一种H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞及其培养方法

技术领域

本申请涉及生物医学领域，具体地，涉及一种H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞及其培养方法。

背景技术

近年来肿瘤干细胞学说备受人们的关注，研究表明，肿瘤的生长是由于肿瘤中极少量的肿瘤干细胞不断增殖的结果，只有消灭这一小群肿瘤干细胞，才能更好地治愈癌症。因此，了解干细胞潜在的生物学功能及其分化增殖情况，对于肿瘤的早期检测、治疗和诊断都有重要的临床意义。但是，目前肿瘤干细胞在肿瘤组织中的占比极低。近年来，随着肿瘤发生基因遗传学基础逐渐阐明及分子诊断的快速发展，分子病理诊断逐渐在临床得到广泛的应用。

H3K27M突变在脊髓胶质瘤中的弥漫性中线胶质瘤的独特性表达，目前已经成为中枢神经系统肿瘤分类中的一个新的类型。因此，找到H3K27M突变型且具有特异的肿瘤干性的脊髓胶质瘤细胞，对于脊髓胶质瘤的药物筛选具有非常重要的意义。

发明内容

本公开的目的在于开发一种分离的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞，以进行脊髓胶质瘤的药物筛选。

为了实现上述目的，本公开第一方面提供了一种分离的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞，所述H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞的保藏编号为CGMCC No.23028。

根据本公开，所述H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞具有肿瘤干性，能够通过悬浮培养获得。

本公开第二方面还提供了第一方面所述脊髓胶质瘤细胞的培养方法，其中，所述方法包括如下步骤：S1、将第一方面所述的脊髓胶质瘤细胞进行酶解消化和离心，收集得到样本细胞；S2、将样本细胞用PBS重悬离心后，接种于悬浮培养基中进行悬浮培养，得到单细胞悬液；S3、将单细胞悬液接种于超低吸附培养皿中培养，然后用消化酶消化成单细胞。

根据本公开，其中，步骤S2中，所述悬浮培养的条件包括：培养时间为3-10天，培养温度为35-45℃。

根据本公开，其中，步骤S3中，所述传代培养的条件包括：培养时间为3-10天，培养温度为35-45℃。

根据本公开，其中，所述悬浮培养基含有bFGF细胞因子、EGF细胞因子、链霉素、青霉素、B27补充物和转铁蛋白。

根据本公开，其中，所述bFGF细胞因子的浓度为15-30ng/mL，所述EGF细胞因子的浓度为15-30ng/mL，所述B27补充物的浓度为B27(50×)，所述链霉素的浓度为15-30ng/mL，所述青霉素的浓度为15-30ng/mL。

根据本公开，其中，接种于所述悬浮培养基的细胞密度为10

根据本公开，其中，所述PBS重悬离心的条件包括：离心速率为800-1200rpm/min，离心温度为4-35℃，离心时间为1-10min。

本公开还提供了第一方面所述H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞在筛选治疗H3K27M突变型脊髓胶质瘤药物中的用途。

通过上述技术方案，本公开提供了一种可悬浮培养的具有干细胞特性的脊髓胶质瘤细胞，该脊髓胶质瘤细胞携带H3K27M突变，以成球的方式生长，高表达GFAP和Ki-67，在免疫缺陷小鼠皮下也能够成瘤，与脊髓胶质瘤一样天然对替莫唑胺(TMZ)耐药，可以服务于体外研究H3K27M脊髓胶质瘤的生物学功能和对药物治疗的响应等。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏信息

本公开涉及到的生物保藏信息包括：分类命名为：人源细胞；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2021-09-17；保藏编号为：CGMCC No.23028。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是本公开培养的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞SCA-S01的细胞形态。

图2是本公开培养的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞SCA-S01的二代测序结果。

图3是本公开培养的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞SCA-S01免疫组化染色测试图。

图4是本公开培养的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞SCA-S01在不同浓度TMZ下的响应情况。

图5是对照的脑胶质瘤干细胞在不同浓度TMZ下的响应情况。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面提供了一种分离的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞，所述H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞的保藏编号为CGMCC No.23028。

根据本公开，其中，所述H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞具有肿瘤干性，能够通过悬浮培养获得。

H3K27M突变是以星形细胞分化为主并伴有H3K27M突变的浸润中线的高级别胶质瘤，其中H3组蛋白中的27位的赖氨基酸突变为蛋氨基酸。

本公开第二方面提供了第一方面所述脊髓胶质瘤细胞的培养方法，其中，所述方法包括如下步骤：

S1、将第一方面所述脊髓胶质瘤细胞进行酶解消化和离心，收集得到样本细胞；

S2、将样本细胞用PBS重悬离心后，接种于悬浮培养基中进行悬浮培养，得到单细胞悬液；

S3、将单细胞悬液接种于超低吸附培养皿中培养，然后用消化酶消化成单细胞。

根据本公开，将脊髓胶质瘤细胞以较低密度接种于液体或半固体的无血清培养基中，培养时采用超低吸附的培养容器以减少细胞贴壁，无血清培养基和超低吸附的培养容器可以维持细胞处于未分化状态，只有具备干细胞潜能的细胞才能在无血清环境下长期生存并增殖。

根据本公开，其中，步骤S2中，所述悬浮培养的条件包括：培养时间为3-10天，培养温度为35-45℃。

根据本公开，其中，步骤S3中，所述传代培养的条件包括：培养时间为3-10天，培养温度为35-45℃。

根据本公开，其中，所述悬浮培养基含有bFGF细胞因子、EGF细胞因子、链霉素、青霉素、B27补充物和转铁蛋白。

根据本公开，其中，所述bFGF细胞因子的浓度为15-30ng/mL，所述EGF细胞因子的浓度为15-30ng/mL，所述B27补充物的浓度为B27(50×)，所述链霉素的浓度为15-30ng/mL，所述青霉素的浓度为15-30ng/mL。

根据本公开，其中，接种于所述悬浮培养基的细胞密度为10

根据本公开，其中，所述PBS重悬离心的条件包括：离心速率为800-1200rpm/min，离心温度为4-35℃，离心时间为1-10min。

本公开还提供了第一方面所述H3K27M突变型脊髓胶质瘤在筛选治疗H3K27M突变型脊髓胶质瘤药物中的用途。

下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

实施例1

细胞悬浮培养的过程

把脑胶质瘤组织块(在天坛医院按照符合医学伦理的操作流程手术摘取的脑胶质瘤组织)置于烧杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；然后置于含有青链霉素的混合液中60分钟；用眼科剪把组织切成2-3毫米大小的块，以便于消化；加入相当于组织块总量50倍体积的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；置于37℃温箱消化，消化过程中每隔20分钟摇动一次；消化时间为60分钟；然后通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块；800转/分离心消化液，得到样本细胞，吸出上清，向沉淀中加入原代培养基，至细胞密度为10

将上述悬浮培养得到的单细胞悬液接种于超低吸附培养皿中培养，然后用消化酶消化成单细胞，重复操作传代培养至第4代时，部分原代细胞出现死亡、停止生长或生长缓慢的现象，另一部分原代细胞能够在不含血清的悬浮培养基中呈现良好增殖的状态，选取这些呈现良好增殖状态的细胞系作为进一步的筛选对象，进行MTT实验和Transwell实验，检测细胞系的增殖和迁移能力，选取增殖和迁移能力最强的一个细胞系进行保藏，即为本公开培养的携带H3K27M突变的脊髓胶质瘤细胞SCA-S01，保藏编号为CGMCC No.23028，其细胞形态图片如图1所示，左侧为本公开建立的脊髓胶质瘤干细胞，右侧为对照的脑胶质瘤干细胞(由实验室培养)。

通过二代测序技术测定建立的脊髓胶质瘤干细胞携带的H3K27M突变，结果显示，该细胞携带H3K27M的突变，如图2所示。

将该细胞注射到免疫缺陷小鼠的皮下，在免疫缺陷小鼠肿瘤体内可以形成脊髓胶质瘤肿瘤。将肿瘤取出后，制作成石蜡包埋切片，进行免疫组化染色，可以观察到肿瘤携带H3K27M突变，且高表达Ki-67，如图3所示。

实施例2

已知替莫唑胺药物对部分脑胶质瘤患者有效，但对另一部分脑胶质瘤患者无效；其中替莫唑胺对于H3K27M的脊髓胶质瘤均无效，本测试实施例分别测定本公开的脊髓胶质瘤细胞SCA-S01和对照细胞(实验室培养的脑胶质瘤干细胞)对替莫唑胺的药物反应性。

分别在对照的脑胶质瘤干细胞和本公开的脊髓胶质瘤细胞SCA-S01上施用替莫唑胺药物，药物终浓度为100、200、400、500、800、1000和2000μM，药物作用72小时后，用CCK8试剂盒(购自于默克公司)检测细胞活力，结果如图4和图5所示。

图4为本公开培养的脊髓胶质瘤细胞SCA-S01在不同浓度的TMZ处理下细胞的抑制情况和TMZ IC50值，图5为对照的脑胶质瘤干细胞在不同TMZ浓度处理下，细胞的抑制情况和TMZ IC50值。结果显示，与对照的脑胶质瘤干细胞对TMZ响应的差异，凸显了本公开制备的脊髓胶质瘤细胞SCA-S01能够对TMZ耐药，进一步证明本公开提供的脊髓胶质瘤细胞SCA-S01具有肿瘤干性，携带H3K27M突变，并且能够反馈出脊髓胶质瘤对替莫唑胺耐药的特性。

通过上述技术方案，本公开成功建立了一株携带H3K27M突变的干细胞样脊髓胶质瘤病人来源细胞(SCA-S01干细胞样细胞)，该细胞以成球的方式生长，与亲代脊髓胶质瘤一样天然对TMZ耐药，在免疫缺陷小鼠皮下可以成瘤，并且该脊髓胶质瘤细胞SCA-S01携带H3K27M突变，且高表达Ki-67，可用于体外研究H3K27M脊髓胶质瘤的生物学功能和对药物治疗的响应等。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。