一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统及其应用

技术领域

本发明涉及水环境检测领域，更具体地涉及一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统及其应用。

背景技术

由于水资源问题日益严峻，由水媒病原体引起的肠道寄生虫感染和腹泻病已成为环境致病和死亡的主要原因。干净的水源是人们日常活动的必需品。鉴于许多水传播病原体的传染剂量很低，环境中即使只有一种细菌的存在也可能构成严重的健康风险。根据美国环境保护署(EPA)的规定，环境娱乐样品中的大肠杆菌(E.coli)和肠球菌(Enterococci)的浓度应分别小于1.26和0.35CFU/mL。这些严格的标准要求检测方法不仅要超灵敏，而且要定量和精确。

现有的细菌富集方法操作繁琐，富集率较低，且价格高昂，而对于细菌的检测往往采用培养的方法，它们需要几天才能获得结果，而且很难在物种水平上区分细菌。定量实时聚合酶链反应(PCR)可以将时间缩短到几个小时，但它需要昂贵的仪器，并且不适合绝对定量。基于微流体的单细胞检测被认为是有前途的分析方法，在这种情况下，每个细胞被封装成一个单独的液滴，可实现对细菌的单个检测。基于97％大肠杆菌存在β-葡萄糖苷酸酶，它可以催化荧光底物6-氯-4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸产生荧光物质6-氯-4-甲基伞形酮，在特定激发光波长下被观察到，从而实现直接计数。针对其他细菌也可以使用相对性的荧光底物，实现简单、快速的计数目的。基于上述依据，可以探索一种自动化、耗时短、效率高的水中细菌富集及检测装置，对于水环境的检测具有重大应用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统及其应用，从而解决现有技术中细菌富集方法操作繁琐，富集率较低，价格高昂、检测时间长的问题。

根据本发明的第一方面，提供一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统，包括：第一富集装置，其包括：样品瓶、第一处理液瓶、第一废液瓶、第一富集液瓶、第一富集芯片、以及泵，所述第一富集芯片包括：上层支架、下层支架、以及夹设于上层支架与下层支架之间的第一滤膜、第二滤膜，通过对电磁阀的控制，使样品液被泵入第一富集芯片中，杂质被第一滤膜过滤，大肠杆菌被截留在第二滤膜上，经过处理液反冲得到大肠杆菌被第一次富集的第一富集液；第二富集装置，其包括：第二处理液瓶、第二富集液瓶、第二废液瓶、电磁阀、第二富集芯片、以及泵，所述第二富集芯片包括：第一层芯片、第二层芯片、第三层芯片、以及夹设于第一层芯片与第二层芯片之间的第三滤膜、夹设于第二层芯片与第三层芯片之间的第四滤膜，通过对电磁阀的控制，使第一富集液被泵入第二富集芯片中，杂质被第三滤膜过滤，大肠杆菌被截留在第四滤膜上，经过处理液反冲得到大肠杆菌被第二次富集的第二富集液；以及液滴微流控装置，其包括：液滴微流控芯片、加热板、油相瓶、电磁阀以及泵，通过对电磁阀的控制，使第二富集液在油相的剪切力作用下生成油包水微液滴，大肠杆菌在微液滴内发生酶促反应产生荧光，通过光学显微镜拍照，即可实现对水源中大肠杆菌浓度的检测。

优选地，第一富集芯片中，上层支架上设有样本进口、第一富集液出口、以及连接二者的上层双螺旋流道，下层支架上设有废液进口、处理液进口、以及连接二者的下层双螺旋流道，所述上层、下层双螺旋流道之间通过第一滤膜、第二滤膜隔开，以分别实现杂质的过滤以及大肠杆菌的截留。

优选地，上层支架、下层支架采用环氧树脂材料制成。

优选地，第二富集芯片中，第一层芯片上设有第一富集液进口、废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口，以及中心孔，其中，废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口、中心孔自上而下依次贯穿该第一层、第二层、第三层芯片，第三滤膜和第四滤膜分别设置于相应的中心孔处。

优选地，第一层芯片上的第一富集液进口、废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口均通过电磁阀控制。

优选地，第一滤膜、第三滤膜的孔径为8～30μm，第二滤膜、第四滤膜的孔径为0.2～1μm。

优选地，第一富集装置可实现水样从100mL到5mL的富集，第二富集装置可实现水样从5mL到100μL的富集。

优选地，所述液滴微流控芯片上设有富集液进口、油相进口、富集液流道、油相流道、液滴观察区以及废液出口，富集液流道与油相流道在一个十字形结构处交汇以利于微液滴的形成，所述液滴观察区内部还设有支撑柱。

根据本发明的第二方面，提供一种所述水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统在水质检测中的应用。

本发明的关键发明点主要在于，首次将100mL-5mL富集、5mL-100μL富集、大肠杆菌包裹和检测三种功能集成一体化，基于大肠杆菌和其余杂质的大小设计了带有两种孔径的两层过滤膜的第一富集装置和第二富集装置，分别利用磁控系统及微流控芯片实现膜上大肠杆菌的高效截留以及反冲富集。继而将富集后的菌液通过液滴微流控系统分散成油包水的微小液滴；微液滴生成后平铺在芯片内部，经过42℃，30分钟的孵育，含有目标大肠杆菌的液滴内会反应生成大量荧光物质，在荧光激发下发出荧光，对其进行拍照统计计算，即可得出大肠杆菌浓度，因此本发明能实现现场快速高灵敏检测水中大肠杆菌的功能。根据本发明提供的一种集100mL-5mL浓缩、5mL-100μL浓缩、大肠杆菌包裹和检测于一体的系统，能够富集水中大肠杆菌，去除其他杂质的影响，并实现大肠杆菌的液滴内单包裹和荧光信号的检测。

与现有的水体中大肠杆菌富集装置相比，根据本发明提供的水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统有以下几个优势：

1)两次富集的双层膜富集效率高，不易堵塞，稳定性好；

2)通过两次富集使水样从100mL浓缩到100μL，浓缩倍数达到1000倍；

3)100μL富集液可以生成数万个大小均一的液滴，每个液滴包裹一个大肠杆菌，实现菌体的单个检测，大大提高了检测的灵敏度；

4)自动化程度高，成像检测前的所有操作可通过控制面板进行控制；

5)在不更换整体装置的前提下，通过改变荧光底物，可实现各种大肠杆菌的检测；

6)所有单元均可长期重复使用，系统更换和维护成本低。

附图说明

图1为根据本发明的一个优选实施例提供的一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统整体结构示意图；

图2为第一富集装置的结构示意图；

图3为第二富集装置的结构示意图；

图4为液滴微流控装置的结构示意图；

图5为液滴生成图；

图6为液滴内酶促反应荧光图；

其中，附图标记含义如下：

100：泵；101：第一处理液瓶；102：样品瓶；103：接口1；104：泵；105：第一富集液瓶；106：接口2；107：接口3；108：第一滤膜；109：泵；110：第二滤膜；111：接口4；112：接口5；113：清洗瓶1；114：清洗瓶2；115：第一废液瓶；116：泵；117：泵；119：第二处理液瓶；120：第二富集液瓶；121：第二废液瓶；122：电磁阀1；123：电磁阀2；124：电磁阀3；125：电磁阀4；126：第三滤膜；127：第四滤膜；128：第一富集液进口；129：处理液进口；130：第二富集液出口；131：废液出口；132：泵；134：油瓶；140：第一富集芯片；141：上层支架；142：下层支架；150：第二富集芯片；151：第一层芯片；152：第二层芯片；153：第三层芯片；160：液滴微流控芯片。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段为本领域常规操作，或按照仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

如图1所示，是根据本发明的一个优选实施例提供的一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统，主要包括：第一富集装置、第二富集装置、以及液滴微流控装置。其中，第一富集装置用于实现水样从100mL到5mL的富集，第二富集装置用于实现水样从5mL到100μL的富集，液滴微流控装置用于实现大肠杆菌的液滴内单包裹和荧光信号的检测。

结合图1、图2所示，第一富集装置即100mL-5mL富集系统，其包括：样品瓶102、第一处理液瓶101、第一富集液瓶105、第一富集芯片140、清洗瓶113,114、第一废液瓶115，以及泵100,102,109，所述第一富集芯片140包括：上层支架141、下层支架142、以及夹设于上层支架141与下层支架142之间的第一滤膜108、第二滤膜110。其中，上层支架141上设有样本进口、第一富集液出口、以及连接二者的上层双螺旋流道，下层支架142上设有废液进口、处理液进口、以及连接二者的下层双螺旋流道，上层、下层双螺旋流道之间通过第一滤膜108、第二滤膜110隔开，以分别实现杂质的过滤以及大肠杆菌的截留。

通过对电磁阀的控制，使样品液被泵入第一富集芯片140中，杂质被第一滤膜108过滤，大肠杆菌被截留在第二滤膜110上，经过处理液反冲得到大肠杆菌被第一次富集的第一富集液。其中两层滤膜的孔径大小不同，可以达到过滤水体中其他杂质，保留大肠杆菌在滤膜上的目的；通过反冲洗可将大肠杆菌冲洗到第一富集液瓶105中。

结合图1、图3所示，第二富集装置即5mL-100μL富集系统，其包括：第二处理液瓶119、第二富集液瓶120、第二废液瓶121、电磁阀122-125、第二富集芯片150、以及泵。第二富集芯片150包括：第一层芯片151、第二层芯片152、第三层芯片153、以及夹设于第一层芯片151与第二层芯片152之间的第三滤膜126、夹设于第二层芯片152与第三层芯片153之间的第四滤膜127。

其中，第一层芯片151由PDMS上层和有机玻璃下层组成，有机玻璃下层上有四个通道，分别是第一富集液进口128、处理液进口129、第二富集液出口130、废液出口131，其中第一富集液进口128的底部封闭，其余三个通道上下贯通；第二层芯片152由PDMS和PC板组成，外周四个孔分别对应第一层芯片的四个通道，中间的孔用于贯通第一层和第三层芯片；第三层芯片153由PDMS和有机玻璃组成，外周四个孔分别对应第一层芯片的四个通道，中间孔的用于贯通第一层和第二层芯片。其中8μm孔径的第三滤膜126夹设于第一层和第二层芯片中，0.2μm孔径的第四滤膜127夹设于第二层和第三层芯片中，第一层芯片上的通道开关由电磁阀122、123、124、125控制，便于废液的排出和第二富集液的收集。

结合图1、图4所示，液滴微流控系统由恒压泵源、液滴微流控芯片160以及加热板组成，泵源与芯片之间使用PVC管道连接，液滴微流控芯片160由PDMS层、PC层和有机玻璃层组成，PDMS层上分别设有富集液进口、油相进口、富集液流道、油相流道、液滴观察区以及废液出口，富集液流道与油相流道在一个十字形结构处交汇以利于微液滴的形成，所述液滴观察区内部还设有支撑柱。

根据上述优选实施例提供的水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统，其工作原理包括：在第一步富集过程中，按下控制面板的concentrate按钮，100mL样品溶液经过第一富集装置自动富集到5mL的第一富集液；在第二步富集过程中，泵将第一富集液泵入到第二富集装置中，通过电磁阀控制第二富集芯片的四个口的开关，大肠杆菌截留在0.2μm孔径的滤膜上，经过处理液反冲得到100μL的第二富集液，完成全部富集过程。两次富集能够去除水体中的背景杂质，将100mL溶液中的大肠杆菌富集在100μL溶液中。紧接着，泵源将加了反应底物的待检测菌液(即第二富集液)和油相以恒定速度泵入液滴微流控芯片，芯片上方两个孔分别连接检测液和油相，芯片内部设有检测液和油相的流道，可实现两种液体的交汇，在交汇处生成油包水液滴，大肠杆菌被包裹在液滴内，随后在热板上42℃加热30min完成酶促反应，并在荧光成像显微镜上拍摄，统计产生荧光的液滴数量，通过计算可以得到检测液的大肠杆菌浓度。

根据本发明的一个优选实施例，该水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测系统的使用方法包括如下步骤：

1.大肠杆菌一次富集：

将进样管插入到待测溶液中，打开控制面板，点击concentrate按钮，根据系统设定的程序，第一富集装置从样品瓶102中自动抽取100mL水样，开始第一步富集，5分钟后完成100mL到5mL的富集，得到第一富集液。

2.大肠杆菌二次富集：

打开电磁阀122、125，第一富集液经泵116注入第一富集液进口128，经过上层大孔径的第三滤膜126过滤杂质，下层小孔径的第四滤膜127截留大肠杆菌，多余水经废液出口131排向第二废液瓶121；关闭电磁阀122、125，打开电磁阀123、124，100μL处理液PBS经泵117注入处理液进口129，将膜上的大肠杆菌集中到缓冲液中，经过第二富集液出口130，输入到第二富集液瓶120，得到第二富集液，实现5mL-100μL的富集。

3.液滴包裹大肠杆菌：

打开泵132，待测液和油相分别从第二富集液瓶120和油瓶134同时被泵入液滴微流控芯片160，通过调节泵入的压力，富集液可被分散成直径100-200μm尺寸均一的油包水微液滴。

4.酶促反应及检测：

微液滴生成后平铺在芯片内部，置于42℃热板子上经过30分钟的孵育，含有目标大肠杆菌的液滴内会反应生成大量荧光物质，置于荧光显微镜下进行拍摄统计，经过计算即可得出大肠杆菌浓度。

5.系统的清洗：

点击控制面板的cleaning按钮，并分别在清洗瓶113、114中加入纯水和75％酒精，5分钟后完成富集系统的清洗；液滴微流控芯片160为一次性使用。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。