一种生物酶法制备肝素钠的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种生物酶法制备肝素钠的方法，通过现代酶解技术、生物技术分离手段，获得一类富肝素钠为主要成分的天然产物。

背景技术

肝素钠是抗凝血、抗血栓形成的药品，是防止深层静脉血栓形成的首选药物，临床60年的历史，没有一种药物可以完全替代它。随着深入研究发现，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌，我国是重要的肝素出口大国，以猪小肠粘膜为原料的肝素是我国重要的出口生化药物，占全球的90%以上。

肝素是由L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、葡萄糖胺组成的不同链长的多糖混合物，分子量在3000~30000Da之间，在肝素链中存在一种独特的无糖单位，与抗凝血酶的相互反应即通过它来传递。肝素中的某些化学化学修饰集团对其活性起到重要的作用，酸性条件下氮硫酸基容易被水解破环，碱性条件下，氮硫酸基较稳定。

目前肝素效价低、纯度低、收率低，传统工艺中用双氧水、高锰酸钾等强氧化剂去除糖蛋白过程中对肝素存在破环作用，产品存在毒副作用等问题。生物酶法提取肝素钠应运而生。目前工业上常用的提取肝素钠的酶为碱性蛋白酶，该酶可以将肝素-蛋白质中的蛋白质水解成小肽，从而使肝素分离出来，然后再用一定的方法除去蛋白质得到肝素钠。该方法因粗提物的纯度不高，导致肝素钠的效价较低；分离提取后需用高盐或有机溶剂沉淀，不符合现代绿色环保要求。

发明内容

针对传统工艺上经过酸碱、强氧化剂、阴离子交换树脂的吸附和解析手段，存在工艺路线复杂、产品易被破环、效价低，有毒副作用，阴离子树脂吸附后，需要高浓的盐水进行洗脱，存在时间周期长，废水盐度高等问题，本发明基于以上不足，采用生物酶法进行去除肝素分子结合的杂蛋白，并采用与肝素没有作用力的弱极性大孔吸附树脂及阳离子交换树脂的串联除杂工艺，及再酶解工艺，可实现肝素钠的效价达到200U/mg以上，且效价总收率在90%以上。

本发明提供的一种生物酶法制备肝素钠的方法，包括原料预处理、初步酶解、纯化、再酶解、超滤干燥步骤，具体步骤如下：

（1）原料预处理：将新鲜猪小肠粘液以破壁机打浆至呈糊状，加水稀释至固含在10~30%，调节pH值10~11，投入匀浆机，调节破碎压力1000~1500bar，破碎3-6遍，即为破碎液，优选破碎压力1300bar，破碎次数4次，固含在20%。

（2）初步酶解：将步骤（1）得到的破碎液依次经胃蛋白酶、核酸酶P1、风味蛋白酶酶解，得到酶解液；其中，胃蛋白酶和风味蛋白酶的加入量为活酶400-600U/g，具体地：

将步骤（1）的破碎液调节pH到1~2.5，加入体积分数0.1~2%的胃蛋白酶，维持2~4h，温度20~80℃，优选pH2.0，酶加入量1.5%，35℃维持2h；

将胃蛋白酶酶解液调节pH到pH4~6，加入体积分数0.1~2%的核酸酶P1，温度60~80℃，维持时间4~10h，优选pH5.0、温度50℃、酶解时间5h；

将核酸酶P1酶解液调节pH到pH6~8，加入体积分数0.1~2%的风味蛋白酶，温度30~40℃，维持时间4~10h，优选pH7.0、温度36℃、酶解时间10h。

（3）小分子肽的纯化及精制：将步骤（2）的酶解液采用膜技术粗分离后将微滤透过液进行色谱精制，色谱填料为阳离子交换树脂与大孔吸附树脂串联，收集色谱流出液；将色谱流出液再经过微滤膜除去沉淀杂质，得滤过液；

将步骤（2）得到的酶解液pH调为6.0~8.0，一方面保持肝素钠的活性，另一方面保持肝素钠的电中性；采用微滤膜过滤，进行粗分离，除去杂蛋白等大分子杂质，微滤膜为陶瓷膜，操作压力为0.1~0.3MPa，不断用水透析，直到肝素钠的回收率大于99%，优选操作压力是0.1MPa。。

将微滤透过液进行色谱精制，以1~10ml/g的树脂量先后经过阳离子交换树脂和大孔吸附树脂，以2~4倍的树脂床层体积量的纯水冲洗，收集色谱流出液。阳离子交换树脂和大孔吸附树脂串联，经过阳树脂+吸附树脂，去除杂离子、杂蛋白、色素等杂质后，因肝素分子是高富含电荷的阴离子，在所述的阳离子树脂、吸附树脂上不具有保留能力，经水冲洗后可实现100%回收；阳离子交换树脂，其用量为1~10ml/g湿树脂；优选地，所述阳离子交换树脂的吸附量为5 ml/g，为NH-1树脂，洗脱液为纯水。大孔吸附树脂，其用量为1~10 ml/g树脂；优选的为5ml/g树脂，为X-8树脂，洗脱液为纯水。

经色谱除杂后，将色谱流出液在经过微滤膜除去沉淀杂质，将色谱去杂液体搅拌2~4h，调节pH到2~3，经微滤膜，微滤膜孔径为50nm，膜压力为0.1-0.2M Pa，优选操作压力0.1MPa。

（4）再酶解：将步骤（3）的滤过液调节pH到碱性8~10，20~40℃，加入活酶400-600U/g碱性蛋白酶保温3~6h，进一步破环肝素分子连接的杂蛋白；优选pH9.0、37℃，酶解时间5h；

（5）超滤并干燥：将步骤（4）的酶解液调节pH到中性，经过5000~10000Da的超滤膜进行超滤除杂浓缩后，经喷雾干燥可得到肝素钠产品。

按上述方法提取精制的肝素钠产品为白色或淡黄色肝素钠粉末，依照国标要求进行检测，本发明所得到的肝素钠产品的效价大于200U/mg，产品的效价总收率大于90%。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：

肝素钠在小肠粘液中以糖蛋白的形式存在，本发明采用多酶分布组合的方式，在保证肝素钠稳定的前提下去除杂蛋白，优于传统工艺的强氧化剂、强酸、强碱处理。区别于传统工艺采用阴离子交换树脂进行肝素的吸附及解析，本发明采用与肝素无作用力的吸附树脂和阳离子交换树脂，全称采用水作为洗脱，且经过阳离子交换树脂可以有效去除其他阳离子，确保肝素以肝素钠的形式存在。本发明的制备工艺简单易操作条件温和、稳定性高、节能环保。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为肝素钠产品。

图2为肝素钠红外图谱。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明具体实施例中所屠宰的生猪来自非疫区、经官方有效监控的规模化、 集约化饲养场、生猪在官方有效监控的屠宰场屠宰、并且经宰前、宰后检疫合格、制造肝素钠粗品的猪原肠具有官方签发的动物产品检疫合格证书。生猪在洁净车间屠宰后获得猪小肠，以竹签将小肠粘液刮取到容器里。

本发明具体实施例中所使用的胃蛋白酶、核酸酶P1、风味蛋白酶、碱性蛋白酶均购自南宁庞博生物工程有限公司。

酶解工艺：模拟人体消化吸收条件设置酶解过程，结合蛋白酶的酶切位点特性，阶段性添加蛋白酶中的一种或多种的组合，通过对肝素钠的效价高低作为回归分析，确立以胃蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、核酸酶P1的酶系为优组合，酶解顺序为胃蛋白酶、核酸酶P1、风味蛋白酶、碱性蛋白酶。

实施例1

（1）原料预处理：将新鲜猪小肠粘液，以破壁机打浆至呈糊状，测定总效价为30000u，加水稀释至固含在20%，pH值调节到11；

（2）将步骤1的混合均匀后投入匀浆机，调节破碎压力1300bar，破碎4遍；

（3）将步骤2的破碎液调节pH到2，加入体积分数1%的胃蛋白酶，维持3h，温度35℃；

（4）将步骤3的酶解液调节pH到pH 5，加入体积分数1%的核酸酶P1，温度70℃，维持时间5h；

（5）将步骤4的酶解液调节pH到pH7，加入体积分数1%的风味蛋白酶，温度37℃，维持时间10h；

（6）将酶解液采用微滤膜过滤，操作压力为0.15Mpa,不断用水透析，直到肝素钠的回收率大于99%；

（7）将微滤透过液以8ml/g的树脂量先后经过阳离子交换树脂和大孔吸附树脂，以2倍的树脂床层体积量的纯水冲洗，获得肝素钠的去杂液；

（8）将色谱去杂液体搅拌2h，调节pH到3，经微滤膜，微滤膜孔径为50nm，膜压力为0.15MPa；

（9）调节pH到碱性9，37℃，加入体积分数1%的碱性蛋白酶保温6h；

（10）干燥：将酶解液调节pH到中性7.0，经过5000Da的超滤膜进行超滤除杂浓缩后，经喷雾干燥得到白色或类白色肝素钠粉末。

肝素钠活性检测：依照国标要求进行检测，肝素钠产品的效价210U/mg，产品的效价总收率92%。

实施例2

（1）原料预处理：将新鲜猪小肠粘液，以破壁机打浆至呈糊状，测定总效价为30000u，加水稀释至固含在30%，pH值调节到11；

（2）将步骤1的混合液均匀后投入匀浆机，调节破碎压力1500，破碎6遍；

（3）将步骤2的破碎液调节pH到2.5，加入体积分数0.3%的胃蛋白酶，维持2h，温度37℃；

（4）将步骤3的酶解液调节pH到pH6，加入加入体积分数0.3%核酸酶P1，温度65℃，维持时间4h；

（5）将步骤4的酶解液调节pH到pH8，加入加入体积分数0.3%风味蛋白酶，温度38℃，维持时间8h；

（6）将酶解液采用微滤膜过滤，操作压力为0.10Mpa,不断用水透析，直到肝素钠的回收率大于99%；

（7） 将微滤透过液以6ml/g的树脂量先后经过阳离子交换树脂和大孔吸附树脂，以3倍的树脂床层体积量的纯水冲洗，获得肝素钠的去杂液；

（8）将色谱去杂液体搅拌3h，调节pH到2.7，经微滤膜，微滤膜孔径为50nm，膜压力为0.10MPa；

（9）调节pH到碱性10，35℃，加入加入体积分数0.3%碱性蛋白酶保温5h；

（10）干燥：将酶解液调节pH到中性7.0，经过5000Da的超滤膜进行超滤除杂浓缩后，经喷雾干燥可得到肝素钠产品。

肝素钠活性检测：依照国标要求进行检测，肝素钠产品的效价200U/mg，产品的效价总收率90.3%。

实施例3

（1）原料预处理：将新鲜猪小肠粘液，以破壁机打浆至呈糊状，测定总效价为30000u，加水稀释至固含在10%，pH值调节到11；

（2）将步骤1的混合液均匀后投入匀浆机，调节破碎压力1500bar，破碎6遍，固含在10%；

（3）将步骤2的破碎液调节pH到2.5，加入体积分数2%的胃蛋白酶，维持3h，温度37℃；

（4）将步骤3的酶解液调节pH到pH4.5，加入体积分数2%的核酸酶P1，温度75℃，维持时间3h；

（5）将步骤4的酶解液调节pH到pH7.5，加入体积分数2%的风味蛋白酶，温度36℃，维持时间7h；

（6）将酶解液采用微滤膜过滤，操作压力为0.10MPa,不断用水透析，直到肝素钠的回收率大于99%；

（7）将微滤透过液以1ml/g的树脂量先后经过阳离子交换树脂和大孔吸附树脂，以3倍的树脂床层体积量的纯水冲洗，获得肝素钠的去杂液；

（8）将色谱去杂液体搅拌4h，调节pH到2.5，经微滤膜，微滤膜孔径为50nm，膜压力为0.10MPa；

（9）调节pH到碱性9.2，37℃，加入体积分数2%的碱性蛋白酶保温6h；

（10）干燥：将酶解液调节pH到中性7.0，经过10000Da的超滤膜进行超滤除杂浓缩后，经喷雾干燥可得到肝素钠产品。

肝素钠活性检测：依照国标要求进行检测，肝素钠产品的效价230U/mg，产品的总收率93.4%。

对比例1

本对比例与实施例1的区别是初步酶解中不经过风味酶处理。所得肝素钠活性检测：依照国标要求进行检测，产品的效价60U/mg，总收率60.3%。该对比例不经过风味酶处理，所以肝素钠产品的效价较低。

对比例2

本对比例与实施例1的区别是色谱精制中仅经过阳离子树脂，而不使用大孔树脂。所得肝素钠依照国标要求进行检测，产品的效价80U/mg，总收率73.4%。该对比例仅经过阳树脂，所以肝素钠产品的纯度降低，效价降低。

本发明提供的肝素钠的制备方法及思路，应当指出，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。