一种靶向AR-V7的具有约束的螺旋和片状结构的双订书肽的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及多肽药物领域，具体地说，是一种靶向AR-V7的具有约束的螺旋和片状结构的双订书肽的制备方法和应用。

背景技术

靶向蛋白降解(Targeted protein degradation，TPD)是近年来备受关注的一种新兴治疗策略。TPD试剂的开发涉及被称为“降解剂”或“蛋白水解靶向嵌合体”(PROTACs)的分子的设计和合成，其由两个功能部分组成:与靶蛋白结合的配体和与E3泛素连接酶结合的配体。E3连接酶负责催化泛素分子附着在靶蛋白上，导致其被蛋白酶体降解。目前，基于小分子的PROTAC药物开发领域已经取得了实质性进展，以ARV-110和ARV-471为代表的许多化合物已经进入临床试验阶段。然而，当涉及到不具有明确可识别的口袋结合转录因子(包括AR-V7)的靶标时，小分子PROTACs的进展缓慢，基于肽的PROTAC药物已成为一种有前途的替代解决方案。

然而，由于前几代多肽药物的血液稳定性差和细胞膜渗透能力有限等问题，其发展面临挑战。多肽药物的递送系统和化学修饰的最新进展开辟了其在PROTAC药物临床应用中的可能性。订书修饰肽作为一种增强多肽稳定性和提高其细胞穿透能力的策略备受关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向AR-V7的具有约束的螺旋和片状结构的双订书肽的制备方法和应用。

为了提高靶向AR-V7的肽类PROTAC药物的临床潜力，本发明采用双订书肽修饰策略，本发明的双订书肽修饰方法旨在在肽序列内产生稳定的α螺旋或β片结构，或两者兼有。这种结构稳定性增强了多肽与目标蛋白的结合亲和力。这些修饰已被证明能有效增强多肽药物的药代动力学和药效学特性，确实与线性肽相比，表现出显著改善的蛋白水解稳定性和增强的生物活性。从而为提高AR-V7的靶向多肽PROTAC药物的临床应用提供了巨大的潜力。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明设计了一种名为DSARTC的双订书肽药物，专门针对AR DNA结合域。研究结果揭示了DSARTC在降解AR和AR-v7以及抑制前列腺癌细胞增殖方面的巨大潜力。并且表明双订书修饰方法，可以成为开发肽PROTAC药物的可行策略。这些发现强调了在多肽中使用多个短链修饰的潜在益处，从而增强了多肽药物的可药性和治疗潜力。

本发明的第一方面，提供一种订书肽，所述的订书肽为：

以Ac-YLCSSNNNRERDKFRRTGGSGGTSFEQFWAWLWP-NH

进一步的，所述的订书肽的结构示意图如图1所示；其结构式如下所示：

本发明的第二方面，提供一种如上所述的订书肽的制备方法，包括以下步骤：

(A)在缩合试剂的作用下分别使C端首个氨基酸的COOH与固相载体氨基树脂偶联；

(B)使用脱保护试剂脱去氨基酸上的Fmoc保护基；

(C)在缩合试剂作用下连接下一个氨基酸；

(D)重复进行脱保护-耦合操作，按照从C端至N端的顺序，依照氨基酸序列合成肽链；其中，环合位点以S

(E)最后一个氨基酸脱保护后乙酰化；

(F)在环合试剂作用下使i和i+4位S

(G)使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得相应订书肽。

进一步地，步骤(A)中采用的缩合试剂为DIC-Oxyme缩合体系，以NMP为溶剂。

更进一步地，步骤(A)中氨基酸、Oxyme、DIC、NMP的比例为1:1:1:6(mol/mol/mol/ml)或1:0.9:0.9:6(mol/mol/mol/ml)。

进一步地，步骤(A)中固相合成时，树脂的载样量为0.30mmol/g。

进一步地，步骤(A)中偶联反应的温度为60℃；偶联反应的时间为20min。

进一步地，步骤(B)中，所述脱保护试剂为Oxyme、哌啶及DMF的混合溶液，比例为71:2:4(m/v/v)。

进一步地，步骤(B)中，脱Fmoc保护是采用保护试剂作用5min，两遍；脱除Fmoc基团的反应温度为20～30℃，更优选为25℃。

进一步地，S

进一步地，步骤(E)中，使用的乙酰化试剂为DIEA、DMF与醋酸酐的混合液，投料比为1:1:8(v/v/v)。

进一步地，步骤(E)所述乙酰化是采用树脂在乙酰化试剂中反应20min；反应温度为20～30℃，更优选为25℃。

进一步地，步骤(F)中所述环合试剂为GrubbsⅠ试剂的二氯乙烷的溶液，投料比为树脂量：GrubbsⅠ试剂：二氯乙烷＝0.3:58:6(mmol/mg/ml)。

进一步地，步骤(F)中所述环合是树脂在环合试剂中震荡两次，每次2h；反应温度为20～30℃，更优选为25℃。

进一步地，步骤(G)中，所述切割试剂为TIPS、TFA、H

进一步地，步骤(G)中，切割的温度为20～30℃，更优选为25℃；切割的时间为4h。

进一步地，步骤(G)采用的纯化方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ柱；流动相：流动相A为体积分数为0.1％TFA/水，流动相B为体积分数为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：35％B洗脱0～5min，35％B～55％B、5～60min；流速为5ml/min，进样量为1ml，检测波长214nm和254nm。

本发明的第三方面，提供一种如上所述的订书肽在制备抗前列腺癌药物中的应用。

本发明中涉及的缩略词解释如下：

Fmoc：芴甲氧羰基

DCM：二氯甲烷

DCE：二氯乙烷

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

Oxyme：Ethyl Cyanoglyoxylate-2-Oxime，2-肟氰乙酸乙酯

DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺

NMP：N-甲基吡咯烷酮

DIEA：N,N-二异丙基乙胺

S

TFA：三氟乙酸

TIPs：三异丙基硅烷

GrubbsⅠ：苯基亚甲基双(三环已基磷)二氯化钌

本发明优点在于：

1、本发明以氨基树脂为固相载体，以直连肽Ac-YLCSSNNNRERDKFRRTGGSGGTSFEQFWAWLWP-NH

2、本发明采用双订书肽修饰策略，旨在在多肽序列内产生稳定的α螺旋或β片结构，或两者兼有。这种结构稳定性增强了多肽与目标蛋白的结合亲和力。能有效增强多肽药物的药代动力学和药效学特性，确实与线性肽相比，表现出显著改善的蛋白水解稳定性和增强的生物活性。

3、本发明的双订书肽可以显著抑制前列腺癌细胞的生长繁殖，在治疗前列腺癌疾病方面具有潜在的应用价值。本发明突出了双订书肽PROTAC药物作为一种新的有前途的治疗方法的潜力，并为开发针对具有挑战性的疾病靶点的靶向治疗开辟了新的可能性。

附图说明

图1为本发明订书肽示意图。

图2为本发明订书肽的合成路线图。

图3为纯品订书肽的高效液相色谱图。

图4为纯品订书肽的质谱图。

图5为DSARTC对MDM2和AR DBD的亲和力检测。其中A为ITC法测定DSARTC与MDM2的结合；B为ITC法测定DSARTC与AR DBD的结合；C为FP法测定DSARTC与AR-DBD的结合；D为FP法测定DSARTC与MDM2的结合。

图6为DSARTC在诱导AR和AR-v7降解以及抑制前列腺癌细胞方面的潜力。其中A为不同浓度DSARTAC药物治疗后CWR22Rv1细胞系细胞活力的检测；B为不同浓度DSARTAC药物治疗后C4-2细胞系细胞活力的检测；C为不同浓度DSARTAC药物治疗后LNCaP细胞系细胞活力的检测；D为免疫印迹分析不同浓度DSARTAC药物治疗后CWR22Rv1细胞系中AR和AR-V7蛋白水平；E为免疫印迹分析不同浓度DSARTAC药物治疗后C4-2细胞系中AR和AR-V7蛋白水平；F为免疫印迹分析不同浓度DSARTAC药物治疗后LNCaP细胞系中AR和AR-V7蛋白水平；G为用不同浓度的DSARTAC药物治疗CWR22Rv1细胞系，免疫印迹分析卡非佐米存在下AR和AR-V7蛋白水平；H为用不同浓度的DSARTC药物治疗C4-2细胞系，免疫印迹分析卡非佐米存在下AR和AR-V7蛋白水平；I为用不同浓度的DSARTAC药物治疗LNCaP细胞系，免疫印迹分析卡非佐米存在下AR和AR-V7蛋白水平。

图7为DSARTC在前列腺癌细胞中诱导AR蛋白和MDM2蛋白结合的体内IP实验。

图8为动物水平DSARTC抑制肿瘤增长效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

以下实施例涉及的实验材料来源如下：

氨基酸、氨基树脂购自上海吉尔生化有限公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、Ethyl Cyanoglyoxylate-2-Oxime、三氟乙酸(TFA)、乙腈(色谱纯)购自北京百灵威科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙醚、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、哌啶、苯酚均为分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司。

实施例1：本发明双订书肽的制备

1、订书肽的合成

如图2所示：

(1)化合物1的制备

取氨基树脂370mg(载样量为0.30mmol·g

加20％哌啶-DMF溶液(0.1M Oxyme)至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。

(2)化合物2的制备

将序列中首个氨基酸(1mmol)、Oxyme(142mg，1mmol)和DIC(155.0μL，1mmol)混溶于6ml NMP中，加入到树脂中60℃下振荡20min(S

(3)化合物3的制备

重复(1)、(2)步骤的做法，根据多肽序列依次将Fmoc氨基酸(0.5mmol)、Oxyme(71mg)和DIC(75μl)混溶于6ml NMP，加入到树脂中，于60℃下振荡20min，重复脱保护→缩合→脱保护，直至所有氨基酸连接完成。最后一个氨基酸脱保护后，加入DIEA:乙酸酐:DMF(1:1:8)混合液10ml在25℃下震荡20min，依次用DCM、DMF、无水乙醚洗涤树脂各3次后，抽真空干燥树脂。

(4)化合物4的制备

待树脂完全干燥后，加入GrubbsⅠ(58mg)试剂的二氯乙烷溶液(6ml)，25℃下震荡反应两次，每次2h，反应完成后依次用DCM、DMF、无水乙醚洗涤树脂各3次，抽真空干燥树脂。

(5)目标化合物的制备

将树脂洗净抽干，加入TIPS、TFA、H

2、目标订书肽的纯化

将粗品肽用一定比例的乙腈和水溶解，通过制备型RP-HPLC纯化。

分离条件如下：

仪器：Pre-HPLC SD-1VARIAN高效液相色谱仪；

色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ(250×20mml.D，S-5μm，12nm)；

流动相：流动相A为体积分数为0.1％TFA的水溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液；

步骤与参数：25％B洗脱0～5min，25％B～45％B、5～60min；流速为30ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm和254nm。

实施例2：产物的鉴别与结构分析

将实施例1的步骤2所得产物通过HPLC进行鉴别以及HR-Q-TOF-MS(高分辨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)进行结构分析，色谱流动相为乙腈和水。流动相A为体积分数为0.1％TFA的水溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液，梯度洗脱(0～5min，流动相B：5％；5-30min，流动相B：5％～65％)；流速1.0mL·min

结果如图3、图4所示，订书肽纯度为96％，分子量为4166。

实施例3：DSARTC对MDM2和AR DBD的亲和力检测实验

为了确保双订书肽修饰不影响肽与AR DBD和MDM2的结合，本发明进行了结合实验。目的是评估与线性肽相比，订书修饰是否改变了肽的结合亲和力。采用等温滴定量热法(ITC)和荧光偏振法(FP)测定了DSARTC与AR DBD和MDM2的亲和常数。

实验步骤如下：

等温滴定量热法(ITC)：使用MicroCal VP-ITC微量热计在25℃定量蛋白与肽的相互作用。用含有0.1mM TCEP和0.01％NaN

荧光偏振法(FP)：首先我们将TAMRA-NHS通过共价键链接到订书肽N端氨基上，得到了一个以TAMRA为荧光基团的荧光标记肽。将溶解于DMSO中的不同浓度的荧光订书肽(25μL)加入到盛有50μL的MDM2或AR(50nM)的96孔板中，检测终体积为75μL，测量缓冲液为PBS(pH＝7.4)，96孔板为Corning-3993平底黑孔板。孵育半个小时后在Tecan M-1000多孔板酶标仪中测定偏振值(FP)读数，激发波长为530nM，发射波长为580nM。使用GraphPad Prism软件进行曲线拟合并计算Kd值。

如图5所示，结果表明DSARTC与AR DBD和MDM2均保持高结合亲和力，类似于线性肽。这些结果表明，双订书肽修饰对DSARTAC与其靶蛋白的结合作用没有显著影响。因此，订书修饰不会损害多肽与AR DBD和MDM2结合的能力，从而确保其靶向这些蛋白的持续功效。

实施例4：共免疫沉淀(Co-IP)实验

为了评估DSARTC在增强细胞内AR和MDM2结合方面的潜力，本发明进行了共免疫沉淀实验。

实验步骤如下：

1.细胞准备：培养并收集订书肽处理24h的C4-2细胞；使用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，确保细胞洗净。

2.细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液(含有0.1％ Triton X-100的RIPA缓冲液)，加入细胞，并充分悬浮细胞；在冰上孵育细胞裂解液3分钟，使细胞充分裂解；离心裂解液，以去除细胞碎片和细胞核，收集上清液。

3.抗体预处理：将AR抗体与蛋白A/G琼脂糖糖珠或蛋白A/G磁珠孵育，以制备抗体-琼脂糖糖珠复合物。

4.免疫沉淀：将抗体-琼脂糖糖珠复合物加入细胞裂解液中，孵育在4℃下，使抗体与目标蛋白及其相互作用的蛋白结合；使用旋转仪，在低温条件下孵育混合物，以促使免疫复合物的形成；将混合物在低温条件下离心，以沉淀抗体-蛋白复合物。

5.洗涤：将沉淀的复合物用含有洗涤缓冲液(如含有1％ Triton X-100的RIPA缓冲液)的PBS洗涤，以去除非特异性结合的蛋白；重复洗涤步骤2-3次，以确保洗涤彻底。

6.蛋白分析：取复合物样品，并进行Western blot分析AR以及MDM2蛋白。

如图6和图7结果表明，DSARTC有效地增加了内源性AR与MDM2之间的相互作用。表明DSARTC有能力将MDM2招募到AR，这可能导致AR和AR-V7的降解增加。

实施例5：DSARTC对于前列腺癌细胞抑制增殖以及对AR以及AR-V7降解检测

1.细胞培养方法为：CWR22Rv1，LNCaP，C4-2细胞株的培养条件均为1640培养基，10％胎牛血清，5％ CO

2.药物抑制癌细胞增殖能力实验

Cell Counting Kit-8检测方法分析药物抑制癌细胞增殖能力。Cell CountingKit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的化合物。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

在进行检测细胞活性的实验时，将CWR22Rv1，LNCaP和C4-2细胞以3x10

A＝OD

细胞活力(％)＝A(加药)-A(背景)/A(对照)-A(空白)x100。(公式II)

经过药物处理后，检测计算得到代表偶联了多肽药物对于肾癌细胞的抑制增殖作用。

3.为了研究DSARTC药物对AR的降解能力，采用免疫印迹(IB)分析AR以及AR-V7。其具体实验过程为：

1)将CWR22Rv1，LNCaP，C4-2细胞以3×10

2)通过BCA定量试剂盒对每组样品中含有的总蛋白量进行定量，并通过调整样品体积的方式使每组样品中的蛋白浓度一致。蛋白量调整之后，加入Loading Buffer，100度孵育10分钟以使蛋白完全变性。

3)将不同组的样品进行SDS-PAGE分离。配制12％的含有SDS的聚丙烯酰胺分离胶和5％的聚丙烯酰胺浓缩胶。然后将制备好的样品与同样体积的预染蛋白样品加入上样孔中，进行电泳分离实验。电泳条件为：电压设置为70v，分离约15min至溴酚蓝到达分离胶处。之后调整电压至120v，分离约60min至溴酚蓝到达分离胶末端约1cm处，停止电泳。

4)将蛋白样品进行转膜处理。本课题中所有Western Blot实验均使用PVDF膜，在转膜仪上按顺序排放：三层滤纸，PVDF膜，胶，三层滤纸。设置转膜电流为1mA，转膜时间为1h。

5)封闭。转膜完成的PVDF膜浸入含有5％BSA的封闭液中，室温孵育1h，以去除非特异性吸附的影响。

6)一抗孵育。按照需求配制不同抗体的稀释液，之后4度孵育过夜，以达到抗体识别特定抗原的目的。

7)二抗孵育。根据不同一抗的来源种属配制具有种属特异性的HRP标记的二抗(抗鼠或抗兔)，1:2000稀释。之后室温孵育1h。

8)显色。配制显色液，浸润二抗孵育完全的PVDF膜，使用化学发光仪进行显色分析。

结果如图6所示，表明DSARTC药物以剂量依赖性诱导AR以及AR-V7的降解。

实施例6：DSARTC对于前列腺癌动物模型的抑制肿瘤生长的作用效果

为了评价DSARTC对于前列腺癌动物模型的抑制肿瘤生长的作用效果药物在体内的治疗效果，建立了皮下移植前列腺癌小鼠模型，CW22Rv1细胞(2×10

肿瘤体积(V)＝1/2×长×宽2

2.HE(HEMATOXYLIN-EOSIN STAINING)染色方法

1)组织固定。

将取下的新鲜组织，放入预先配好的10％福尔马林的固定液中，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2)组织脱水。

将固定之后的组织修剪为25px×25px×5px，纯水冲洗去掉组织中的固定液。之后将组织按照低浓度至高浓度，逐渐将组织内水份替换为酒精。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

3)组织包埋。

将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后，静止冷却凝固成块即成。

4)组织切片。

将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5～8μm厚。

5)切片染色。

组织染色前，需用二甲苯重新脱去切片中的石蜡，之后经由高浓度到低浓度酒精，最后浸入纯水中脱去酒精。之后开始染色，将切片置于苏木精水溶液中染色10min。再将切片酸水及氨水中分色，各数秒钟即可。纯水冲洗之后，放入70％和90％酒精中脱水各10min后，将切片入酒精伊红染色液染色2min。

6)切片再脱水。

按照上述组织脱水的方式将染色后的切片再重新脱水。

7)封片。

将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封片。之后显微镜观察并拍照。

3.免疫组化Ki67和PAK4染色实验方法

1)免疫组织化学PBS试剂配方及配制方法

以下配方以配制1000mL免疫组织染色无钾PBS缓冲液0.01M，pH＝7.4所需试剂为例：

2)免疫组织化学抗原修复液配方及配制方法

以下配方以配制1000mL免疫组织染色抗原修复液0.01M，pH＝6.0的枸橼酸缓冲液所需试剂为例：

枸橼酸三钠·2H

枸橼酸·H

ddH

3)梯度酒精配制(100mL)

4)组织固定，切片及烤片

组织固定和切片同上述HE染色固定及切片方法，之后将组织切片放置于烤箱内，60℃烘烤2h。

5)脱蜡

将切片从烤箱内取出，立即依次放入二甲苯中进行脱蜡处理：

二甲苯Ⅰ8min

二甲苯Ⅱ 8min

二甲苯Ⅲ 8min

3)酒精梯度水化

将切片从二甲苯Ⅲ中取出，立即依次放入梯度酒精中进行水化处理：

6)PBS冲洗

将切片从50％酒精中取出，立即放入PBS中进行酒精冲洗处理，冲洗3次，每次3min。

7)抗原修复

将切片从PBS中拿出放入盛有0.01M，pH＝6.0的枸橼酸缓冲液的组化片盒内，再将组化片盒放入数控热抗原修复仪器中，121℃5min进行抗原修复。抗原修复结束后，自然降压，之后取出组化片盒自然冷却至室温。

8)PBS冲洗

将切片从枸橼酸缓冲液中取出，立即放入PBS中进行枸橼酸缓冲液冲洗处理，冲洗3次，每次3min。

9)细胞打孔

将切片放入2％ TritonX-100中进行细胞打孔处理。用滤纸擦干组织芯片周围的PBS缓冲液，再用组画笔勾画出组织切片外边。用移液器吸取1mL 2％TritonX-100覆盖整个组织芯片上的组织，室温静止放置10min。

10)PBS冲洗

将切片放入PBS中进行内源过氧化物酶冲洗处理，冲洗3次，每次3min。

11)内源过氧化物酶阻断

将切片从PBS中取出，用滤纸擦干组织切片周围的PBS缓冲液，再用组画笔勾画出组织芯片外边。用移液器吸取1mL非特异性阻断剂覆盖整个组织芯片上的组织，室温静止放置30min。

12)PBS冲洗

将切片放入PBS中进行非特异性阻断剂冲洗处理，冲洗3次，每次3min。

13)一抗孵育

根据抗体说明书，用一抗稀释液稀释一抗至合适的浓度。将切片从PBS中取出，用滤纸擦干切片周围的PBS缓冲液，再用组画笔勾画出切片外边。用移液器吸取1mL配置好的一抗溶液覆盖整个组织芯片上的组织，并设置一抗稀释液为阴性对照(即一抗稀释液中不加一抗)。将加好一抗的切片放入组化湿盒内，置放于4℃医用冰箱，静止过夜。

14)复温

将组化湿盒从4℃医用冰箱取出，室温放置1h。

15)PBS冲洗

将切片放入PBS中进行一抗溶液冲洗处理，冲洗3次，每次3min。

16)二抗孵育

将切片从PBS中取出，用滤纸擦干组织芯片周围的PBS缓冲液，再用组画笔勾画出组织芯片外边。用移液器吸取二抗溶液覆盖整个切片上的组织，将加好二抗的切片放入组化湿盒内，室温放置1h。

17)PBS冲洗

将切片放入PBS中进行二抗溶液冲洗处理，冲洗3次，每次3min。

18)DAB显色

将切片从PBS中取出，用滤纸擦干切片周围的PBS缓冲液，再用组画笔勾画出切片外边。用移液器吸取1mL DAB染液(DAB:substrate buffer＝26μL:1000μL)覆盖整个切片，不同一抗显色时间不同，在显微镜下判断终止时间，放入去离子水中终止染色。

19)PBS冲洗

将切片放入PBS中进行DAB染色液冲洗处理，冲洗3次，每次3min。

20)复染

将切片从PBS中取出，用滤纸擦干切片周围的PBS缓冲液，再用组画笔勾画出切片外边。用移液器吸取1mL苏木素染液，室温静止5min，放入去离子水中终止染色。

21)PBS冲洗

将肾透明细胞癌组织芯片放入PBS中进行苏木素染色冲洗处理，冲洗3次，每次3min。

22)盐酸分化

将切片从PBS中取出，用滤纸擦干切片周围的PBS缓冲液，再用组画笔勾画出切片外边。用移液器吸取1mL盐酸溶液，室温静止5s，放入去离子水中终止染色。

23)氨水返蓝

切片分化结束，立即放入1％氨水溶液，室温静止10s，放入去离子水中终止反应。

24)梯度酒精脱水和二甲苯透明

将肾透明细胞癌组织芯片依次放入梯度酒精和二甲苯溶液中进行脱水处理：

25)封片

将切片从二甲苯Ⅲ中取出，待二甲苯挥发后，向组织所在区域滴加中性树胶，用8cm×8cm盖玻片覆盖组织后置于通风柜中风干，之后显微镜观察并拍照。

结果如图8所示，表明双订书肽可以通过降解AR蛋白的途径有效抑制肿瘤在小鼠上的生长。

以上所有实施例表明，本发明采用双订书肽修饰策略，成功制备得到基于Ac-YLCSSNNNRERDKFRRTGGSGGTSFEQFWAWLWP-NH

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。