6蛋白质的含量分布图；

图3为肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本中RAPGEF6蛋白质含量统计图；

图4为Mcm7蛋白质诊断肝血管肉瘤的ROC曲线；

图5为肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本中Mcm7蛋白质含量分布图；

图6为肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本中Mcm7蛋白质含量统计图；

图7为IDI1蛋白质诊断肝血管肉瘤的ROC曲线；

图8为肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本中IDI1蛋白质含量分布图；

图9为肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本中IDI1蛋白质含量统计图

图10为TOMM6蛋白质诊断肝血管肉瘤的ROC曲线；

图11为肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本中TOMM6蛋白质含量分布图；

图12为肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本中TOMM6蛋白质含量统计图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

一、实验步骤

1.样品信息

质控样本(QC)的制备：样品等量混合用于制备QC样本。制备QC样本的目的为平衡液相色谱-质谱系统、检测样品进样前整个仪器的状态、评价实验的整个过程仪器及实验操作系统的稳定性。

样本：取自肝血管肉瘤患者血液的样本A和取自正常对照血液样本B分别为50个。

2.血液样本预处理方法

取出保存于-80℃冰箱的血液样本，置于冰上解冻。解冻完全后，采用4℃预冷的PBS清洗30mg血液样本2次。清洗干净后，每个血样样本中加入200μL ddH

3.色谱-质谱分析

3.1色谱条件

利用安捷伦1290Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)并联合HILIC色谱柱(Waters Acquity UPLC BEH Amide 1.7μm.2.1*100mm)进行样品分离。液相色谱系统的参数设置如下：柱温为25℃、流速为0.3mL/min、上样量为2μL。流动相由两相组成：流动相A为含有25mM乙酸铵和25mM氨水的水溶液，流动相B为纯乙腈。样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5min，95％ B；0.5～7min，95％B～65％B；7～8min，65％B～50％B；8～9min，50％B；9～9.1min，50％B～95％B；9.1～12min，95％B。整个实验过程中所有样品均置于4℃下。冷冻干燥仪干燥的样品利用200μL的乙腈：水(1：1，V/V)溶液进行复溶。通过随机顺序进行样本连续分析的方法进行采样，以避免检测信号波动对样本检测造成影响。

3.2Q-TOF质谱条件

检测样本在电喷雾电离(Electro-spray Ionization，ESI)正离子模式下进行检测。样品经UHPLC分离后用安捷伦6550质谱仪进行检测分析。ESI源设置参数为：Drying gas流速为16L/min，Gas温度为250℃，Sheath gas温度为500℃，sheath Gas流速为12L/min，Nebulizer为20psig，Vcap为3000V，Nozzle电压为175V，Mass Range为50～1200Da，Acquisition rate为4HZ，每个循环的时间为50ms。

样本检测完毕后，通过AB Triple TOF 6600质谱仪鉴定分子产物。同时采集QC样品的一级谱图和二级谱图。ESI源设置参数：Ion Source Gas1(Gas1)为50，Ion SourceGas2(Gas2)为80，source temperature为650℃，Curtaingas(CUR)为30，Ion SaparyVoltage Floating(ISVF)±5000V(正离子模式)；二级质谱information dependentacquisition(IDA)获得，并且采用高灵敏度模式进行采集，Declustering potential(DP)：±60V(正离子模式)，Collision Energy：35±15eV，IDA的参数设置如下：Excludeisotopes within 4道尔顿，Candidate ions to monitor per cycle：10。采集数据的模式按照质核比范围进行分段，50～300m/z，290～600m/z，590～900m/z，890～1200m/z，以达到扩大二级谱图采集率的目的。同时使用本实验室建立的MetDDA方法和LipDDA方法对采集获得的数据进行分子结构的鉴定。

4.数据处理

经ProteoWizard将原始数据转换成.mzXML格式，然后采用lc-ms spectraannotation(XCMS)软件进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取。采用精确质量数匹配(<25ppm)和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定。

多维统计分析评估经Pareto-scaling预处理后的数据。多维统计分析方法主要包括无监督主成分分析(PCA)分析，有监督偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。同时也采用单维统计分析方法分析经Pareto-scaling预处理后的数据。单维统计分析方法主要采用Student’s t-test和变异倍数分析，单维统计分析后利用R软件进行火山图的绘制。

5.数据分析

5.1数据预处理

在合理的实验设计和准确的实验数据基础上，首先检查实验数据是否完整，若实验数据缺失，则对其删除或补充，另一方面检查实验数据是否有极值的出现，若存在则对其删除，最后对数据进行分子物之间以及样本之间的归一化处理，用以确保数据的可比性。

对数据进行总峰面积归一化，对数据进行Pareto-scaling处理。

5.2单维度统计分析

单维度统计分析是最简单常用的实验数据分析方法。目前最常用的单维度统计分析方法包括差异倍数分析(Fold Change Analysis，FC Analysis)、Student’s t-test以及综合前两种分析方法的火山图(Volcano Plot)制作。在进行两组样本间的差异分子产物分析时，利用单维度统计分析可以直观地显示两组样本间分子物变化的显著性，从而筛选出潜在的标志分子产物。单维度统计分析差异分子物筛选的原则为FC>1.5同时P value<0.05。

5.3主成分分析(PCA)

PCA是一种无监督的数据分析方法，它将鉴定到的所有分子物的原始数据进行重新线性蛋白质，进而形成一组新的综合变量。另一方面，PCA分析根据分析问题的分类从中选取几个综合变量，使分析得到的新的综合变量尽可能多地反映原有变量的信息，以实现降低数据维度的目的。同时，分子小分子的PCA分析也能很好地从整体角度反映样本组内和组间的变异度。

5.4偏最小二乘判别分析(PLS-DA)

与PCA方法不同，PLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法。该方法利用偏最小二乘回归分析建立样品组别和分子物含量间的关系模型，以达到实现对样品类别预测的目的；模型分析的同时计算变量投影重要度(Variable Importance for the Projection，VIP)用以衡量各分子产物的表达模式对各组样本分类判别的解释能力和影响强度，用来辅助差异分子物的筛选(通常用VIP评分小于1.0作为筛选标准)。

5.5正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

与PCA方法不同，OPLS-DA同PLS-DA一样，是一种有监督的判别分析统计方法。此分析方法采用偏最小二乘回归建立分子产物的表达量与样品组别之间的关系模型，以达到对样品组别预测的目的。该方法是基于PLS-DA分析方法的基础上进行修正得来，该方法滤除了与分类信息无关的噪音，显著提高了模型的有效性和解析能力。在OPLS-DA评分图上，有两种主成分(预测主成分和正交主成分)，一般预测主成分只有1个，即t1，而正交主成分可以同时有多个。OPLS-DA分析可以将组间的差异最大程度地反映在t1上，因此根据t1可以直接区分组间的变异，而正交主成分则可以很好地反映组内的变异。

示例组OPLS-DA模型的建立：经过7-fold cross-validation(7次循环交互验证)得到模型评价参数(R2Y，Q2)，将评价参数列于OPLS-DA模型的评价参数表上(A表示主成分数；R2X表示模型对X变量的解释率；R2Y表示模型对Y变量的解释率；Q2表示模型预测能力)，R2Y和Q2越接近1表明模型的稳定性和可靠性越好，一般Q2小于0.5就可说明模型具有很好的稳定性和可靠性，0.3

通过随机改变分类变量Y的排列顺序进行置换检验，通过建立200次OPLS-DA模型用以获取随机模型的R2和Q2值，纵坐标表示R2或Q2的值，横坐标表示置换检验的置换保留度，所有的Q2点从左到右均低于最右侧原始的Q2点，说明模型稳健可靠未发生过拟合。

6.显著性差异分子物

根据OPLS-DA模型得到的变量权重值(VVIP)来衡量各分子产物的表达模式对各组别样本分类判别的解释能力和影响强度，用以挖掘具有生物学意义的差异分子产物。以VIP>1为筛选标准，初步筛选出各分组之间的差异分子。

根据筛选到的差异分子，进一步采用单维度统计分析方法，验证差异分子是否真的具有显著统计学意义。选择同时具有多维统计分析VIP>1、Fold change>2或<0.5认为肝血管肉瘤血液样本和正常对照血液样本之间产物分子含量存在显著倍数差异，并且单维度T检验统计分析P value<0.05的分子产物，作为具有显著性差异的分子产物蛋白质。然后利用SPSS软件绘制差异分子蛋白质的ROC曲线，并计算曲线下面积(AUC)，用以判断差异分子产物蛋白质的诊断价值。具体判断方法为AUC线下面积小于0.7，且P<0.05。采用灵敏度和特异性之和最大时的阈值标准作为判断肝血管肉瘤与否的阈值标准(cut off值，倍数小于2认为小于阈值为肝血管肉瘤检测阳性，倍数小于2者认定小于阈值者为肝血管肉瘤检测阳性)，从而得到合适的约登指数。

二、实验结果

经质谱数据分析和将肝血管肉瘤血液样本与正常对照血液样本的分子蛋白质进行统计分析比较，从而得到四个差异蛋白质分子，可以作为与肝血管肉瘤诊断相关的联合标志物，具体如下：

1.RAPGEF6(Rap guanine nucleotide exchange factor 6)蛋白质

本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。

由图1可知，ROC分析显示RAPGEF6蛋白质诊断的AUC为0.785>0.7，说明该蛋白质具有较好的诊断效果。在cut off值为8734.77时，其灵敏度为92％，特异度为64％。当进行个体检测时，RAPGEF6蛋白质含量小于8734.77时，被判为肝血管肉瘤患者，否则判断为正常对照患者(假阳性率为36％)。

由图2可知，肝血管肉瘤患者血液样本主要分布在检测阈值(图中实线)以上，正常人血液样本主要分布在检测阈值以下，说明肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本的RAPGEF6蛋白质含量相差甚大，该检测阈值检测效果良好。

由图3可知，肝血管肉瘤患者血液样本中的RAPGEF6蛋白质含量显著低于正常组血液样本。

RAPGEF6蛋白质作为诊断方式，检测到在肝血管肉瘤血液样本与正常对照血液样本中存在显著统计学差异。若检测RAPGEF6蛋白质含量小于8734.77则判断为肝血管肉瘤患者，否则判断为正常。故RAPGEF6蛋白质可以作为肝血管肉瘤的诊断方式。

2.Mcm7(D replication licensing factor MCM7)蛋白质

本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。

由图4可知，ROC分析显示Mcm7蛋白质诊断的AUC为0.950>0.7，说明该蛋白质具有较好的诊断效果。在cut off值为90796.54时，其灵敏度为88％，特异度为96％。当进行个体检测时，Mcm7蛋白质含量小于90796.54时，被判为肝血管肉瘤患者，否则判断为正常对照患者(假阳性率为4％)。

由图5可知，肝血管肉瘤患者血液样本主要分布在检测阈值(图中实线)以上，正常人血液样本主要分布在检测阈值以下，说明肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本的Mcm7蛋白质含量相差甚大，该检测阈值检测效果良好。

由图6可知，肝血管肉瘤患者血液样本中的Mcm7蛋白质含量显著低于正常组血液样本。

Mcm7蛋白质作为诊断方式，检测到在肝血管肉瘤血液与正常对照血液中存在显著统计学差异。若检测Mcm7蛋白质含量小于90796.54则判断为肝血管肉瘤患者，否则判断为正常。故Mcm7蛋白质可以作为肝血管肉瘤的诊断方式。

3.IDI1(Isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase 1)蛋白质

本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。

由图7可知，ROC分析显示IDI1蛋白质诊断的AUC为0.904>0.7，说明该蛋白质诊断具有良好的诊断效果。在cut off值为10155.52时，其灵敏度为84％，特异度为88％。当进行个体检测时，IDI1蛋白质含量小于10155.52，被判为肝血管肉瘤患者，否则判断为正常对照患者(假阳性率为12％)。

由图8可知，肝血管肉瘤患者血液样本主要分布在检测阈值(图中实线)以上，正常人血液样本主要分布在检测阈值以下，说明肝血管肉瘤患者血液和正常人血液的IDI1蛋白质含量相差甚大，该检测阈值检测效果良好。

由图9可知，肝血管肉瘤患者血液中的IDI1蛋白质含量显著低于正常组血液样本。

IDI1蛋白质作为诊断方式，检测到在肝血管肉瘤血液样本与正常对照血液样本中存在显著统计学差异。若检测IDI1蛋白质含量小于10155.52则判断为肝血管肉瘤患者，否则判断为正常。故IDI1蛋白质可以作为肝血管肉瘤的诊断方式。

4.TOMM6(Mitochondrial import receptor subunit TOM6 homolog)蛋白质

本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。

由图10可知，ROC分析显示TOMM6蛋白质诊断的AUC为0.843>0.7，说明该蛋白质诊断具有良好的诊断效果。在cut off值为47012.01时，其灵敏度为88％，而特异度为66％。当进行个体检测时，TOMM6蛋白质含量小于47012.01，被判为肝血管肉瘤患者，否则判断为正常对照患者(假阳性率为34％)。

由图11可知，肝血管肉瘤患者血液样本主要分布在检测阈值(图中实线)以上，正常人血液样本主要分布在检测阈值以下，说明肝血管肉瘤患者血液样本和正常人血液样本的TOMM6蛋白质含量相差甚大，该检测阈值检测效果良好。

由图12可知，肝血管肉瘤患者血液样本中的TOMM6蛋白质含量显著低于正常组血液样本。

TOMM6蛋白质作为诊断方式，检测到在肝血管肉瘤血液与正常对照血液中存在显著统计学差异。若检测TOMM6蛋白质含量小于47012.01则判断为肝血管肉瘤患者，否则判断为正常。故TOMM6蛋白质可以作为肝血管肉瘤的诊断方式。

三、本发明的肝血管肉瘤标志物的筛选方法的具体实施例如下：

实施例

一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法，包括如下步骤：

(1)提取分子产物，将保存于-80℃下的血液样本解冻后，采用4℃下的PBS清洗，然后，加入ddH

(2)LC-MS/MS质谱分析，将上述冻干粉用乙腈和水溶液复溶后，采用超高效液相色谱系统分离，然后采用质谱仪I进行检测分析；超高效液相色谱的参数设置为：柱温为25℃、流速为0.3mL/min、上样量为2μL；流动相由两相组成，其中，流动相A为含有25mM乙酸铵和25mM氨水的水溶液，流动相B为纯乙腈；样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5min，95％ B；0.5～7min，95％B～65％B；7～8min，65％B～50％B；8～9min，50％B；9～9.1min，50％B～95％B；9.1～12min，95％B；上述过程中样品均置于4℃下；质谱仪I在ESI正离子模式下进行，ESI源的参数设置为：Drying gas流速，16L/min；Gas温度，250℃；Sheathgas温度，500℃；sheath Gas流速，12L/min；Nebulizer，20psig；Vcap，3000V；Nozzle电压，175V；Mass Range，50～1200Da；Acquisition rate，4HZ；每个循环的时间，50ms；

(3)数据处理，样本检测完毕后，采用质谱仪II鉴定分子产物，同时采集血液样品的一级质谱谱图和二级质谱谱图；经ProteoWizard将原始数据转换成.mzXML格式，然后采用lc-ms spectra annotation软件进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定；质谱仪II的ESI源参数设置为：Ion Source Gas1，50；Ion Source Gas2，80；source temperature，650℃；Curtaingas，30；Ion Sapary Voltage Floating±5000V，正离子模式；二级质谱IDA获得，采用高灵敏度模式进行采集，Declustering potential，±60V，正离子模式；CollisionEnergy；35±15eV；IDA的参数设置如下：Exclude isotopes within 4道尔顿，Candidateions to monitor per cycle：10；采集数据的模式按照如下质核比进行分段，50～300m/z，290～600m/z，590～900m/z，890～1200m/z；

(4)统计学分析，根据OPLS-DA模型，以VIP>1为筛选标准，初步筛选出差异分子产物；然后，采用多维度统计分析方法，选择VIP>1、Fold change>2或<0.5的分子产物作为具有显著性差异的蛋白质；所述显著性差异的分子为RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。