一种千金子的组培方法

技术领域

本发明属于千金子组培快繁技术领域，具体涉及一种千金子的组培方法。

背景技术

随着水稻轻简化栽培的应用以及干湿交替的稻田管理模式的推进，致使旱生喜湿的千金子(Leptochloa chinensis)在稻田迅速发展成为稻田主要恶性杂草，部分区域千金子危害严重，成为最优势杂草。稻田杂草抗药性研究结果表明全国稻田千金子抗药性发展迅猛，部分区域千金子对稻田主要除草剂氰氟草酯产生了75.8倍以上的抗药性。然而在进一步研究千金子抗药性作用机制时，却面临调查采样时收集的千金子抗性种群种子量少，且遗传背景混杂，需要通过植物组培技术大量快速获得遗传背景单一的千金子种质资源，以便进行后续研究。目前牛筋草(Eleusine indica)、狗尾草(Setaria viridis)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)等杂草已经建立起稳定的组培体系，然而千金子尚未有报道表明有组培体系。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，首次提出一种千金子的组培方法，为研究千金子抗药性、遗传背景等打下良好的基础。

本发明的目的是通下述方式实现的：

一种千金子的组培方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：以千金子的成熟胚为外植体进行消毒；

(2)愈伤组织的诱导和继代：将外植体接种在诱导培养基上黑暗培养诱导出胚性愈伤组织；

(3)愈伤组织的分化：将愈伤组织转入分化培养基上分化得到芽苗；

(4)生根：芽苗转到生根培养基上分化出根；

(5)形成完整植株后炼苗，移栽。

步骤(1)中成熟胚砂纸打磨去除颖壳后，用75％酒精消毒30s后，用4％次氯酸钠消毒10-15min，期间左右摇晃确保灭菌彻底，消毒完成后，用无菌水清洗4～6次后，置于无菌滤纸上，在超净台吹干备用。

步骤(2)将外植体接种在诱导培养基上；诱导培养基：4.43g/L M519+0.5～4mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，植物凝胶5g/L或琼脂8g/L，pH为5.8-5.9。

步骤(2)26-32℃黑暗培养。

步骤(2)9cm培养皿内50-200颗种子。

步骤(2)将诱导出的愈伤组织进行继代培养，条件同诱导处理，且18-25d需更换培养基，直至获得足量愈伤，愈伤继代不要超过4代。

由于千金子种子细小，可以用灭菌勺子均匀撒播。28℃黑暗培养7d后开始出愈伤，15d愈伤诱导率约为75％，30d出愈率高达90％，建议千金子愈伤继代不要超过4代，可保持良好的分化能力。

步骤(3)的分化培养基：M519 4.43g/L+6-BA 0.1～2.0mg/L+KT 0～0.5mg/L，+蔗糖30g/L+植物凝胶5g/L或琼脂8g/L，pH为5.8-5.9，28℃-32℃，12h光照/12h黑暗培养，光照强度为8000-20000Lx。5d后开始分化芽点，15d可以看见千金子幼苗雏形，分化率达到90％以上。

步骤(4)生根培养基：MS 4.43g/L+NAA 0～0.5mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶5g/L或琼脂8g/L，pH为5.8-5.9，28℃-32℃，12h光照/12h黑暗培养，光照强度为8000-20000Lx。

步骤(4)当芽长至1.0-2.0cm高时，转到生根培养基上分化出根，15d后形成完整植株。

步骤(5)开盖炼苗1-2d后移入营养土中，注意保湿。移栽成活率达到90％以上。

本发明首次提出千金子的组培体系，利用其成熟胚为外植体，使得外植体的获取简单易行且数量大，少量种子就能获得大量的愈伤组织。该体系操作简便、稳定性好、繁殖效率高的优点。

附图说明

图1为千金子种子诱导愈伤，0d(A)、10d(B)、20d(C)；

图2为愈伤组织分化10d和20d的图片；

图3为愈伤组织分化苗移入生根培养基5d(A)、20d(B)和移栽到盆栽(C)的图片。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明实施例中均是至少平行3次的试验结果。

实施例1：外植体消毒

千金子成熟胚砂纸打磨去除颖壳后，用75％酒精消毒30s后，用4％次氯酸钠消毒10-15min，期间左右摇晃确保灭菌彻底，消毒完成后，用无菌水清洗4～6次后，置于无菌滤纸上，在超净台吹干备用。

表1不同消毒方法对千金子愈伤诱导的影响

消毒后接入诱导培养基：4.43g/L M519+2mg/L 2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，pH为5.8-5.9，28℃黑暗培养；观察消毒效果。

实施例2：愈伤组织诱导和继代培养

将消毒好的外植体接种在诱导培养基上；诱导培养基：4.43g/L M519+2mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，pH为5.8-5.9，28℃黑暗培养；9cm培养皿内50-200颗种子。愈伤组织继代培养，条件同诱导处理，且20d左右需更换培养基，直至获得足量愈伤，愈伤继代不要超过4代。

千金子种子细小，可以用灭菌勺子均匀撒播。28℃黑暗培养7d后开始出愈伤，30d愈伤诱导率高达90％，千金子愈伤继代不要超过4代，可保持良好的分化能力。

表2不同诱导培养基配方

表3不同培养基诱导千金子愈伤的情况

上述表3中各培养基均添加2mg/L 2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，pH为5.8-5.9。

实施例3：分化培养

将诱导的愈伤组织接入分化培养基M519 4.43g/L+6-BA 0.1～2.0mg/L+KT 0～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.8-5.9，28℃，12h光照/12h黑暗培养，光照强度为16000Lx进行分化。结果见图2和表4。

表4不同激素对愈伤分化的影响

(注：表中数据为培养30天统计结果)

实施例4：生根培养基

将分化的苗接种到MS 4.43g/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.8-5.9，28℃，12h光照/12h黑暗培养，光照强度为16000Lx进行生根。15d后形成完整植株。生根率100％。

实施例5：移栽

开盖炼苗1-2d后移入营养土(如水稻营养土)中，注意保湿(湿度60％，温度30℃)。移栽成活率达到90％以上。