体外循环再灌注损伤细胞模型及其建立方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种体外循环再灌注损伤细胞模型及其建立方法与应用。

背景技术

体外循环(Cardiopulmonary bypass，简称CPB)是心脏手术中使用的一种关键技术，可暂时绕过心脏和肺部，使外科医生能够在一个静止且无血液的区域进行手术。虽然CPB是一种挽救生命的过程，但它与各种并发症，包括再灌注损伤有关

内皮细胞位于血管内表面，对血管内稳态起着关键作用。CPB所致的缺血再灌注损伤可能导致产生活性氧自由基(ROS)、炎症以及激活细胞内信号通路，从而导致内皮功能紊乱，从而进一步加重心脏的炎症和水肿导致心衰等严重后果

鉴于此，我们利用CPB患者的血浆结合原代心脏内皮细胞建立了一种CPB再灌注损伤的细胞模型。

参考文献：

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发明内容

为了克服上述现有背景技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种体外循环再灌注损伤细胞模型及其建立方法与应用。本发明利用患者血清干预原代内皮细胞建立了体外循环再灌注损伤模型，具有简单易行的特点，可用于CPB再灌注损伤机制的研究和靶点药物的开发。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种体外循环再灌注损伤细胞模型的建立方法，包括：

S1、建立原代心脏内皮细胞模型；

S2、利用CPB术后的血浆干预步骤S1建立的原代心脏内皮细胞模型，得到体外循环再灌注损伤细胞模型。

优选地，步骤S1中，利用磁珠法分离小鼠心脏内皮细胞，获得原代心脏内皮细胞模型。

优选地，步骤S2中，需取用CPB术后24小时的血浆。

优选地，步骤S2中，干预时间为24小时。

一种体外循环再灌注损伤细胞模型，由所述的体外循环再灌注损伤细胞模型的建立方法制备而得。

一种体外循环再灌注损伤细胞模型在制备治疗因CPB导致的内皮损伤药物方面的应用。

本发明取得的有益效果如下：

本发明利用患者血清干预原代内皮细胞建立了体外循环再灌注损伤模型，具有简单易行、可重复性高的特点，可用于CPB再灌注损伤机制的研究和靶点药物的开发。

附图说明

图1为小鼠原代心脏内皮细胞图；

图2为利用WB检测细胞模型的炎症因子水平图；

图3为原代心脏内皮细胞模型图(干预前)；

图4为原代心脏内皮细胞模型图(干预后)；

图5为利用ECIS检测细胞损伤模型的通透性图。

具体实施方式

以下结合附图、实施例和实验例对本发明作进一步的详细描述。当然，本发明的保护范围并不限于下述实施例。本领域专业技术人员能够理解，在不背离本发明精神的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但本发明仍然在此作尽可能详细的描述。以下实施例是进一步说明本发明，而不是限制本发明。任何依据本发明构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明技术方案的范畴。

下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员常理解的相同含义。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个环节，接下来结合附图介绍本发明的具体实施方式。

实施例1建立小鼠心脏内皮细胞模型

使用机械和酶解离，随后通过激活磁性细胞分选进行纯化。简单来说，先从6-8周大的小鼠体内取出心脏，然后用2mg/ml胶原酶(CatNo.LS004196；Worthington)进行消化。消化后，收集上清液并离心以收集沉淀物。然后，将沉淀物重悬于一种含有不含钙和镁的PBS溶液中(GIBCO)，加入牛血清白蛋白(BSA)(0.1％v/v，Sigma)和血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM1，CD31)包被的磁珠(CatNo.BDB553370；Fisher)。在磁分离器中分离细胞后，带有磁珠的细胞被接种在明胶包被的T25培养瓶中。当细胞达到密集并接近一层后，进行第二次分选，使用间细胞黏附分子2(ICAM2，CD102)包被的磁珠(CatNo.BDB553325；Fisher)，并采用与上述相同的方案。

实施例2建立CPB术后再灌注损伤的心脏内皮细胞模型

对实施例1建立的内皮细胞(如图1所示)加入10ul无菌收集的CPB术后24小时患者的血浆，得到CPB术后再灌注损伤的心脏内皮细胞模型。

实施例3利用ECIS、免疫荧光、WB、ELISA检测细胞模型的内皮通透性和炎症因子。

1、利用WB(图2)检测细胞模型的炎症因子水平证实CPB术后再灌注损伤的心脏内皮细胞的IL-6和TNF-α的水平显著升高(CTL代表正常的心脏内皮细胞，I/R代表CPB术后再灌注损伤的心脏内皮细胞)。

2、利用细胞免疫荧光检测实施例1和2中内皮细胞表面VE-Cadherin的水平，结果如图3和4所示，图3是正常内皮细胞边界的VE-Cadherin，其表达清晰，图4是CPB术后再灌注损伤的心脏内皮细胞边界的VE-Cadherin，其表达显著破坏。

3、利用免疫荧光检测内皮细胞边界的VE-Cadherin的水平：

3.1)细胞准备：将需要内皮细胞培养在涂有聚-L-赖氨酸(Poly-L-lysine)的载玻片上。

3.2)固定：用冷乙醇或甲醛等适当的固定剂固定内皮细胞，通常需要将样品在室温下固定15-30分钟。

3.3)渗透化：使用一种适当的洗涤缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲液))对样品进行洗涤，以去除固定剂，并使细胞渗透化，使用0.1％-0.5％ Triton X-100在PBS中进行渗透化，通常需要渗透化10分钟。

3.4)阻断非特异性结合：使用包含非特异性结合蛋白(牛血清蛋白(BSA))的缓冲液，对样品进行阻断处理，以减少非特异性结合。通常需要在室温下进行1小时的阻断。

3.5)一抗孵育：使用特异性的VE-cadherin抗体，将一抗加入样品中进行孵育。浓度为1:100，并在4℃下孵育过夜。

3.6)洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行多次洗涤，以去除未结合的一抗，通常使用PBS或TBST(含有适量的Tween 20的磷酸盐缓冲液)进行洗涤。

3.7)二抗孵育：使用与一抗宿主物种不同的二抗，将二抗加入样品中进行孵育。二抗为标记有荧光染料的抗体，用于与一抗结合形成复合物。二抗和一抗之间需要有宿主物种的特异性。二抗的浓度为1:200，并在室温下孵育1小时。

3.8)洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。

3.9)核染色：使用DNA染料4’,6-二胺-2’-苯基咪唑啉(DAPI)对细胞核进行染色，以显示细胞的核形态。

3.10)盖玻片：使用适当的防荧光淬灭封闭剂封盖玻片来保护样品，并准备进行显微镜观察。

3.11)显微镜观察：将封盖的玻片放置在荧光显微镜下，使用适当的光源和荧光滤光片来观察样品中VE-cadherin的免疫荧光信号。

4、利用ECIS检测细胞损伤模型的通透性：

为了进行阻抗测量，细胞被培养在8W10E+阵列上(Applied BioPhysics,Inc.,Troy,NY)。该阵列经过处理，先使用10mM L-半胱氨酸(cat#C7352-25G，Sigma-Aldrich)处理，然后在上面涂覆1μg/cm2的Ⅰ型胶原蛋白(cat#A1048301，Thermo Fisher Scientific)。为了对阵列上的金电极进行消毒和清洁，使用ECIS软件中的电气稳定化命令。内皮细胞以60,000个细胞/cm2的密度在500μL的L-DMEM生长培养基中移植到阵列上。使用多频率/时间(MFT)选项进行ECIS，记录在广泛频率范围内的阻抗测量数据。结果如图5所示，CPB术后再灌注损伤的心脏内皮细胞的电阻抗明显低于正常心脏内皮细胞，说明细胞损伤模型的内皮通透性显著升高，说明造模成功(CTL代表正常的心脏内皮细胞，I/R代表CPB术后再灌注损伤的心脏内皮细胞)。

以上内容描述了本发明的基本技术手段和基本原理。本发明的保护范围不受上面所举的3个实施例的限制。本专业的技术人员在没有做其他创新性工作前提下所获得的其他实施例均属于本发明的保护范围。