一种检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于试纸条检测技术领域，尤其涉及一种检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条及其制备方法。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(HCG)，是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。其中α-亚单位为垂体前叶激素所共有；β-亚单位是HCG所特异的。HCG的主要功能就是刺激黄体，有利于雌激素和黄体酮持续分泌以促进子宫蜕膜的形成，使胎盘生长成熟。现代认为HCG是由滋养层过渡型细胞和合体细胞产生的。在妊娠的前8周增殖很快，以维持妊娠。在大约孕8周以后，HCG逐渐下降，直到大约20周达到相对稳定。利用HCG双抗体检测妊龄女性尿液中的HCG含量，在妊娠早期可快速得知结果，是辅助诊断的有效手段。

唾液是一种临床信息丰富的生物液体，其包含多种可溶性生物标志物，使得它可以快速检测或以更标准化的格式进行集中的临床实验室操作。唾液用于体外检测并不罕见，用唾液定量检测皮质醇、雌三醇和睾酮等类固醇激素已经有了较多的应用，目前国内已经有了非常多的用唾液检测艾滋病病毒HIV的快速检测试纸条。重要的是，唾液与血液中的相应成分关系密切，唾液可作为血液的窗口，并有相关实验结果显示人绒毛膜促性腺激素浓度与血液的浓度相关性很好，因此，唾液可作为一种非侵入性、快速、更可接受的妊娠检测生物液体。唾液中人绒毛膜的分泌机理可能是唾液为低渗液体，毛衣血管和毛细淋巴结与腺体的基底膜紧密连接，人绒毛膜促性腺激素可通过腺房细胞间隙和紧密连接回漏方式从血液移行于唾液。国内医院进行的唾液中人绒毛膜促性腺激素相关临床测试，尿液和唾液两种标本同一条件下同时测试，结果表明，孕妇不但尿液中含有HCG，唾液中也含有HCG，两种样本检查结果对照比较，相关性好，且检查结果一致。

唾液检测早孕有更清洁、方便、随时测试、不受样本采集时间影响等诸多优点，然而唾液检测早孕试纸条并不被经常提及，开发难点在于唾液样本存在非检测干扰物多、灵敏度低、层析困难、非特异性等问题，如正常情况下，人HCG的含量小于5mIU/mL，当妊龄女性HCG含量大于5mIU/mL便有怀孕的可能，而市面上尿液早孕试纸条检测限多在25mIU/mL，不能更早的测出怀孕，在怀孕初期如妊娠一周内若HCG含量不足以到25mIU/mL时便不能测出。此外，不管是淋尿的检测方式还是尿杯滴管的检测方式，都难以避免“脏手”，淋尿的检测方式还有可能淋湿检测窗口影响层析结果。另外，尿液检测方式亦受时间和地点的限制。还有当试纸条的样本类型为唾液时，唾液样本较粘稠，唾液从样品垫向上层析时流速较慢，甚至有乳胶微球堵在硝酸素膜上、液体层析至一半、假阳性等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条及其制备方法，该试纸条检测早孕清洁、方便，检测灵敏度高和特异性强。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、滤水垫、包被膜和底板，所述样品垫、所述结合垫、所述滤水垫、所述包被膜依次搭接于所述底板上；

所述样品垫为样品垫处理液处理后的玻璃纤维膜；

以100mL计，所述样品垫处理液包括以下含量的成分：

Tris 1.0～1.5g、酪蛋白0.3～0.8g、Tween-2050～100μL、NaCl 0.5～1.5g、十二烷基三甲基溴化铵0.15～0.2g、4-壬基苯基-聚乙二醇0.8～1.2g、硼砂3.5～4.0g、聚乙烯吡咯烷酮0.5～1g，二硫苏糖醇3～5g和L-半胱氨酸0.8～2g。

优选的，所述样品垫处理液的pH为8.0～8.5。

优选的，所述包被膜为包被有T线和C线的硝酸纤维素；

所述T线喷涂有0.5～1mg/mL的鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液；

所述C线喷涂有0.4～0.6mg/mL的羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液；

T线喷涂或C线喷涂时的喷量为0.5～1.5μL/cm。

优选的，所述鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液或所述羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液制备通过包被稀释液制备得到；所述包被稀释液为含有50～150mg/mL海藻糖的PBS溶液。

优选的，所述结合垫为结合垫处理液处理后的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；

所述结合垫处理液包括3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸1～1.5g、酪蛋白0.2～1g、Tween-2050～100μL和75～85mL水。

优选的，所述玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上喷涂有HCG乳胶微球，所述喷涂的喷量为1.5～3μL/cm。

本发明还提供了上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)样本垫的制备

玻璃纤维膜吸收样品垫处理液均匀后，烘干，即得；

(2)结合垫的制备

玻璃纤维膜或聚酯纤维膜吸收结合垫处理液均匀后，烘干，在结合垫处理液处理后的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上喷涂HCG乳胶微球，喷量为1.5～3μL/cm，即得；

(3)包被膜的制备

用包被稀释液分别稀释鼠抗α-HCG单克隆抗体和羊抗鼠lgG多克隆抗体，得到鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液和羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液，将鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液喷涂在硝酸纤维素膜的T线上，将羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液喷涂在硝酸纤维素膜的C线上，烘干，即得；

(4)试纸条的制备

分别将样品垫、结合垫和滤水垫裁剪后，底板上依次粘贴有所述的样品垫、结合垫、滤水垫和包被膜，所述结合垫的一侧边位于所述样品垫的上方，所述的结合垫的另一侧边位于所述滤水垫一侧边的下方，所述滤水垫的另一侧边位于所述包被膜的下方，所述包被膜上的T线与所述滤水垫靠近。

优选的，所述HCG乳胶微球的制备方法包括以下步骤：

用硼砂缓冲液清洗红色乳胶微球，得到清洗后的红色乳胶微球；

将β-HCG标记抗体与清洗后的红色乳胶微球混合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液进行活化，得到β-HCG标记抗体修饰的红色乳胶微球；

将乙醇胺溶液与β-HCG标记抗体修饰的红色乳胶微球混合封闭，得到封闭后的HCG红色乳胶微球，离心去上清液，再加入Tris缓冲液与封闭后的HCG红色乳胶微球超声混匀，离心去上清，然后加入Tris缓冲液超声均匀，再室温旋转混匀4～6h，即得HCG乳胶微球。

优选的，所述β-HCG标记抗体、清洗后的红色乳胶微球与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的添加比例为1mg：10mg：0.05mL。

本发明还提供了一种检测早孕的试剂盒，所述试剂盒包括上述试纸条和样品稀释液。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条及其制备方法，本发明直接采集唾液并利用样品垫处理液处理样品垫，使唾液样本增加水溶性，使唾液样本层析流畅，减低唾液中其它杂质成分的干扰，消除唾液样本检测的假阳性现象，能起到完全消除非特异性反应的作用。同时本发明的试纸条的稳定性能好，能常温下长时间保存。本发明的试纸条的检测限为5mIU/mL，能更早的测出怀孕,可以作为一种潜在的、对用户友好的、接受度高的产品，有更清洁、方便、随时测试、不受样本采集时间地点的影响等诸多优点。

附图说明

图1为利用本发明试纸条检测判断是否怀孕的示意图；

图2为不同检测卡检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条的特异性测试结果，图中从左到右依次为利用对比例3、对比例2、对比例1和实施例2的检测卡测试结果；

图3为不同检测卡检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条室温保存182天后的特异性测试结果，图中从左到右依次为利用对比例2、对比例1和实施例2的检测卡测试结果；

图4为20例阴性唾液样本测试结果；

图5为8例阳性样本测试结果。

具体实施方式

本发明提供了一种检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、滤水垫、包被膜和底板，所述样品垫、所述结合垫、所述滤水垫、所述包被膜依次搭接于所述底板上；

所述样品垫为样品垫处理液处理后的玻璃纤维膜；

以100mL计，所述样品垫处理液包括以下含量的成分：

Tris 1.0～1.5g、酪蛋白0.3～0.8g、Tween-2050～100μL、NaCl 0.5～1.5g、十二烷基三甲基溴化铵0.15～0.2g、4-壬基苯基-聚乙二醇0.8～1.2g、硼砂3.5～4.0g、聚乙烯吡咯烷酮0.5～1g，二硫苏糖醇3～5g和L-半胱氨酸0.8～2g。

在本发明中，所述样品垫的宽优选为2±0.1cm，长优选为30±0.2cm；所述滤水垫购自Whatman，货号8151-6621。

在本发明中，所述样品垫处理液优选的还包括750～850mL的水，所述样品垫处理液的pH优选为8.0～8.5。所述样品垫处理液的制备方法优选为依次称取Tris 1.0～1.5g、酪蛋白0.3～0.8g、Tween-2050～100μL、NaCl 0.5～1.5g、十二烷基三甲基溴化铵0.15～0.2g、4-壬基苯基-聚乙二醇0.8～1.2g、硼砂3.5～4.0g、聚乙烯吡咯烷酮0.5～1g，加入750～850mL的水，搅拌溶解，然后加入3～5g二硫苏糖醇和0.8～2g L-半胱氨酸，搅拌溶解，调pH至8.0～8.5，定容至100mL，即得样品垫处理液。该样品垫处理液中将二硫苏糖醇和L-半胱氨酸联合使用能够达到清除层析过程中非特异性反应的目的，同时二硫苏糖醇具有抗氧化作用可阻止L-半胱氨酸被空气氧化成胱氨酸形成沉淀，具有协同增效的作用。二硫苏糖醇和L-半胱氨酸两种试剂通常配制成溶液使用，溶液易被氧化，不利于储存及有效期短，通常需尽快使用或低温放置，对于快速检测试剂这种类型的产品而言，冷冻的存储条件显然是不切实际的，因此本发明将上述两种试剂及其它样品垫处理液试剂配方放置在样品垫中，能有效的解决试剂有效期短的问题，且常温下长期保存，保存有效期达6个月以上。所述4-壬基苯基-聚乙二醇购自江苏普乐思生物科技有限公司的湿润剂P-40。

本发明的试纸条采用新型样品垫处理方式，唾液滴入样品垫中，与样品垫中的有效成分产生反应，唾液粘稠度降低，层析非常流畅，无堵膜现象。增加试纸条的特异性，减少了唾液中其它成分的干扰，避免了唾液样本易引起假阳性现象的情况。

在本发明中，所述包被膜优选为包被有T线和C线的硝酸纤维素；所述T线优选的喷涂有0.5～1mg/mL的鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液；所述C线优选的喷涂有0.4～0.6mg/mL的羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液；T线喷涂或C线喷涂时的喷量优选为0.5～1.5μL/cm。所述鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液或所述羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液制备通过包被稀释液制备得到；所述包被稀释液为含有50～150mg/mL海藻糖的PBS溶液。所述PBS溶液的浓度优选为0.005～0.015M。所述包被膜上的T线和C线的间隔优选为0.4～0.6cm。本发明通过筛选的上述抗体原料，增加灵敏度的同时减少非特异性的反应的发生。在本发明中，所述鼠抗α-HCG单克隆抗体购自南京京达生物技术有限公司，货号W4003；所述鼠抗α-HCG单克隆抗体购自奥创生物技术(山东)有限公司，货号A01-Ab2。

在本发明中，所述结合垫优选为结合垫处理液处理后的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；

在本发明中，所述结合垫处理液优选的包括3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸1～1.5g、酪蛋白0.2～1g、Tween-2050～100μL和75～85mL水。所述结合垫处理液的pH优选为8.0～8.5。所述结合垫处理液的制备方法为称取3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸1～1.5g、酪蛋白0.2～1g、Tween-2050～100μL和75～85mL水，搅拌溶解，调pH为8.0～8.5，定容至100mL即得。作为本发明一优选的实施方式，所述玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上喷涂有HCG乳胶微球，所述喷涂的喷量为1.5～3μL/cm。所述3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸购自Damas-beta(阿达玛斯)，货号76496B。

在本发明中，所述结合垫宽优选为1±0.2cm，长优选为30±0.2cm。

本发明还提供了上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)样本垫的制备

玻璃纤维膜吸收样品垫处理液均匀后，烘干，即得；

(2)结合垫的制备

玻璃纤维膜或聚酯纤维膜吸收结合垫处理液均匀后，烘干，在结合垫处理液处理后的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上喷涂HCG乳胶微球，喷量为1.5～3μL/cm，即得；

(3)包被膜的制备

用包被稀释液分别稀释鼠抗α-HCG单克隆抗体和羊抗鼠lgG多克隆抗体，得到鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液和羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液，将鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液喷涂在硝酸纤维素膜的T线上，将羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液喷涂在硝酸纤维素膜的C线上，烘干，即得；

(4)试纸条的制备

分别将样品垫、结合垫和滤水垫裁剪后，底板上依次粘贴有所述的样品垫、结合垫、滤水垫和包被膜，所述结合垫的一侧边位于所述样品垫的上方，所述的结合垫的另一侧边位于所述滤水垫一侧边的下方，所述滤水垫的另一侧边位于所述包被膜的下方，所述包被膜上的T线与所述滤水垫靠近。

在本发明中，样本垫的制备：玻璃纤维膜吸收样品垫处理液均匀后，烘干，即得。所述烘干方式优选为于40～45℃干燥2h以上。

在本发明中，玻璃纤维膜或聚酯纤维膜吸收结合垫处理液均匀后，烘干。所述烘干方式优选为于40～45℃烘干8h～12h。

在本发明中，在结合垫处理液处理后的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上喷涂HCG乳胶微球，喷量为1.5～3μL/cm，即得。所述HCG乳胶微球的制备方法包括以下步骤：用硼砂缓冲液清洗红色乳胶微球，得到清洗后的红色乳胶微球；将β-HCG标记抗体与清洗后的红色乳胶微球混合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液进行活化，得到β-HCG标记抗体修饰的红色乳胶微球；将乙醇胺溶液与β-HCG标记抗体修饰的红色乳胶微球混合封闭，得到封闭后的HCG红色乳胶微球，离心去上清液，再加入Tris缓冲液与封闭后的HCG红色乳胶微球超声混匀，再室温旋转混匀4～6h，离心去上清，然后加入Tris缓冲液超声均匀，即得HCG乳胶微球。

在本发明中，用硼砂缓冲液清洗红色乳胶微球，得到清洗后的红色乳胶微球。所述红色乳胶微球的粒径优选为150～250nm，进一步优选为200nm。所述红色乳胶微球与硼砂缓冲液的体积比优选为0.1～0.2:1。所述硼砂缓冲液的浓度优选为0.05～0.15M。所述清洗的方式优选为与13500rpm离心10～20min，去上清液，再在离心清洗后的红色乳胶微球中加入0.5～1.5mL硼砂缓冲液，超声混匀。所述红色乳胶微球购自苏州为度生物科技有限公司，货号DR0200CA-1。

在本发明中，将β-HCG标记抗体与清洗后的红色乳胶微球混合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液进行活化，得到β-HCG标记抗体修饰的红色乳胶微球。所述β-HCG标记抗体、清洗后的红色乳胶微球与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的添加比例为1mg：10mg：0.05mL。所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液优选为5～15mg/mL1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液。所述5～15mg/mL1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的制备方法优选为称取5～15mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液溶于1mL的纯化水中。所述活化方式优选为震荡混匀后在室温下混匀4～8h。所述β-HCG标记抗体购自创生物技术(山东)有限公司，货号A01-Ab1。

在本发明中，将乙醇胺溶液与β-HCG标记抗体修饰的红色乳胶微球混合封闭，得到封闭后的HCG红色乳胶微球。所述乙醇胺溶液的浓度优选为0.08～0.12M乙醇胺溶液。所述封闭的时间优选为15～30分钟。

在本发明中，加入Tris缓冲液与封闭后的HCG红色乳胶微球超声混匀再室温旋转混匀4～6h，所述Tris缓冲液优选为50～100mM的Tris缓冲液。

在本发明中，然后加入Tris缓冲液超声均匀，即得HCG乳胶微球。所述加入的Tris缓冲液的体积优选为0.4～0.8mL，所述超声时间优选为10～20min。

在本发明中，喷涂HCG乳胶微球后，还包括37～55℃的干燥20～60min的步骤。

本发明的试纸条不采取胶体金方法而选用乳胶微球标记，同时筛选200nm粒径的红色乳胶微球以消除部分唾液样本粘稠带来的影响。

本发明利用上述试纸条检测判断是否怀孕的标准为(如图1所示)：

(1)阳性(怀孕)：二条红色反应线，即检测区(T)及对照区(C)各出现一条红色反应线，若检测区(T)颜色很弱时表示可能刚怀孕，请隔天重新检测。

(2)阴性(未怀孕)：一条红色反应线，即仅在对照区(C)出现一条红色反应线。

(3)无效：对照区(C)无红色反应线出现，表示测试错误或无效。

当妊龄女性HCG含量大于5mIU/mL时，便有怀孕的可能，在妊娠初期如10天内，HCG含量大于5mIU/mL但小于25mIU/mL时，便不能被常用的灵敏度较低的试纸条检出。本发明的检测试纸条最低检测限为5mIU/mL，能更早测出怀孕。本发明的最低检出限指≥95％检出率的最低浓度。

本发明还提供一种检测早孕的试剂盒，所述试剂盒包括上述试纸条和样品稀释液。

所述样品稀释液优选为0.9％生理盐水，所述样品稀释液增加唾液样本液化效果。检测时，唾液样品与样品稀释液的添加体积比例为1：1。本发明的试剂盒还包括小漏斗，小漏斗为采集唾液用，打开样本处理管管盖，将配套的唾液漏斗置于管口将口腔中的唾液吐入唾液漏斗中，取下唾液漏斗，盖上样本处理管管盖，样本混合均匀后滴液即可检测。本发明利用试剂盒检测时，5min即可判读，卫生、便捷、可随时测试、不受样本采集时间地点的影响。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条的制备方法，步骤如下：

(1)样本垫的制备

样品垫处理液的配制：准备100mL的小烧杯，量取800mL的纯净水，依次称取Tris1.21g、酪蛋白0.5g、Tween-2080μL、NaCl 0.9g、十二烷基三甲基溴化铵0.15g、4-壬基苯基-聚乙二醇1.0g、硼砂3.811g、聚乙烯吡咯烷酮0.8g，依次放至小烧杯中，逐一搅拌溶解再放下一试剂，上述物料全部溶解完毕后，加入3g二硫苏糖醇、1.2g L-半胱氨酸，搅拌溶解，调pH至8.5，最后定容至100mL待用。

按样品垫处理液配方配制好处理液，将其倒在1张玻璃纤维上，用镊子轻刮玻纤，引导处理液被玻纤膜均匀吸收，待玻纤膜吸收均匀后，用镊子夹住对角线两角，迅速将玻纤移至沥水网架上；将沥水架网筛放置在烘箱中45℃烘干4h至多余水分蒸发，烘箱相对湿度≤30％。

(2)结合垫的制备

S1、清洗红色乳胶微球

加200nm红色乳胶微球0.1mL到装有1mL 0.1M硼砂缓冲液的2mL离心管中，充分混匀。使用离心机14000rpm离心15min，使用移液器去上清液，再次清洗红色乳胶微球颗粒后加1mL0.1M硼砂缓冲液到离心管中，使用超声波细胞破碎仪超声混匀离心管的乳胶微球。

S2、标记β-HCG到清洗后的红色乳胶微球中

用移液器移取0.5mgβ-HCG标记抗体，标记抗体移取的量按终浓度1mg/mL计算，加入到1mL清洗好的红色乳胶微球中，再加入25μL乳胶微球活化剂，乳胶微球活化剂为8mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，震荡混匀1分钟后在室温下用摇床或旋转仪混匀5小时，得到β-HCG标记抗体修饰的红色乳胶微球。

S3、封闭

将50μL的封闭溶液加入约1mLβ-HCG标记抗体修饰的红色乳胶微球中，加入的封闭液为0.1M的乙醇胺溶液，混合15～30分钟，使用离心机离心去上清，加入1mL保存液到封闭后的HCG红色乳胶微球中，保存液为100mM的Tris缓冲液，超声，混匀4～6h，离心去上清，最后加入0.5mL最终体积的保存液，水浴超声15min，得到HCG乳胶微球。

S4、喷涂HCG乳胶微球

结合垫处理液的配制：称取3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸1.13g、酪蛋白0.5g、Tween-2050μL至装有80mL纯净水的小烧杯中，搅拌溶解，调pH至8.5，最后定容至100mL待用。

结合垫的处理：配制好结合垫处理液，将其倒在1张聚酯膜上，用镊子轻刮聚酯膜，引导处理液被聚酯膜均匀吸收，待聚酯膜吸收均匀后，用镊子夹住对角线两角，迅速将聚酯膜移至沥水网架上；

将沥水架网筛放置在烘箱中45℃烘干8h，烘箱相对湿度≤30％。

称取海藻糖20mg加入到1.5mL离心管中，称量范围为计算量的±0.001g。量取80μL乳胶稀释液、20μL HCG乳胶微球加入到含有20mg海藻糖的1.5mL离心管中震荡摇匀，乳胶稀释液为100mM的Tris缓冲液及2.5mM的Casein配制成的Tris-Casein缓冲液。准备处理好的结合垫使用喷金滑膜仪喷涂HCG乳胶微球，喷量为3μL/cm，喷完HCG乳胶微球的结合垫需在55℃的烘箱干燥20min，烘箱的相对湿度≤30％。

(3)包被膜的制备

使用抗体包被稀释液，包被稀释液为0.01M的PBS及加入终浓度为100mg/mL的海藻糖，分别将鼠抗α-HCG单克隆抗体、羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释，得到羊抗鼠lgG多克隆抗体稀释液即C线包被液0.5mg/mL，鼠抗α-HCG单克隆抗体稀释液即T线包被液0.5mg/mL，按喷膜划线设备在贴有硝酸纤维素膜的底板划线，喷量为1μL/cm，膜上是两条均匀连续的C、T平行线，划完线后将包被膜放置在干燥箱中烘干。

(4)试纸条的制备

S1、试纸条组装：

1)裁条：将样品垫裁至宽2±0.1cm，长30cm±0.2；HCG乳胶结合垫裁至1±0.2cm，长30cm±0.2；滤水垫长30cm±0.1，宽4mm。

2)底板平放在桌面，将滤水垫一侧边贴在硝酸纤维素膜下方，与硝酸纤维素膜下沿接触2mm；

3)将喷涂HCG乳胶微球的结合垫(又称乳胶结合垫)一侧边贴在滤水垫另一侧边下方，与乳胶结合垫下沿接触2mm；

4)将样品垫一侧边贴在乳胶结合垫另一侧边下方，与乳胶结合底垫下沿接触2mm；

5)粘贴衔接胶带。衔接胶带覆盖样品垫-结合垫-滤水垫的衔接处，并将滤水垫上边缘衔接在硝酸纤维素膜下边缘，用撕下来的贴纸的光滑面顺着一边压过胶带。

6)组装完成的大板进入切条工序。

S2、切条(相对湿度≤30％的洁净区)

接通裁条机电源，设定切条程序，设定切割宽度为3.05mm；将大板头尾相接，慢慢放上裁膜机上。将大卡平放入裁膜机平台轨道中，正面朝上，调节裁条机平台上的螺丝，调节卡槽宽度与大板宽度相同，开始切条；试纸条各组份应完整无破损，无脱落，即得试纸条。

实施例2

一种检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的检测卡的制备方法：将实施例1制备得到的试纸条装卡(相对湿度≤30％的洁净区洁净区)即将试纸条分别装至卡壳，盖好上盖，检测卡组装完成后，经检验合格后，即得检测卡。

实施例3

一种检测早孕的试剂盒，所述试剂盒包括实施例2制备得到的检测卡、小漏斗和样品稀释液即0.9％生理盐水。

实施例4

利用实施例3的试剂盒的检测方法：

1.样本采集

测试前10分钟应当保持口腔清洁，限制饮食(包括饮品、咖啡、食物等)、吸烟或是口腔喷剂等。

打开样本处理管管盖，将配套的唾液漏斗置于管口，将口腔中的唾液(舌苔抵住上颚，容易分泌唾液)吐入唾液漏斗中，观察样本处理管中液面，唾液体积应尽可能与样本稀释液一致。

2.样本处理

取下唾液漏斗，盖上样本处理管管盖，捏管身、上下颠倒混匀至少10秒，让样本尽可能混合均匀。

3.检测

沿包装铝袋切口部分撕开，取出检测卡平放于桌上，加入处理好的样本3滴到检测卡的加样孔中。开始计时，请在5～10分钟内判断结果，15分钟后的结果无效。

4.检验结果的解释

(1)阳性(怀孕)：二条红色反应线，即检测区(T)及对照区(C)各出现一条红色反应线，若检测区(T)颜色很弱时表示可能刚怀孕，请隔天重新检测。

(2)阴性(未怀孕)：一条红色反应线，即仅在对照区(C)出现一条红色反应线。

(3)无效：对照区(C)无红色反应线出现，表示测试错误或无效。

实施例5

检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条的灵敏度测试

将人绒毛膜促性腺激素(HCG)国家标准品配置为4种浓度：2.5mIU/mL，5mIU/mL，10mIU/mL，20mIU/mL。利用实施例4的检测方法检测上述四个浓度的HCG，重复测试10次，结果如表1所示。

表1试纸条的灵敏度测试结果

表1中的“+”表示检出，“-”表示未检出。

表1结果显示，5～20mIU/mL浓度的检出率为100％，2.5mIU/mL的检出率为70％。因此，本产品灵敏度高，检出限为5mIU/mL。

对比例1

本对比例与实施例2的区别在于，本对比例在配制样品垫处理液时不添加3g二硫苏糖醇，其余步骤与实施例2相同。

对比例2

本对比例与实施例2的区别在于，本对比例在配制样品垫处理液时不添加1.2g L-半胱氨酸，其余步骤与实施例2相同。

对比例3

本对比例与实施例2的区别在于，本对比例在配制样品垫处理液时不添加3g二硫苏糖醇和1.2g L-半胱氨酸，其余步骤与实施例2相同。

实施例6

检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条的特异性测试

实施例2、对比例1～3制备得到的检测卡参照实施例4的检测方法进行同一份唾液样本的测试，结果见图2和表2所示。

表2消除非特异性反应测试结果

注：“+++”表示明显可见，“++”表示可见，“+”表示微弱可见，“-”表示不可见。

结果如图2和表2所示，L-半胱氨酸、二硫苏糖醇单独使用时唾液样本粘稠带来的特异性问题都有所好转，但都未达到完全消除非特异性反应的目的，且试纸检测区域背景较红、微球残留明显等问题。而L-半胱氨酸和二硫苏糖醇两种试剂搭配使用效果满意，从图2对比可看出L-半胱氨酸和二硫苏糖醇两种试剂联合使用完全消除了非特异性反应，且背景对比明显干净。

进一步地，将实施例2、对比例1～3制备得到的检测卡常温保存182天参照实施例4的检测方法进行同一份唾液样本的测试，结果见图3和表3所示。

表3常温保存182天后测试

注：“+++”表示明显可见，“++”表示可见，“+”表示微弱可见，“-”表示不可见。

从图2和表3可以看出，L-半胱氨酸、二硫苏糖醇单独使用时消除特异性反应的效果降低，而联合使用则依然能起到完全消除特异性反应的作用。

此外，将实施例2、对比例3制备得到的检测卡参照实施例4的检测方法进行120例阴性唾液样本的测试，结果见表4。

表4不同检测卡对120例阴性唾液样本测试结果

从表4可看出，本发明试纸条的样品垫处理方式可有效消除非特异性反应，且阴性符合率很好。

实施例7

检测唾液中人绒毛膜促性腺激素的试纸条的真实样本测试

采集20名未妊娠及8名诊断为妊娠的女性唾液，利用实施例2的检测卡，参照实施例4的检测方法进行唾液样本的测试，定时5min并观察检测卡层析结果。

图4和图5的测试结果表明：20名未妊娠女性的唾液样本检测卡检测为阴性，8名妊娠女性唾液样本检测卡检测为阳性，5min后层析背景干净，线条清晰，层析过程流畅，因此，本发明的试纸条检测准确性高，准确率达100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。