一株贝莱斯芽孢杆菌、发酵物、菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌、发酵物、菌剂及其应用。

背景技术

黄精为百合科，黄精属植物，按形状不同，习称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效。黄精是中国重要的中药材，但在生产过程中极易受到多种病原菌的侵染，严重影响了黄精的产量和品质。通过对雪峰山黄精种植基地的调查和采集，发现了一种大规模发生的叶部病害——黄精叶斑病，前期研究已证明该病害病原菌为拟盘多毛孢属真菌，该病害发病时由基部开始，叶片出现褐色斑点，随着褪色面积扩大，病斑也逐渐扩大，出现椭圆形或不规则的病斑。病斑中间为淡白色，边缘为褐色，和未发病组织的接触地还有黄晕，在病情严重时，多个病斑结合导致叶片枯死，最终导致全株叶片枯萎脱落。

黄精作为中药材，如果采用化学杀菌剂防控该病害，其缺点是不可忽视的。长期的使用化学防治手段不仅会使化学药剂残留在黄精中，还会使病原菌产生抗药性并且对环境造成不可逆的污染。

因此，急需一种无污染的生物防治方法有效防治该黄精叶部病害。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌、发酵物、菌剂及其应用，本发明的贝莱斯芽孢杆菌LHN1可有效防治由拟盘多毛孢属真菌引起的黄精叶斑病。

本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LHN1，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO：63550。

本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌发酵物，由上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1经发酵培养得到或经发酵培养、提取得到。

优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵物包括贝莱斯芽孢杆菌LHN1的胞外产物。

本发明还提供了一种菌剂，包括上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1和/或上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵物。

优选的，所述菌剂中贝莱斯芽孢杆菌LHN1的有效活菌数为1×10

本发明还提供了一种上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1或者所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵物或者所述的菌剂在防治黄精叶斑病中的应用。

本发明还提供了一种上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1或者所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵物或者所述的菌剂在抑制拟盘多毛孢属真菌中的应用。

本发明还提供了一种防治黄精叶斑病的方法，包括以下步骤：

对黄精施用上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1或者所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵物或者所述的菌剂。

优选的，所述施用的时期为黄精出苗期。

优选的，所述施用的次数为2～3次，相邻两次施用的时间间隔为2～5d。

本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LHN1，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO：63550。本发明的贝莱斯芽孢杆菌能够有效抑制拟盘多毛孢属真菌，抑制率高达93.75％，发酵3d得到的贝莱斯芽孢杆菌发酵物对拟盘多毛孢属真菌的抑制率高达100％。本发明的贝莱斯芽孢杆菌LHN1可用于防治由拟盘多毛孢属真菌引起的黄精叶斑病，为黄精叶斑病的防治提供了一种无毒无害的生物防治渠道，具有极高的研究价值。本发明的贝莱斯芽孢杆菌LHN1还可用于防治由拟盘多毛孢属真菌引起的多种植物病害，有助于减少化学药剂的使用，减少药剂的残留，保证植物的生长品质，营造健康的环境。

附图说明

图1为不同生防菌对黄精叶斑病病原菌的抑制作用效果图，其中，上图为不同生防菌和黄精叶斑病病原菌菌饼培养后的菌丝生长情况，下图为不同生防菌对病原菌抑制率；

图2为贝莱斯芽孢杆菌LHN1在LB固体培养基上的菌落形态图；

图3为贝莱斯芽孢杆菌LHN1在油镜下的显微形态图；

图4为贝莱斯芽孢杆菌LHN1的发育树结果；

图5为贝莱斯芽孢杆菌LHN1不同发酵天数得到的发酵液对黄精叶斑病菌丝生长的抑制效果图；

图6为贝莱斯芽孢杆菌LHN1对黄精叶斑病的防治效果图，其中，A为在叶片上喷施贝莱斯芽孢杆菌LHN1菌液，B为喷施无菌水；

图7为贝莱斯芽孢杆菌LHN1对大田黄精叶斑病的防治效果图，其中左图为处理组，右图为对照组。

生物保藏说明

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LHN1，于2023年06月09日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCCNO：63550。

具体实施方式

本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LHN1，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO：63550。

在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌LHN1分离自健康黄精。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌LHN1通过以下方法分离得到：先采用稀释涂布平板法从健康黄精植株中分离得到菌株，再用平板划线法，在LB固体培养基上划线分离得到单菌落，然后放置在37℃的生化培养箱中培养1d，挑取具有明显特征的菌落命名为LHN1。采用16srDNA基因测序和gyrB基因测序进行分子生物学鉴定，从16s rDNA基因和gyrB基因的系统进化树看出LHN1和贝莱斯芽孢杆菌的同源性高达100％。经16s rRNA基因和gyrB基因的分子鉴定，将LHN1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LHN1。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌LHN1具有如下生物学特性：革兰氏阳性菌，菌体为杆状，菌体长约1.5～2.1μm，宽约0.6～0.8μm。在LB培养基上贝莱斯芽孢杆菌LHN1的菌落形态偏圆形，不透明，淡黄色；培养初期菌落表面光滑，边缘齐整，无色素产生，培养2d后，菌落表面有褶皱，边缘稍显不齐，中间微微凸起，四周扩散生长。

在本发明中，所述LB固体培养基优选含有以下组分：每1000mL蒸馏水中，含有胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g和琼脂18g；所述LB固体培养基的pH优选为7.5。

在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌LHN1的16s rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，具体为：

AGAGTTTGATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGG GAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTTGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAATCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT。

在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌LHN1的gyrB基因序列如SEQ ID No.2所示，具体为：

GAAGTCATCATGACCGTTCTGCACGCGGGCGGTAAGTTCGACGGAAG CGGATATAAAGTATCCGGCGGTCTTCACGGTGTAGGGGCGTCTGTCGTAAACGCCTTGTCGACCACTCTTGACGTTACGGTTCATCGTGACGGAAAAATCCACTATCAGGCGTACGAGCGCGGTGTACCTGTGGCCGATCTTGAAGTGATCGGTGATACTGATAAGACCGGAACGATTACGCACTTCGTTCCGGATCCGGAAATTTTCAAAGAAACAACCGAATACGACTATGACCTGCTTTCAAACCGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACAAAAGGTGTAAACATCACGATTGAAGACAAACGTGAAGGACAAGAACGGAAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTATGTTGAGTACTTAAACCGTTCCAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATATCGAAGGCGAGAAAGACGGCATAACGGTTGAAGTTGCATTGCAATACAACGACAGCTATACAAGCAATATTTATTCTTTCACAAATAATATCAACACATACGAAGGCGGCACGCACGAAGCCGGATTTAAAACCGGTCTGACCCGTGTTATAAACGACTATGCAAGAAGAAAAGGGATTTTCAAAGAAAATGATCCGAATTTAAGCGGGGATGATGTGAGGGAAGGGCTGACTGCCATTATTTCAATTAAGCACCCTGATCCGCAATTCGAAGGGCAGACGAAAACGAAGCTCGGCAACTCCGAAGCGAGAACGATCACTGATACGCTGTTTTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTTCTTGAAAATCCGGACTCAGCCCGCAAAATCGTTGAAAAAGGTTTAATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGCAGCGAAAAAAGCGCGGGAATTGACCCGCCGCAAAAGTGCGCTTGAGATTTCCAATCTGCCGGGCAAACTGGCGGACTGTTCTTCTAAAGATCCGAGCATTTCCGAGCTGTATATCGTAGAGGGTGACTCTGCGGGCGGATCAGCGAAACAGGGACGGGACCGTCATTTCCAAGCCATTCTGCCGCTGCGCGGTAAGATTCTGAACGTTGAGAAAGCCAGACTTGATAAGATTCTCTCAAACAATGAGGTCAGATCAATGATCACGGCCCTCGGAACATGAATCGGAGAAGATTTTAATCTTGAAAAAGCGCGTTATCATAAAGTGGTCATCATGACGGATGCGGACGTAGATGGCTCGCACATCCGTATCCTGCT。

本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌发酵物，由上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1经发酵培养得到或经发酵培养、提取得到。

在本发明中，所述发酵培养优选包括以下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌LHN1接种于LB液体培养基，进行培养，得到贝莱斯芽孢杆菌粗发酵物。在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌LHN1优选的以菌液的形式接种；所述贝莱斯芽孢杆菌LHN1菌液的OD600值为1.373；所述LB液体培养基和贝莱斯芽孢杆菌LHN1菌液的体积比优选为20：1；在本发明中，所述培养的温度优选为35℃～40℃，进一步优选为37℃；所述培养优选为摇床培养；所述培养的转速优选为150～200rpm，进一步优选为200rpm；所述培养的时间优选为3～9d。

在本发明中，所述LB液体培养基以蒸馏水为溶剂，每1000mL中含有胰蛋白胨10g、酵母膏5g和氯化钠10g。

在本发明中，所述提取优选包括以下步骤：将发酵培养得到的贝莱斯芽孢杆菌粗发酵物进行离心，对离心后的上清液进行过滤，收集滤液，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵物。在本发明中，所述离心的转速优选为9000～12000rpm，进一步优选为10000rpm；所述离心的时间优选为8～15min，进一步优选为10min。在本发明中，所述过滤优选使用0.22μm的细菌过滤器进行过滤。

在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵物优选包括贝莱斯芽孢杆菌LHN1的胞外产物。

本发明还提供了一种菌剂，包括上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1和/或上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵物。

在本发明中，所述菌剂中贝莱斯芽孢杆菌LHN1的有效活菌数优选为1×10

本发明还提供了一种上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1或者所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵物或者所述的菌剂在防治黄精叶斑病中的应用。

在本发明中，所述黄精叶斑病的病原菌优选为拟盘多毛孢属真菌。

本发明还提供了一种上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1或者所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵物或者所述的菌剂在抑制拟盘多毛孢属真菌中的应用。

本发明还提供了一种防治黄精叶斑病的方法，包括以下步骤：

对黄精施用上述方案所述的贝莱斯芽孢杆菌LHN1或者所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵物或者所述的菌剂。

在本发明中，所述使用的时期优选为黄精出苗期；所述施用的次数优选为2～3次，相邻两次施用的时间间隔优选为2～5d；每次的施用量优选为0.5～1L/m

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

在本发明的实施例中，所述LB固体培养基含有胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、琼脂18g和蒸馏水1000mL；所述LB固体培养基的pH为7.5；所述LB液体培养基中含有胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g和蒸馏水1000mL；所述PDA培养基含有土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g和蒸馏水1000mL。实施例1、黄精叶斑病生防菌的筛选

1、试验方法

采用稀释涂布平板法从黄精病株叶片上分离出具有明显形态特征差异的黄精叶斑病病原菌，经鉴定为拟盘多毛孢属真菌，命名为HJ1。

采用稀释涂布平板法从健康黄精植株根际土壤及健康黄精内分离出5株具有明显形态特征差异且具有一定抑菌效果的生防菌，分别为：LHN1、LHN2、LHN8、LHN16、LHN29；再用平板划线法，在LB固体培养基上划线分离得到5个单菌落。将5个单菌落分别放置在37℃的生化培养箱中培养1d，挑选具有明显特征的单菌落进行纯化扩增后，4℃冰箱保存。

取LHN1、LHN2、LHN8、LHN16、LHN29生防菌进行活化，得到5种生防菌菌液；将黄精叶斑病病原菌拟盘多毛孢属真菌HJ1进行活化，并在PDA培养基上培养3d，用无菌打孔器取直径为6mm的菌饼，得到黄精叶斑病菌饼。采用两点对峙法将病原菌菌饼和生防菌菌液分别放在平板两侧，所述生防菌菌液的体积为20μL，对照组在滤纸片上滴加20μL无菌水，每组三个重复。3d后采用十字交叉法测量菌丝半径，计算抑制率。

2、试验结果

结果如图1所示，图1中上图为不同生防菌和黄精叶斑病病原菌菌饼培养后的菌丝生长情况，下图为不同生防菌对病原菌抑制率。通过测量抑菌圈直径得知菌株LHN1的抑制效果最好，其抑制率高达93.75％；其次，LHN2和LHT29的抑制率分别达到88.75％和78.13％；LHT8与LHT16效果稍差，抑制率分别是31.25％和33.75％。因此，选用菌株LHN1作为防治黄精叶斑病的生防菌。

实施例2、菌株LHN1的鉴定

一、菌株LHN1的鉴定

1、形态学鉴定

将采用平板划线法得到的菌株LHN1单菌落在37℃的生化培养箱中培养1d，观察菌落形态。

革兰氏染色：将菌株LHN1划线接种在LB固体培养基上，37℃培养24h。然后经涂菌、干燥、固定、初染、水洗、媒染、脱色、复染、水洗、干燥步骤，于油镜下进行镜检。其中，初染的步骤为：于制片上滴加结晶紫染料，染1min后，用水洗去剩余染料；媒染的步骤为：滴加卢戈氏碘液，1min后水洗；脱色的步骤为：滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止；复染的步骤为：滴加复红液染1min；干燥的步骤为：用滤纸吸干。

菌株LHN1的菌落形态如图2所示，显微形态如图3所示。其中，菌株LHN1在LB培养基上的菌落形态偏圆形，不透明，淡黄色；培养初期菌落表面光滑，边缘齐整，无色素产生，培养2d后，菌落表面有褶皱，边缘稍显不齐，中间微微凸起，四周扩散生长。在油镜下观察到，菌株LHN1为革兰氏阳性菌，菌体形状为杆状，菌体长约1.5～2.1μm，宽约0.6～0.8μm。

2、生理生化鉴定

将菌株LHN1，参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》和《微生物学实验》中的方法，以及Biolog微生物鉴定系统标准规程A，利用Biolog微生物鉴定系统GenIII微孔板对该菌株进行生理生化特性测定。

生理生化特性测定结果如表1所示，结果表明，菌株LHN1为需氧型细菌，能够利用水苏糖、蔗糖、D-麦芽糖、D-果糖、α-D-乳糖、龙胆二糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、D-纤维二糖、D-海藻糖等多种糖类；对丙酸、糖质酸、D-苹果酸、明胶、果胶、吐温40、乙酰乙酸、粘酸等反应为阴性；同样菌株LHN1可以利用L-组氨酸、L-谷氨酸、D-天冬氨酸、L-天冬氨酸等；对接触酶、氧化酶等反应为阳性。这表明菌株的代谢能力较强，接种到土壤中会有较强的适应力和竞争力。

表1菌株LHN1生理生化特征的测定结果

3、分子生物学鉴定

将活化好的菌株接种至LB液体培养基中，放置在恒温摇床中于温度37℃，转速200rpm下，培养12h，离心收集菌体；用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。所述细菌DNA提取试剂盒购自TIANGEN生化科技有限公司，采用细菌16s rDNA的通用引物16S-F/R及gyrb基因引物UP1/2进行PCR扩增。

其中，16SrDNA的通用引物16S-F/R分别为：

正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO.3)；

反向引物为1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO.4)。

gyrB基因的通用引物UP1/2分别为：

正向引物UP1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′(SEQ IDNo.5)；

反向引物为UP2r：5′-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′(SEQID No.6)。

PCR扩增的反应体系优选为：10xbuffer(含Mg

扩增条件优选为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。将扩增出来的条带进行胶回收及连接转化，将所得菌液送至公司进行测序，测序结果经过序列分析比对后用MEGA6.0软件构建系统进化树。

贝莱斯芽孢杆菌LHN1的16s rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示；

贝莱斯芽孢杆菌LHN1的gyrB基因序列如SEQ ID No.2所示。

发育树结果如图4所示，通过对菌株的形态、生理生化特性、16S rDNA测定和gyrB测定分析，确定菌株LHN1分属贝莱斯芽孢杆菌；发育树结果表明菌株LHN1基因序列与贝莱斯芽孢杆菌的同源相似性为100％。

实施例3、贝莱斯芽孢杆菌LHN1发酵物的抑菌效果测定

1、试验方法

1)制备贝莱斯芽孢杆菌LHN1发酵物

取3瓶装有20mL LB液体培养基的锥形瓶，分别加入1mL贝莱斯芽孢杆菌LHN1菌液，于转速200rpm，温度37℃下恒温摇床培养，分别在第3d、6d、9d、回收粗发酵液，分别于转速10000rpm下离心10min，取上清液，并用细菌过滤器进行过滤，得到发酵3d、6d、9d的贝莱斯芽孢杆菌LHN1发酵物。

2)制备贝莱斯芽孢杆菌LHN1发酵物培养基

将3份发酵物、无菌水分别和LB固体培养基按1:9的体积比混合摇匀倒平板，得到4组培养基，分别记作CK、3d、6d、9d。

3)制备黄精叶斑病菌饼

将黄精叶斑病菌拟盘多毛孢属真菌HJ1在PDA培养基上培养3d，用无菌打孔器取直径为6mm的菌饼，得到黄精叶斑病菌饼。

4)将黄精叶斑病菌饼分别接种到CK、3d、6d、9d这4组贝莱斯芽孢杆菌LHN1发酵物培养基中央，每组设置两个重复，5d后记录菌丝直径。

2、试验结果

贝莱斯芽孢杆菌LHN1发酵物的抑菌试验结果如图5所示，结果表明，第3d的发酵物就已达到完全抑制的效果，且3d、6d、9d发酵液的抑制率均达到100％。

实施例4、贝莱斯芽孢杆菌对黄精叶斑病的防效测定

1、试验方法

准备从病样中分离保存的黄精叶斑病病原菌拟盘多毛孢属真菌菌块；用75％酒精将健康黄精叶片进行表面消毒后用无菌水冲洗三遍，分别接种直径6mm的黄精叶斑病病原菌拟盘多毛孢属真菌菌块，处理组在接种后喷施1mL浓度为1.0×10

2、试验结果

结果如图6所示，图A为处理组，图B为对照组。结果表明，接种7d后黄精叶片表面均开始出现黄褐色病斑，形状为不规则椭圆形，经测量图A中病斑面积为1～3mm

实施例5、大田试验

1、试验方法

选取黄精同一天种植的黄精种植区两块，黄精种植区的面积为2m×10m。其中，处理组于黄精出苗期喷一次菌液，5d后再喷一次，每次的喷施量为10L，菌液浓度1.0×10

21天后对防治效果进行统计，具体采用五点取样法进行统计。计算公式如下所示：

发病率(％)＝病苗数/检查苗数×100％；

防治效果(％)＝(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率×100％。

2、试验结果

结果如图7所示，左图为使用菌液喷施的处理组，右图为使用无菌水喷施的对照组，结果表明，对照组的黄精发病率约50％，处理组的黄精发病率约10％。

结论：本发明的贝莱斯芽孢杆菌可有效防治黄精叶斑病，防治效果高达80％。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。