2-羟基-3-苯基丙酸在口气清新方面的应用和组合物

技术领域

本发明涉及2-羟基-3-苯基丙酸在口气清新方面的应用和包括该有机酸的组合物，涉及口腔健康技术领域。

背景技术

口臭是一个普遍关注的口腔健康问题，不仅影响个人的健康水平，也影响着人的心理和社会生活。经研究表明，部分益生菌及其后生元具备抑制口腔致病菌生长和免疫调节的功能，例如，副干酪乳杆菌L9和动物双歧杆菌A6可有效缓解牙龈出血、牙周炎症浸润和牙槽骨吸收，降低链球菌、梭杆菌、韦荣氏菌属等病原菌属的相对比例，从而进一步预防牙周炎；还有研究证明从婴儿肠道中提取出来的副干酪乳杆菌ET-22具有抑制变异链球菌生物膜的生长及细菌水溶性多糖和水不溶性多糖的合成的作用，能够进一步预防龋齿。

副干酪乳杆菌ET-22活菌及其后生元能够起到改善口臭的功效也已被证实，活菌能够黏附定植在口腔中并与口臭致病菌竞争黏附位置，从而进一步抑制致病菌的生长，起到改善口臭的作用。但是后生元不能黏附定植，其功效成分尚未可知。

发明内容

本发明提供2-羟基-3-苯基丙酸在口气清新方面的应用，其能够显著抑制特征性风味化合物的形成，降低关键挥发性气味化合物吲哚、丙酸、己酸的浓度；并且能够改变口腔菌群、抑制口腔生物膜形成和致病菌生长，具有清新口气和缓解抑制口臭的作用。

本发明还提供一种包括2-羟基-3-苯基丙酸的组合物。

本发明第一方面提供2-羟基-3-苯基丙酸在清新口气和/或缓解抑制口臭方面的应用。

本发明提供的2-羟基-3-苯基丙酸的结构如式1所示：

在一种具体实施方式中，所述2-羟基-3-苯基丙酸来源于副干酪乳杆菌ET-22的后生元。

副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15077。

后生元是指灭活微生物和/或微生物菌体成分，包含其发酵过程中产生的代谢物、分解发酵底物释放的活性小分子、死亡的细胞及裂解后的细胞组分。

本发明第二方面提供一种用于清新口气和/或缓解抑制口臭的组合物，包括2-羟基-3-苯基丙酸。

在一种具体实施方式中，在所述组合物中，所述2-羟基-3-苯基丙酸的含量不低于100μg/mL。

在一种具体实施方式中，所述组合物为食品组合物、医药组合物、口腔清洁组合物中的一种或多种。

在一种具体实施方式中，所述食品组合物包含乳制饮品、茶、咖啡、口香糖、洁牙糖、压片糖果、宠物用肉干中的一种或多种。

在一种具体实施方式中，所述口腔清洁组合物包括牙膏、洁牙粉、漱口水、口气清新喷雾、涂氟剂、假牙清洁剂、牙刷、牙间刷、牙线、口腔棉棒、宠物用洁牙胶、宠物用化毛膏、宠物用洁牙骨中的一种或多种。

在一种具体实施方式中，所述组合物还包括赋形剂、稀释剂、载体、添加剂中的一种或多种。

本发明第三方面提供2-羟基-3-苯基丙酸在降低口腔内特征性风味化合物含量方面的应用。

在一种具体实施方式中，所述特征性风味化合物包括吲哚、己酸、丙酸中的一种或多种。

本发明第四方面提供2-羟基-3-苯基丙酸在降低口腔内生物膜数量和厚度方面的应用。

本发明提供的2-羟基-3-苯基丙酸能够显著抑制特征性风味化合物的形成，降低关键挥发性气味化合物吲哚、丙酸、己酸的浓度；并且能够改变口腔菌群，尤其是降低生物膜数量和厚度，抑制口腔内生物膜形成和致病菌生长，具有清新口气和缓解抑制口臭的作用。

附图说明

图1为ET-22热灭活菌体的胞溶物中分离到的各有机酸在不同浓度下对VSC浓度的改善效果；

图2为2-羟基-3-苯基丙酸干预后挥发性有机化合物的组成；

图3为2-羟基-3-苯基丙酸干预后挥发性风味活性化合物的组成；

图4为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口腔内特征性风味活性化合物的含量变化图；

图5为2-羟基-3-苯基丙酸干预后生物膜的生物量的变化图；

图6a为未经干预的对照组生物膜的SEM图；

图6b为ET-22活菌干预后生物膜的SEM图；

图6c为ET-22热灭活菌干预后生物膜的SEM图；

图6d为2-羟基-3-苯基丙酸干预后生物膜的SEM图；

图7a为未经干预的对照组生物膜的CLSM图；

图7b为ET-22活菌干预后生物膜的CLSM图；

图7c为ET-22热灭活菌干预后生物膜的CLSM图；

图7d为2-羟基-3-苯基丙酸干预后生物膜的CLSM图；

图8为2-羟基-3-苯基丙酸干预后生物膜厚度的变化图；

图9为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭致病菌的相对丰度变化图；

图10为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭毒力因子的相对比例变化图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1ET-22后生元中有机酸的提取、分离和鉴定

1.1菌株培养

副干酪乳杆菌ET-22菌株购自中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCCNo.15077，使用MRS培养基，在37℃培养箱中培养12小时复苏，之后进行稀释倒板于MRS固体培养基中，37℃培养48小时，挑取单菌落于MRS培养基37℃培养12小时后，进行形态学及染色检查为纯培养物，之后连续传代2次，取第三代菌液为实验用，并进行稀释倒板计数。

MRS培养基：10g/L蛋白胨、5g/L牛肉粉、4g/L酵母粉、2g/L葡萄糖、1ml/L吐温80、2g/L磷酸氢二钾、5g/L乙酸钠、2g/L柠檬酸三铵、0.2g/L硫酸镁、0.05g/L硫酸锰、蒸馏水。

1.2后生元组分的制备

将1.1中复苏好的菌液离心10分钟，转速为4500r/分钟，将沉淀用无菌水重复洗涤3次，并重悬于无菌水中，之后100℃灭菌10分钟，再将菌液10000r/分钟高速离心10分钟，取沉淀为热灭活菌体，将上清再用0.22μm的无菌滤膜进行过滤，过滤后的液体为胞溶物上清。

1.3样本制备

将上述胞溶物上清冷冻干燥后，复溶于1.5mL的无菌水中。吸取100μL液体样本于1.5mL离心管中，加入400μL提取液(乙腈：甲醇＝1：1)，涡旋混匀30s后，低温超声提取30min(5℃，40KHz)，将样品静置于-20℃，30min，4℃，13000g离心15min，移取上清液，氮气吹干，100μL复溶液(乙腈：水＝1：1)复溶，低温超声萃取5min(5℃，40KHz)，4℃，13000g离心5min，移取上清液至带内插管的进样小瓶中上机分析。

LC-MS/MS分析：LC-MS分析的仪器平台为赛默飞公司的超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC-Q Exactive HF-X系统。色谱条件：2μL样本经HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm)分离后进入质谱检测。流动相A为95％水+5％572乙腈(含0.1％甲酸)，流动相B为47.5％乙腈+47.5％异丙醇+5％水(含0.1％甲酸)。分离梯度：0-3.5min，流动相B从0％升至24.5％，流速为0.40mL/min；3.5-5min，流动相B从24.5％升至65％，流速为0.4mL/min；5-5.5min，流动相B从65％升至100％，流速为0.4mL/min；5.5-7.4min，流动相B维持100％，流速从0.4mL/min升至0.6mL/min；7.4-7.6min，流动相B从100％降至51.5％，流速为0.6mL/min；7.6-7.8min，流动相B从51.5％降至0％，流速从0.6mL/min降至0.5mL/min；7.8-9min，流动相B维持0％，流速从0.5mL/min降至0.4mL/min；9-10min，流动相B维持0％，流速为0.4mL/min。柱温为40℃。

质谱条件：样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质量扫描范围为70-1050m/z。鞘气流速为50psi，辅助气流速为13psi，辅助气加热温度为425℃，正模式离子喷雾电压设置为3500V，负模式离子喷雾电压设置为-3500V，离子传输管温度为325℃，归一化的碰撞能为20-40-60V循环碰撞能。一级质谱分辨率60000，二级质谱分辨率7500，采用DDA模式采集数据。

通过非靶代谢组学LC-MS测定出副干酪乳杆菌ET-22胞溶物中小分子活性物质的组成，发现其主要是由多肽、有机酸和核苷酸三类组成。其中，有机酸包括：2-羟基-3-苯基丙酸、2-羟基丁二酸、3-氨基戊二酸、2-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸、6-羟基己酸和九碳二酸。

实施例2五种有机酸对口臭效果的验证

取10名口臭受试者(Halimeter指数>120)的新鲜唾液，受试者被要求在捐献唾液前2小时不食用任何食物或饮料，并将唾液直接吐入唾液采集管中，每人采集5ml的唾液，并将其混合，4500rpm，离心10分钟后取上清，分装存放于-80℃用于后续实验研究。

(一)Halimeter体外测定五种有机酸对VSC浓度的影响

在10ml的样品瓶中，首先加入唾液100μl，随后分别添加ET-22活菌(1.0×10

1.8ml的SHI培养基，充入氮气后厌氧培养10小时，之后放入60℃的水浴锅孵育30分钟，然后用Halimeter体外测定方法测定VSC浓度。

SHI培养基：10g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白酶蛋白栋、5g/L酵母提取物、2.5g/L氯化钾、5mg/L氯化血红素、1mg/L维生素K、0.06g/L尿素、0.174g/L精氨酸、2.5g/L猪胃粘蛋白、5％无菌脱纤维绵羊血、10mg/L N-乙酰胞壁酸、1％蔗糖、蒸馏水。

测定结果图1所示，三个浓度的有机酸组分干预下，高浓度的2-羟基-3-苯基丙酸组相比对照组VSC浓度显著降低(p<0.05)；中浓度干预时，2-羟基-3-苯基丙酸组相比对照组VSC浓度显著降低(p<0.05)；低浓度干预时，各组分与对照组相比都无显著变化。因此确定2-羟基-3-苯基丙酸为核心活性成分，进行后续试验。

(二)2-羟基-3-苯基丙酸对VOCs的影响

2.1在顶空瓶中，首先加入唾液100μl，随后分别添加ET-22活菌(1.0×10

氦气作为载气，速率保持在1.1mL min

本实施例中共检测到了241种挥发性有机化合物(VOCs)，其中烷烃类51个、酯类60个、醇类27个、酸类20个、酮类19个、烯类20个、醛类9个、酚类7个、其他种类28个。通过图2显示2-羟基-3-苯基丙酸干预后各类化合物的数量变化，使用ET22-L表示活菌干预组，ET22-HK表示热灭活菌干预组，根据图2可知，2-羟基-3-苯基丙酸干预后烷烃类化合物显著减少(p<0.01)，经研究表明，烷烃类化合物是细菌脂肪酸途径代谢和分解的产物，烷烃类物质与微生物的产生息息相关。

在241种VOCs中，有71种VOCs被鉴定为香气活性VOCs，被分为6类(酯类、醇类、酸类、酮类、酚类和其他化合物)，本实施例进一步检测了2-羟基-3-苯基丙酸干预下这71种香气活性VOCs的含量变化，检测结果如图3所示，经2-羟基-3-苯基丙酸干预后的风味活性酯类化合物和酸类化合物的数量也显著降低(p<0.05)。

2.2 2-羟基-3-苯基丙酸对特征性风味化合物的影响

由于引起口腔异味的原因不止VSCs，吲哚、短链脂肪酸(丙酸、丁酸等)都可能是引起口腔异味的原因，吲哚(Indole)是带有难闻气味的化合物，己酸(Hexanoic acid)是一种带有酸臭奶酪气味的化合物，丙酸(Propanoic acid)已被证明会引起口臭，它也是一种带有酸臭奶酪味的化合物。因此，本实施例测试了2-羟基-3-苯基丙酸对Indole(吲哚)、己酸(Hexanoic acid)和丙酸(Propanoic acid)的影响。

测试结果如图4所示，图4中，A为2-羟基-3-苯基丙酸对吲哚浓度的影响，B为2-羟基-3-苯基丙酸对丙酸浓度的影响，C为2-羟基-3-苯基丙酸对己酸浓度的影响，可以看出，ET-22活菌、热灭活菌和2-羟基-3-苯基丙酸干预下，吲哚、己酸和丙酸的浓度均显著降低(p<0.01)，且2-羟基-3-苯基丙酸的抑制效果优于ET-22活菌及热灭活菌。

(三)2-羟基-3-苯基丙酸对多物种生物膜生物量的影响

通过评估ET-22活菌、热灭活菌体和2-羟基-3-苯基丙酸干预下的生物膜形成情况，来分析生物膜生物量与口臭程度之间的关联。测试方法包括：

(1)取唾液10μl加入96孔板中，随后分别添加ET-22活菌(1.0×10

(2)用枪头轻微吸干净上清，再用无菌PBS缓冲液清洗1-2次。

(3)添加100μl 0.5％的结晶紫染料于孔板中，室温放置20分钟。

(4)将染料吸取干净后，用无菌PBS缓冲液清洗3次以上，直到将染料冲洗干净。

(5)将孔板放置酶标仪中，600nm测试生物膜生物量。

测定结果如图5所示，CK组生物膜的光密度读数最高，与CK组相比较，ET22-L、ET22-HK、2-羟基-3-苯基丙酸干预后生物膜的生物量有所下降，2-羟基-3-苯基丙酸组相较CK组生物量显著降低(p<0.05)，且干预效果优于ET-22活菌和热灭活菌。

(四)通过扫描电镜观察ET-22活菌、热灭活菌以及2-羟基-3-苯基丙酸对生物膜的影响。

观察方法包括：

(1)将96孔板里放入羟基磷灰石(HA)圆盘，取唾液10μl放入96孔板中，随后分别添加ET-22活菌(1.0×10

(2)用无菌PBS缓冲液轻微冲洗HA圆盘表面浮游的细菌。

(3)向孔板里添加2.5％戊二醛溶液固定，并4℃放置过夜。

(4)将固定后的样本进行梯度脱水，依次放入浓度为30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙醇溶液，每个浓度静置15分钟。

(5)临界点干燥喷金，置于扫描电子显微镜下观察。

观察结果如图6a-6d所示，CK组的生物膜结构致密，杆状及球状各种形态的细菌层层叠叠的交织在一起，菌体层数较多，且菌量较大；而ET-22.L组的生物膜杆状细菌的数量增多，菌体层数变少，生物膜变薄；ET-22.HK组的生物膜与ET-22.L组相似，不同的是细菌形态多数以短杆和球菌为主，且几乎没有胞外基质的产生；2-羟基-3-苯基丙酸组的生物膜结构出现了大量的粘液状结构，并且胞外基质的数量明显减少，菌体层数变少，生物膜变薄。

(五)通过共聚焦显微镜(CLSM)观察ET-22活菌、热灭活菌以及2-羟基-3-苯基丙酸对生物膜厚度的影响。

观察方法包括：

(1)将96孔板里放入HA圆盘，取唾液10μl放入96孔板中，随后分别添加ET-22活菌(1.0×10

(2)用0.85％的NaCl溶液轻微冲洗HA圆盘表面浮游的细菌。

(3)选用活细菌/死细菌染色试剂盒进行646染色，先添加100μlN01染色液A，室温避光孵育15分钟，用0.85％的NaCl溶液清洗一次圆盘表面后，再添加PI染色液B，室温避光孵育15分钟，之后再用0.85％的Nacl溶液清洗一次圆盘表面。

(4)将染色的圆盘倒置放置在载玻片上，用×60倍油镜进行共聚焦显微镜观察。

(5)实验结果用ZEN Lite2012软件进行拍照及作图。

观察结果如图7a-7d所示，之后在HA圆盘上测量不同位置的生物膜厚度，并绘制得到图8所示的柱状图。

根据图7a-7d以及图8可知，与CK组相比，ET-22活菌、ET-22热灭活菌、2-羟基-3-苯基丙酸均能显著降低生物膜的厚度(p<0.0001)，且2-羟基-3-苯基丙酸的干预效果优于ET-22活菌和热灭活菌体。

(六)构建口腔生物膜体外模型，探究2-羟基-3-苯基丙酸对生物膜的影响。

6.1口腔生物膜体外模型的构建：

将唾液取100μl加入24孔板中，然后实验组分别添加100μl相应浓度的溶液，最后再加入800μl的SHI培养基，将其放入厌氧盒中，37℃厌氧培养10小时，之后弃上清，黏附在孔板中的为多物种生物膜。将上述孵育好的生物膜弃去上清之后，用无菌水将黏附在孔板底部的生物膜吹吸重悬，并转移至1.5ml离心管，保存直至将样品进行基因测序。

6.2 2-羟基-3-苯基丙酸对多物种生物膜中口臭致病菌的作用

根据测序结果，对生物膜中的口臭致病菌进行鉴定，共鉴定出四种关键口臭致病菌，分别是具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、变异链球菌(Streptococcus.mutans)、中间普世菌(Prevotella intermedia)和莫雷梭菌(Solobacterium moorei)，这四种菌都已被证明与VSC浓度呈正相关关系，中间普世菌(Prevotella intermedia)是牙周病原菌，它和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)还被证明能够通过色氨酸代谢途径产生吲哚。因此，本实施例采用2-羟基-3-苯基丙酸对生物膜中口臭致病菌进行干预，评判干预后致病菌的相对丰度变化。

分析结果如图9所示，图9中，A为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭致病菌Prevotella.intermedia的相对丰度的变化图，B为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭致病菌Streptococcus.mutans的相对丰度的变化图，C为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭致病菌Fusobacterium.nucleatum的相对丰度的变化图，D为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭致病菌Solobacterium.moorei的相对丰度的变化图。

根据图9可知，2-羟基-3-苯基丙酸能够显著抑制Solobacterium.moorei的生长(p<0.05)，且抑制效果优于ET-22活菌或热灭活菌体。

6.3 2-羟基-3-苯基丙酸多物种生物膜中毒力因子的影响

本实施例评价2-羟基-3-苯基丙酸对口臭毒力因子的影响，毒力因子包括cdl、fadA、mgl和gtfb。基因cdl可以调控L-半胱氨酸脱氢酶的表达，而L-半胱氨酸脱氢酶可以催化蛋白质底物降解产生VSC，进而造成口臭；Fusobacterium.nucleatum通过fap2样自身转运蛋白分泌具有淀粉样性质的黏附素，以增强其毒性；黏附素在Fusobacterium.nucleatum的致病性中起关键作用，fadA是指编码该黏附素的mRNA；L-蛋氨酸-α-脱氨基-γ-巯基甲烷裂解酶(METase)能够从L-蛋氨酸产生α-酮丁酸、氨和CH

试验方法包括：

(1)提取生物膜细菌RNA生物膜细菌的RNA提取方法参考采用TIANGEN的RNAprepPure培养细菌/细胞总RNA提取试剂盒操作。

(2)反转录

反转录体系如表1所示，在冰浴的PCR管中加入以下试剂：

表1RNA反转录cDNA体系

在PCR仪上按照表2的条件进行反转录反应：

表2PCR反应程序

(3)RT-PCR检测

样本RNA反转录成cDNA后，进行RT-PCR反应生物膜相关毒力因子的检验，其引物序列如表3所示，实验结果结算用2

表3生物膜相关毒力因子RT-PCR引物序列

分析结果如图10所示，图10中，A为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭毒力因子cdl的相对比例变化图，B为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭毒力因子fadA的相对比例的变化图，C为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭毒力因子mgl的相对比例的变化图，D为2-羟基-3-苯基丙酸干预后口臭毒力因子gtfb的相对比例的变化图。

根据图10可知，2-羟基-3-苯基丙酸能够对四种口臭毒力因子起到显著调节作用(p<0.05)，且对毒力因子fadA的抑制效果优于ET22-L和ET22-HK。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。