SHLP-1在制备缓解与治疗神经病理性疼痛药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及到SHLP-1在制备缓解与治疗神经病理性疼痛药物中的用途。

背景技术

神经病理性疼痛(neuropathicpain，神经痛)是由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛，其临床表现为自发性疼痛、痛觉过敏、触诱发痛等，在普通人群中发病率为6.9-10％，占慢性疼痛的21.7％，而中、重度慢性疼痛患者中约有74.1％为神经痛，是全球疼痛疾病负担的重要组成部分。国际疼痛研究协会(IASP)推荐的一线治疗药物，包括钙离子通道调节剂(普瑞巴林和加巴喷丁)、三环类抗抑郁药和去甲肾上腺素再摄取抑制剂等在许多中、重度病人中疗效不佳。二线治疗药物如阿片类镇痛药，因为其长期服用引起的耐受、成瘾、呼吸抑制和胃肠反应等副作用，限制其在临床中的广泛应用。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的镇痛药物疗效不佳，且副作用较多、副作用大，因此，寻求新的疼痛调节靶点，对镇痛药物研发有着至关重要的意义。

目前，文献报道，线粒体16S rRNA编码了一条小肽SHLP-1，但其缓解与治疗神经病理性疼痛的功能并没有被发现。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供线粒体衍生肽SHLP-1在制备缓解和治疗疼痛药物中的应用，其特征在于：所述线粒体衍生肽SHLP-1的氨基酸序列为SEQID NO：1所示。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述疼痛为神经病理性疼痛。

本发明有益效果：

(1)本发明首次提出SHLP-1可以作为治疗神经痛的药物靶点，利用鞘内(10μg)或足底(10μg)注射SHLP-1在小鼠CCI、SNI神经痛模型及formalin疼痛模型中均可缓解疼痛；细胞分子机制研究发现SHLP-1缓解神经痛的机制：SHLP-1可能通过抑制神经痛小鼠脊髓背角神经元的激活，以达到缓解疼痛的目的；本发明为神经痛的治疗提供一条有别于传统镇痛的药物靶点。

(2)本发明从分子、细胞及整体水平揭示了线粒体起源肽SHLP-1在神经痛调控机制，能够为神经痛的治疗探寻有效的药物作用靶点提供新的思路；经实验表明，外源注射SHLP-1可以在多种神经痛小鼠模型中产生明显的镇痛作用；本发明的SHLP-1可以通过抑制神经痛小鼠脊髓背角神经元的激活，以达到缓解疼痛的目的。

(3)传统镇痛药物研究靶点多集中在内源性阿片肽或者花生四烯酸路径中COX-2等靶点。内源性阿片肽虽具有较好的镇痛作用，但其长期服用引起的耐受、成瘾、便秘及呼吸抑制等严重副作用，极大地限制了其在临床慢性神经痛中的应用。针对COX-2靶点开发的一系列候选药物仍然无法避免引起心血管和胃肠道不适等副作用。本发明提出的SHLP-1，通过抑制神经痛小鼠脊髓背角神经元的激活，以达到缓解神经痛的作用。本发明另辟蹊径提出SHLP-1，可能作为缓解、治疗神经病理性疼痛的新靶点，对今后此类疾病的药物开发及预防和/或治疗有非常重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1是本发明实施例提供鞘内注射SHLP-1在SNI神经痛模型小鼠中对机械痛的作用示意图。A为SNI模型构建后1d-14d内小鼠的机械痛阈值，B为鞘内注射多个剂量的SHLP-1在SNI模型上对机械痛敏的影响，C为SNI模型构建后1d-14d内小鼠的热痛阈值，D为鞘内注射多个剂量的SHLP-1在SNI模型上对热痛敏的影响；

图2是本发明实施例提供足底分别注射SHLP-1在SNI神经痛模型小鼠中对机械痛的作用示意图；

图3是本发明实施例提供鞘内分别注射SHLP-1在CCI神经痛模型小鼠中对机械痛的作用示意图；

图4是本发明实施例提供的鞘内注射或足底注射SHLP-1在小鼠formalin急性疼痛模型中的作用示意图；

图5是本发明实施例提供鞘内注射SHLP-1抑制脊髓背角神经元激活标志物c-fos的表达情况示意图；

图6是本发明实施例提供鞘内注射SHLP-1抑制脊髓背角小胶质细胞激活标志物iba1的表达情况示意图；

图7是本发明实施例提供鞘内注射SHLP-1抑制脊髓背角星型胶质细胞激活标志物GFAP的表达情况示意图。

图8是本发明实施例提供鞘内注射SHLP-1对脊髓背角炎症因子激活无影响的示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明实施例提供的SHLP-1是由线粒体基因组16S rRNA编码的一系列由24个氨基酸组成的长肽衍生肽，序列为:

SHLP-1(MCHWAGGASNTGDARGDVFGKQAG)。

本发明前期在SNI和CCI小鼠神经痛模型中通过鞘内注射SHLP-1发现其具有有效的镇痛作用，随后通过formalin疼痛模型进一步确定了SHLP-1的镇痛作用。

机制探讨发现，SHLP-1通过抑制脊髓背角神经元激活以达到缓解疼痛的作用。另外，据实验动物和临床实验报道表明，中枢神经系统中神经元的激活是引起神经痛的主要原因。因此，本发明预测SHLP-1参与了神经痛的调控，且可以作为治疗神经痛的药物靶点。

本发明实施例通过将SHLP-1通过中枢给药(鞘内注射：10μg)或局部给药(足底注射：10μg)在小鼠CCI、SNI神经痛模型及formalin疼痛模型中均可缓解疼痛。

进一步机制研究发现SHLP-1可能通过抑制脊髓背角神经元激活以达到缓解疼痛的作用。

实施例1

本发明实施例提供的验证SHLP-1在制备用于缓解和/或治疗疼痛的药物中的用途的方法，包括：

行为学检测SHLP-1在SNI/CCI神经痛小鼠模型或formalin疼痛模型中的作用：选取C57BL/6雄性小鼠，体重为20-25g，首先通过机械刺激痛预实验检测基础值，筛选基础值在1.0±0.2g的小鼠用于CCI、SNI神经痛模型的构建。

通过von-frey机械刺激痛实验检测了造模前和造模后第1天、第3天、第7天和第14天时小鼠的痛阈。

根据检测结果，选择在造模后第7天通过鞘内注射SHLP-1，检测对SNI神经痛模型小鼠机械痛域的影响。

结果发现SHLP-1可以显著缓解疼痛，这表明SHLP-1参与了神经痛的调控。

具体行为学实验如下：

SNI神经痛模型构建：选取C57BL/6雄性小鼠，体重为20-25g，首先通过机械刺激痛预实验检测基础值，筛选基础值在1.0±0.2g的小鼠用于SNI模型的构建。

具体方法为：通过戊巴比妥钠麻醉小鼠后，将左后腿剃毛，切开皮肤，钝性分离肌肉后可以看见坐骨神经主干及其三个分支：胫神经、腓总神经和腓肠神经，其中腓肠神经比较细小。SNI要求结扎并切断胫神经、腓总神经，保留并保证腓肠神经完好无损。

CCI神经痛模型构建：选取C57BL/6雄性小鼠，体重为20-25g，首先通过机械刺激痛预实验检测基础值，筛选基础值在1.0±0.2g的小鼠用于SNI模型的构建。具体方法为：通过戊巴比妥钠麻醉小鼠后，将左后腿剃毛，切开皮肤，钝性分离肌肉后可以看见坐骨神经主干及其三个分支：胫神经、腓总神经和腓肠神经，用6-0号缝合线结扎胫神经和腓总神经，结扎三次。

Formalin疼痛模型：本实验使用22±2g的雄性昆明系小鼠，保持室内安药，室内温度22±1℃。小鼠编号后置于观察盒内适应15min，给予不同浓度待测药物，5分钟后使用微量注射器于小鼠右后爪皮下(i.pl.)注射20μL 5％福尔马林溶液，立即把小鼠放回观察盒，分别记录0-5min(一相)和15-30min(二相)内舔、咬及甩后爪的累积时间。0.9％生理盐水作为阴性对照，吗啡作为阳性对照。实验结果以累积舔、咬及甩后爪时间表示。

小鼠机械痛阈检测：用VonFrey纤维丝以up-down方法推算缩足阈值：将小鼠置于底部为金属筛网的透明有机玻璃隔窗(22cm×12cm×22cm)中，待小鼠在其中适应至少15min后，用不同折力的VonFrey纤维丝垂直刺激小鼠后肢足底外侧，持续≤4s,小鼠出现迅速抬足或舔足行为视为阳性反应，否则视为阴性反应。测定首先从2.44(0.04g)纤维丝开始，如出现阴性反应，则给予相邻大一级的刺激；如出现阳性反应，则选用小一级力度的刺激，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测4次，大力度4.31(2g)为上限设置。每次刺激间隔至少为2min，根据up-down公式计算缩足反射阈值(pawwithdraw threshold,PWT)。

小鼠热辐射痛阈检测：保持测试期间安静的环境，室温在22～25℃，将小鼠置于距离桌面30cm高、底端覆盖玻璃板的行为架上，透明隔板将其分隔开。适应30分钟后，底部采用可移动热辐射，垂直照射小鼠后足，记录从接触热辐射到出现抬起后足或舔舐后足的时间。热辐射时间上限设置为20秒，防止小鼠足底部烫伤。每只小鼠记录3次，每次间隔至少5分钟，计算3次测量的平均值。

各组数据统计：采用SPSS19.0软件统计分析实验数据，多组比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，以平均值±标准误(Mean±SEM)表示，当P＜0.05时，认为有统计学意义。

(1)行为学实验表明SHLP1具有减缓神经病理性疼痛的作用

结果显示，在SNI、CCI神经痛模型小鼠中，模型构建的第7天，通过鞘内注射外源性SHLP-1(10μg)，随后通过Von Frey机械痛和热辐射痛等行为学实验方法检测给药后1小时的药效。

图1～3显示，鞘内注射SHLP-1可以显著缓解神经痛。这些数据共同表明，鞘内注射SHLP-1对神经病理性疼痛有治疗作用。

(2)行为学实验表明SHLP-1具有缓解formalin引起的急性痛的作用

结果图4～5显示，通过鞘内和足底两种方式注射SHLP-1，仅仅鞘内是可以显著缓解formalin引起的急性疼痛。

实施例2

通过多种分子生物学实验方法，进一步揭示SHLP-1缓解神经痛的机制：SHLP-1可能通过抑制脊髓背角神经元的激活，以达到缓解疼痛的目的。这部分机制通路的研究将为评估MOTS-c是否可以作为治疗神经痛的药物靶点提供了更明确的证据。

具体的分子生物学实验方法如下：

实时定量qPCR：上述实验结束后，将其CO

免疫荧光双标染色：行为学实验结束后，CO

各组数据统计：采用SPSS19.0软件统计分析实验数据，多组比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，以平均值±标准误(Mean±SEM)表示，当P＜0.05时，认为有统计学意义。

(1)SHLP-1抑制神经痛小鼠脊髓背角神经元的激活

已知突触可塑性介导的中枢敏化在神经痛的产生和维持过程中起到了重要调控作用，且神经元的敏化继发于脊髓背角，其表现为背角神经元的激活。

为了确定SHLP-1发挥镇痛作用的机制是否与减弱中枢敏化有关，行为学实验结束后，我们分别取对照组C57BL/6小鼠(假手术处理)和实验组C57BL/6小鼠(CCI神经痛模型构建处理)的脊髓组织膨大区进行免疫荧光实验检测。

免疫荧光图像显示，在鞘内注射SHLP-1后，实验组小鼠脊髓背角神经元激活的标记物c-fos的数量显著减少(图6)，而小胶质细胞和星形胶质细胞的激活不受影响(图7-8)。这些数据综合说明SHLP-1通过抑制神经痛小鼠脊髓背角神经元的激活，以达到缓解疼痛的目的。

神经痛在普通人群中发病率为6.9-10％，占慢性疼痛的21.7％，在中、重度慢性疼痛患者中约有74.1％为神经痛。钙离子通道调节剂(普瑞巴林和加巴喷丁)、三环类抗抑郁药和去甲肾上腺素再摄取抑制剂等是神经痛治疗的一线药物；但其在许多中、重度病人中疗效不佳；而二线治疗药物如阿片类镇痛药，因为其长期服用引起的耐受、成瘾、呼吸抑制和胃肠反应等副作用，限制其在临床中的广泛应用；本发明提出的线粒体衍生肽SHLP-1，在神经病理性疼痛中具有更好的缓解作用；因此，本发明提出的线粒体衍生肽这个新的疼痛调节靶点，对于神经痛，尤其是慢性神经痛类药物研发有着至关重要的意义。

本发明首次提出线粒体基因组编码的多肽SHLP-1在神经病理性疼痛中具有较好缓解作用，并给药后对肝肾功能，心肌酶谱及血脂血糖均无影响；本发明涉及SHLP-1缓解神经痛的机制研究，首次提出，SHLP-1通过抑制神经痛小鼠脊髓背角神经元的激活，以达到缓解疼痛的目的；本发明表明SHLP-1可以作为缓解、治疗神经病理性疼痛的靶点，对今后此类疾病的药物开发及预防和/或治疗有非常重要的意义。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。